RETINOBLASTOMA by dandanhuanghuang

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									RETINOBLASTOMA
       RETINOBLASTOMA

E’ una rara neoplasia embrionale della
 retina
Insorge in età infantile (0-3 anni)
Ha una frequenza di 1:18000-30000 nati
 vivi
       RETINOBLASTOMA




Sintomi:
 Leucocoria: presenza di una massa bianca
  all’interno dell’occhio
 Glaucoma, strabismo, dilatazione della pupilla
        RETINOBLASTOMA
Diagnosi
Esame del fondo oculare
Ecografia
RM, TC
Retcam 120


N.B. : una diagnosi precoce ed una terapia
  tempestiva sono essenziali per un outcome
  ottimale!
          RETINOBLASTOMA
Terapia
Ha come obiettivo la cura della malattia
 cercando di preservare il più possibile la
 vista.

In rapporto alla grandezza del tumore si
  distinguono trattamenti locali e trattamenti
  invasivi.
          RETINOBLASTOMA
 Trattamenti locali         Trattamenti invasivi
 Chemioterapia +           enucleazione (per
   trattamento laser          tumori molto grandi)
 Chemioterapia +
   criocoagulazione



La chemioterapia si effettua con farmaci e serve ad
inibire la crescita delle cellule tumorali.
              RETINOBLASTOMA
Nel 1971 Alfred Knudson propose un
   modello per spiegare l’origine
   delle forme sporadiche(60%) ed
   ereditarie(40%) di retinoblastoma:
   IPOTESI “TWO HITS”
Il “ retinoblastoma è un cancro
    causato da due eventi
    mutazionali…
… una mutazione è ereditata
    per via germinale, mentre la
    seconda avviene nelle cellule
    somatiche. Nella forma non
    ereditaria entrambe le
    mutazioni avvengono nelle
    cellule somatiche”
        RETINOBLASTOMA
Bisogna precisare che…

Affinchè si sviluppi il tumore entrambi gli
 alleli devono essere inattivati

La patologia si manifesta quando si
 verifica LOH (nel tessuto tumorale i pz
 risultano Hz per la mutazione)
         RETINOBLASTOMA
Il gene Rb
È localizzato sul
   cromosoma 13
Appartiene alla
   famiglia degli
   oncosoppressori
Codifica per una
   fosfoproteina
   nucleare pRb
   implicata nella
   transizione G1—›S
   del ciclo cellulare
          RETINOBLASTOMA
La fosforilazione di pRb promuove la
  replicazione della cellula




 Nelle forme mutate di pRb il fattore di trascrizione E2F
è sempre libero, pertanto il ciclo cellulare è continuo .
Si ha una proliferazione incontrollata.
              RETINOBLASTOMA
In una cellula a riposo in fase G0 o G1 precoce, le molecole
    di pRb ipofosforilate si legano al fattore di trascrizione
    E2F.
pRb recluta la deacetilasi istonica che crea compattamento
    della cromatina, rendendo il DNA meno accessibile.
    Quando le cellule in stato di quiescenza sono stimolate
    con fattori di crescita aumenta la concentrazione di
    ciclinaD e di ciclinaE.
 Il complesso ciclinaD/cdk4 fosforila pro: ciò porta alla
    rimozione dell’ pistone deacetilasi permettendo la
    trascrizione dei geni bersaglio di E2F, quali ciclinaE,
    DNA polimerasi essenziali per la progressione in fase S.
        RETINOBLASTOMA
…altre proteine coinvolte nel ciclo cellulare
 p53: attiva la riparazione del DNA
 danneggiato;
 dà inizio all’apoptosi in caso di danno
 irreparabile al DNA
 p107: membro della famiglia Rb;
  Interviene nel controllo della progressione del
  ciclo cellulare e nel differenziazione tissutale
          RETINOBLASTOMA
…la proteina RB e l’instabilità genetica…

E’ stato osservato che in cellule deficienti di p53
  aumenta l’ incidenza di:

   aneuploidie
   riarrangiamenti cromosomici
   amplificazione genica
   amplificazione dei centrosomi
           RETINOBLASTOMA
Come p53, la proteina Rb sembra avere un ruolo
   importante nella fase G2 – M e nel mantenimento della
   stabilità cromosomica.
Si è arrivati a questa conclusione osservando che:
 La forma defosforilata di pRB interagisce con la proteina
   fosfatasi 1 α, necessaria per la corretta segregazione dei
   cromosomi,durante la fase G2-M
 La forma fosforilata di pRB in fase G1-S regola le cicline
   che inducono mitosi e degradazione in fase G2-M
 Se cellule trattate con agenti destabilizzanti i microtubuli,
   perdono la forma funzionale di pRB, non completano
   correttamente la mitosi e mostrano aneuploidie
    EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
        GENETIC INSTABILITY

