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					                        Radioinmunoanálisis

Técnicas basadas en reacciones de competencia
1956 Yalow y Berson Metabolismo de la insulina
Ventajas:
• Reproducibilidad
• Exactitud
• Sensibilidad
• Analizar muestras de pequeños volúmenes
• Procesar grandes series
                         Principio general

Inhibición competitiva de la unión de un Ag radiactivo (trazador) a su
Ac específico por parte del Ag no marcado
Interacción reversible
                  Ag*               Ac-Ag*       Trazador altamente radiactivo

   Ac         +                                  Ac altamente específico

                  Ag                Ac-Ag
El proceso obedece a la ley de acción de masas
A mayor cantidad de Ag no marcado, menor cantidad de trazador unido
al anticuerpo.
Es necesario aplicar algún método que permita separar y medir el
trazador libre y el trazador unido
Para la ejecución de un RIA se efectúan dos ensayos fundamentales
1- Titulación del antisuero
2- Ensayo de desplazamiento o RIA propiamente dicho
Ensayo de titulación o curva de calibración
Ajuste empírico de la concentración de Acs específicos
Se elige aquella dilución que causa aproximadamente un 50% de
unión del Ag radiactivo
Ensayo de desplazamiento
Elaboración de una curva patrón Ac: dilución fija;
                                Ag frío: distintas diluciones

                       SP St M Ac I* Incub. Peg Inc
Totales (T)             0,2   --    --   --   0,1
                                                    37 °C
Inespecífico (b)        0,2   --    --   --   0,1     3     1
                                                    horas        10
                                                                min
Máxima unión (O) 0,1 --             --   0,1 0,1      o     1
                                                    4°C         4°C
Estándar                --    0,1   --   0,1 0,1            1
                                                     18
Muestra                 --    --    0,1 0,1 0,1     horas   1
Rectificación de la curva estándar Transformación logit-log




                                                       y
                                         Logit y = ln _____
                                                      1-y
                                         Para y = B/Bo
                                                           B/Bo
                                         Logit B/Bo = ln _________
                                                           1- B/Bo
                                El modelo básico
Restricciones o postulados
1- Tanto el Ag como el Ac son especies químicamente homogeneas y univalentes.
2- Ac altamente específico con una constante de afinidad alta.
3- La interacción Ag-Ac obedece a la ley de acción de masas, sin que existan otros
fenómenos alostéricos o cooperativos.
4- El trazador, libre de daño, con una adecuada actividad específica, conservando una
capacidad de unión similar al compuesto sin marcar.
5- Un estándar cuyo comportamiento inmunológico sea igual al de la sustancia a
medir.
6- La condición final considerada luego de la reacción Ac-Ag es la del equilibrio.
7- Reactivos cuidadosamente preparados y elegidos de manera de permitir una curva
de calibración óptima con pendiente y amplitud adecuada.
8- Las formas libre y unida del trazador son idealmente separables, sin perturbaciones
del equilibrio y finalmente son medibles con exactitud.
                    Ensayos en preequilibrio
Adición demorada del trazador
Ac + Ag frío     incubar hasta equilibrio + trazador    inc y separac
Aumento en la sensibilidad del ensayo.


RIAs con multicomponentes
• Mezclas de Acs de variada afinidad por el Ag (sueros inmunes y Ac
fraccionados monoespecíficos).
• Heterogeneidad del Ag (contaminación, reactividad cruzada,
inespecificidad)
                            Anticuerpos homogéneos




La diferencia se debe a las distintas afinidades.
El competidor A2 puede lograr el total desplazamiento del trazador a concentraciones
proporcionalmente mayores que las de A1
Esas características son propias de los llamados Ags con reactividad cruzada
verdadera o de tipo 1.
En los sistemas con Acs monoclonales es la única clase de inmunorreactividad
cruzada factible.
                        Anticuerpos heterogéneos




2 tipos de heterogeneidades:
1- Respecto de afinidades: Distinta afinidad. Es un caso de reactividad cruzada
de tipo 1. Sin embargo las curvas de desplazamiento no resultan paralelas.
2- Respecto de la especificidad: Heterogeneidad de especificidad para diferentes
determinantes. Reactividad cruzada tipo 2. El Ag 2 no podrá causar un
desplazamiento completo como el A1 a ningún valor de dosis.
                         RIA heterólogo

Suero anti- hormona folículoestimulante humana (FSH) da
reactividad cruzada con la gonadotrofina coriónica humana (hCG).
La absorción de los sueros con hCG no deja suficientes Acs de alta
afinidad y específicos para FSH.
Entonces se puede trabajar con:


FSH                           Tan específico y sensible
Anti FSH ovina                como un RIA homólogo
                              ideal
FSH*
 Ensayo de unión de radioligando RBA (Radiobinding assay)

Determinación de Acs específicos hacia un Ag macromolecular
soluble y bién caracterizado.
Ensayo en fase fluida
Sueros diluidos convenientemente + Ag* en dosis fija
           Equilibrio y separación con Peg 12,5%
Se emplea para el monitoreo de Acs en muy baja concentración ,
como los autoanticuerpos en las enfermedades autoinmunes contra
Ags bien caracterizados.
El RBA resulta más apropiado que los métodos enzimáticos
alternativos.
Ensayo de titulación (Diluciones del suero)
  RIAs en sistemas bifásicos (RIAs en fase sólida) (RIA-FS)


Ventajas:
                 Simplicidad
                 Rapidez
                 Omisión de etapa de separación
                 Ahorro de reactivos
                 Automatización

Desventajas:
                 Mayor consumo de antisuero
                 Variación en las propiedades adsortivas de
                 las sustancias
                          Requerimientos




• Acs específicos
Obtenidos en animales de experimentación (Vías, dosis, adyuvantes)
Hormonas proteicas 10-100 µg/dosis dan Acs de alta afinidad.
Se usan en diluciones 105 – 106
Pueden usarse Acs purificados y Acs monoclonales
Antígenos marcados
Se recomienda la adición de 10.000 cpm
Los radioisótopos más útiles para RIA son:
125I   radiación gamma
Se incorpora fácilmente a residuos tirosina e histidina
100% de pureza.
131I   15-30 % de pureza, el resto es 127I
El 131I junto con la radiación gamma produce una fuerte emisión
beta que causa un daño más rápido a los materiales biológicos.
El I se incorpora utilizando cloramina T (oxida al Iodo).
El I posee un volúmen semejante al del anillo bencénico.
Luego de la marcación es necesario purificar los antígenos
marcados (sephadex, columnas de adsorción de celulosa,
electroforesis, HPLC).
Otros: 75Se, 57Co, 59Fe, 3H
Patrones de Antígeno frío


Los antígenos usados como estándares deben ser
inmunoquímicamente idénticos a los de las muestras
desconocidas.
Deben usarse proteínas inertes o detergentes no iónicos para
prevenir la adsorción de los antígenos, que están en altas
diluciones (20 ng/ml – 1 µg/ml), a los recipientes y tubos de
vidrio o plástico.
Técnicas separativas

				
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