Al fine di testare l’istabilità genetica in cellule di
   mammifero,è stato sviluppato un metodo che utilizza un
   vettore retrovirale il quale integra casualmente nel
   genoma delle cellule infettate un marker selezionabile




               LTR        Hyg-TK     LTR


 Hyg: hygromycin phosphotransferase
 TK: timidine kinase
EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
    GENETIC INSTABILITY
La traduzione di questo gene di fusione in
  un’enzima bifunzionale conferisce alla
  cellula sia resistenza all’Hyg, che
  sensibilità al ganciclovir.
Ciò permette di operare sia una selezione
  positiva che negativa
Hyg igromicinaselezione positiva

TK   ganciclovir   selezione negativa
EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
    GENETIC INSTABILITY
Sono state infettate cellule ES di topo,
 aventi genotipo Rb+/+,Rb+/- ,Rb-/ - .
Le cellule sono state isolate da blastocisti di
 embrioni dello stesso ceppo ottenuti
 dall’incrocio di topi Rb+/- x Rb+/- .
N.B. Si usano cellule ES per la loro alta
 efficienza nel generare colonie.
      EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
          GENETIC INSTABILITY

    1. Dopo l’infezione, le cellule ES vengono
        messe a contatto con 250 µg/ml di hyg.
                                                              Ganciclovir –     Ganciclovir-
                                                              resistent         resistent
   LTR                  Hyg-TK        LTR
                                                    Negative colony             colony number
                                                    selection number Eo         Ep
                                       Individual                                    Negative
                                                       107                    107    selection
            Positive                   clones
            selection   Hygromyci                      cells                  cells
Viral
                        n resistent                      No
infection
                        clones                           selection
                                        Mixture          Propagate for
                                        of clones        N generation
EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
    GENETIC INSTABILITY
2. Vengono prelevate 50 colonie tra quelle
    resistenti all’hyg e mixate tra loro.

Di queste:
 107 cells vengono rimosse dal medium
    contenente hyg e piastrate in uno
    contenente ganciclovir
      EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
          GENETIC INSTABILITY
  Le colonie resistenti al ganciclovir sono
  contate e denominate Eo

                                                          Ganciclovir –     Ganciclovir-
                                                          resistent         resistent
   LTR             Hyg-TK         LTR
                                                Negative colony             colony number
                                                selection number Eo         Ep
                                   Individual                                    Negative
                                                   107                    107    selection
Viral     Positive                 clones
                    Hygromyci                      cells                  cells
infection selection
                    n resistent                      No
                    clones                           selection
                                    Mixture          Propagate for
                                    of clones        N generation
EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
    GENETIC INSTABILITY
Le rimanenti cellule delle 50 colonie di
 partenza vengono propagate per ~ 10
 generazioni in un terreno non
 selettivo(selection free medium).
Delle cellule propagate se ne prendono ~
 107 e si mettono in un medium contenente
 ganciclovir
      EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
          GENETIC INSTABILITY
    Le colonie resistenti al ganciclovir sono
      contate e denominate Ep

                                                          Ganciclovir –     Ganciclovir-
                                                          resistent         resistent
   LTR             Hyg-TK         LTR
                                                Negative colony             colony number
                                                selection number Eo         Ep
                                   Individual
                                                   107                    107     Negative
Viral     Positive                 clones                                         selection
                    Hygromyci                      cells                  cells
infection selection
                    n resistent                      No
                    clones                           selection
                                    Mixture          Propagate for
                                    of clones        N generation
  EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
      GENETIC INSTABILITY
3. A questo punto per calcolare il numero di
  LOMs (frequenza di perdita del marcatore)



Feq LOMs = EP – EO /N x 107
 EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
     GENETIC INSTABILITY
Dall’analisi dei dati ottenuti si evince che :
Feq     Rb-|-   Rb+/-   Rb +/+
LOM
<10-8   2       7       20
                                 Le cellule Rb -/- hanno
-10-8   o       4       1
                                 una feqLOM
-10-7   1       6       0
                                 significativamente
-10-6   7       4       1
                                 maggiore rispetto a
-10-5   11      4       0
                                 quelle wt.
-10-4   6       0       0
-10-3   4       0       0
TOTAL   31      25      22
 EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
     GENETIC INSTABILITY
Per capire il meccanismo che porta alla perdita di
  funzione di TK in cell. Rb -/- , esaminiamo lo
  stato del gene di fusione Hyg-TK nelle cellule
  resistenti al ganciclovir tramite PCR.
                      La PCR non è in grado di amplificare i
                      frammenti del gene di fusione.
                      Questo indica che:
                       ~ il 90% delle colonie resistenti al
                      ganciclovir hanno subito una delezione
                      dell’intero gene
                       mutazioni puntiformi e piccole
                      delezioni sono poco frequenti
EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
    GENETIC INSTABILITY
Conclusioni :
l’incremento della feqLOM in cell. Rb -/- ,
   suggerisce che il deficit di Rb comporta
   instabilità cromosomica
In cell. Rb+/- il solo allele funzionante non
   basta a mantenere il genoma stabile
L’ instabilità genetica può essere
   responsabile di alterazioni nel genoma che
   portano allo sviluppo del cancro
 EXPERIMENTAL MODELS TO TEST
     GENETIC INSTABILITY
 Mutazioni in uno solo degli alleli Rb non è
  sufficiente ad indurre lo sviluppo di
  retinoblastoma nell’uomo, nonostante la
  patologia presenti ereditarietà autosomica
  dominante.
 La presenza di un solo allele Rb funzionante,
  porta ad instabilità genetica, la quale aumenta la
  probabilità di mutazione a carico dell’allele wt



         INSORGENZA DI TUMORE
        MODELLI ANIMALI
IL TOPO perché…

 Il gene Rb è altamente conservato
 Il gene Rb ha un elevato grado di omologia con
 Rb umano
 Identità pRb murina/pRb umana ~ 91%

 Differenze:
 pRb umana928 aa
 pRb murina926 aa
MODELLI ANIMALI
Uomo vs topo

Uomo:                         Topo:
Mutazione del gene Rb         Mutazione del gene Rb
 porta allo sviluppo del        porta allo sviluppo di
 retinoblastoma                 tumori ipofisari

    Questo perché nell’uomo la 2° mutazione del gene Rb
     avviene esclusivamente nelle cellule della retina
     portando allo sviluppo del retinoblastoma.
         MODELLI ANIMALI
... Rb e la crescita…

Per conoscere meglio il ruolo di Rb nella
 crescita cellulare viene creato un modello
 murino con più copie del gene integrate
 nel proprio genoma.
            MODELLI ANIMALI
Step 1
Si crea un transgene contenente:
Promotore Rb umano
Rb cDNA umano
Sito di polyA
5’                                                       3’
 Sstl           BamHI           BamHI             HindIII


  RB promotor      RB cDNA          Poly A Site

    1.6Kb               2.8Kb           1.6Kb
          MODELLI ANIMALI
Step 2
Si transfettano 4 topi wt (RBRb1, RBRb2, RBRb3,
  RBRb4) e si valuta il numero di copie del gene
  esogeno integrato.
Southern blot
                          Sonda: frammento di DNA
                          contenente l’intero transgene
       MODELLI ANIMALI
Step 2
Risultati:
RBRb2 1 copia del transgene
RBRb4 2 copie del transgene
RBRb3 3 copie del transgene
RBRb1 7 copie del transgene
                MODELLI ANIMALI
Step 3
Incrocio maschi fondatori x
   femmine non transgeniche

  Analisi del fenotipo
  della progenie
 RBRb1 x wt : A,B
 RBRb3 x wt : C,D
 RBRb4 x wt : E,F
 RBRb2 x wt : G,H

………..      Topi non transgenici
————— Topi transgenici
     MODELLI ANIMALI
Step 3
Analisi del fenotipo
Risultati:
I topi transgenici sono sempre più piccoli
   rispetto ai topi non transgenici dello stesso
   sesso appartenenti alla stessa linea.

….perchè?
        MODELLI ANIMALI
Conclusioni:
Lo sviluppo del nanismo è direttamente
  proporzionale al numero di copie del
  transgene integrato nel genoma del topo.
MODELLI ANIMALI
Dall’1992 …al 2004

Studi su topi hanno messo in evidenza che:
Nature,1992 :topi Rb-/- (sia in
  cell.germinali che somatiche) muoiono in
  utero intorno a 13.5 gg di gestazione a
  causa di difetti nella neurogenesi e
  nell’ematopoiesi.
        MODELLI ANIMALI
Cosa si è fatto?
Mutazione inserzionale nella linea
 germinale di cell. murine nel locus Rb
 esone 20.
Incrocio topi Rb/Rbm x Rb/Rbm topi Hz
 per la mutazione (m).
Topi Rbm/Rbm muoiono in utero a causa di
 difetti multipli della crescita.
           MODELLI ANIMALI
Genes & Development, 1993:
 l’iperespressione del gene Rb umano in topi
  Rb+/- (in cell. somatiche e germinali) risulta in
  topi nani.
 L’ipoespressione, in topi giganti.

Cancer Cell, giugno 2004  topi DKO
 La perdita di pRb e p107 in cellule progenitrici di
  retina del topo induce un’ iperproliferazione delle
  stesse, che risulta nello sviluppo di
  retinoblastoma non invasivo.
          MODELLI ANIMALI
Cell Cycle, luglio 2004 topi triplo KO
 Topi deficienti di entrambe le copie di p53, pRb
  e p107 in cellule progenitrici di retina sviluppano
  retinoblastoma invasivo con ipertrofia oculare ed
  invasione della camera anteriore dell’occhio.
        MODELLI ANIMALI
Come è stato generato un topo triplo KO?
MODELLI ANIMALI : triplo KO
 I topi utilizzati nella generazione I sono:
  p53-/-
  p107-/-
  pRb+/-
  RbLox /Lox             Bersagli dell’azione di Cre-
                          ricombinasi
  p53Lox /Lox
  Chx10-Cre: esprimono il gene Cre
 MODELLI ANIMALI : triplo KO



Chx10 promoter: induce l’espressione di Cre solo in cellule
   di retina
Cre : Cre-ricombinasi
GFP(fuso al gene Cre) :rilevazione dell’attività di Cre-
   ricombinasi in cellule vive mediante fluorescenza
Sito IRES: internal ribosome entry site
AP: fosfatasi alcalina (gene reporter) monitoraggio
   dell’attività del promotore Chx10
 MODELLI ANIMALI : triplo KO
   Caratterizzazione dei topi nel corso delle
    generazioni:
 Colorazione Rosa-26R:         Colorazione con BrdU:
  espressione di Cre-            rivelazione di cellule in
  ricombinasi in topi Chx10-     attiva proliferazione in
  Cre (cell blu)                 topi Chx10-Cre; RbLox/- ;
                                 p107-/-
 MODELLI ANIMALI : triplo KO
Alla V generazione otteniamo topi dal
  seguente genotipo
        Chx10-Cre; RbLox/- ; p53Lox/- ; p107-/-




Dal loro reincrocio si ottengono topi
p53-/- ; p107-/- ; Rb-/ -
    MODELLI ANIMALI : triplo KO
 Analisi fenotipica:
 Chx10-Cre; Rb Lox/- ; p53 Lox/- ; p107 -/-
 Chx10-Cre ; Rb+/- ; p53 Lox/- ; p107 -/-
 Chx10-Cre ; RbLox/- ; p53+/- ; p107-/-       topi con 1
 Chx10-Cre ; RbLox/- ; p53Lox/- ; p107+/-     allele wt




Insorgenza di RB in forma
aggressiva ed invasiva
  MODELLI ANIMALI : triplo KO
Caratterizzazione dei topi p53-/- ; p107-/- ; Rb-/ -
Pax 6: marcatore molecolare di cellule progenitrici
  di retina




N.B. anche nel topo il tumore forma cellule a
“rosette”, caratteristiche del retinoblastoma umano.
  MODELLI ANIMALI : triplo KO
Studi in vivo




In topi p53 -/- appena nati si induce infezione con un
retrovirus a livello della sclera .
  MODELLI ANIMALI : triplo KO



E1A 13S: il prodotto di questo oncogene inattiva le
proteine della famiglia Rb
sito IRES: internal ribosome entry site
AP: fosfatasi alcalina (gene reporter)
MODELLI ANIMALI : triplo KO




In questi topi , le cellule della sclera producono cloni in
attiva proliferazione, invadendo il tessuto circostante.
Come conseguenza a 3 settimane di vita sviluppano
retinoblastoma
 MODELLI ANIMALI : triplo KO
Conclusioni:
 pRb e p107 hanno un ruolo chiave nei
  meccanismi di tumorigenesi in Rb
la loro perdita causa instabilità cellulare,
  deregolazione del ciclo cellulare ed
  iperproliferazione.
 p53 influisce sulla gravità fenotipica del tumore
la sua perdita induce il manifestarsi di una forma
  aggressiva ed invasiva del tumore.
           PRECLINICAL MODELS
  Modello ortottico con xenotrapianto




Le cellule provenienti da RB umano vengono geneticamente modificate
per l’espressione della luciferasi
Sono iniettate nel corpo vitro dell’occhio di un topo di 2 settimane
Iniezione peritoneale di luciferina
Il grado di fluorescenza è direttamente proprorzionale al volume del
tumore
N.B. questo modello può essere utile nel follow-up del tumore in risposta
alla chemioterapia
          Fine
Realizzato da:
Cristiana Cuccurullo
Mariacristina Di Marino
Ludovica La Rocca

								
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