biotecnologia y conservación de cultivos

CONSERVACIÓN LA DE CULTIVOS Y PARA BIOTECNOLOGÍA LA INDUSTRIA Dr. Claudio Voget Curso CABBIO, 2005 Porque y para que conservar los cultivos ? • El cultivo (cepa microbiana o viral, linea celular, etc), es el elemento vital de la investigación o producción industrial • Conservar implica mantener la viabilidad y propiedades genéticas del cultivo durante un determinado período de tiempo • Consecuencias de una adecuada conservación: estabilidad de las cepas de producción, pureza, reproducibilidad de la investigación. Reposición Métodos de conservación de cultivos 1. con crecimiento transferencia seriada 2. con metabolismo limitado agua destilada bajo aceite mineral (control por O2) 3. con metabolismo detenido 3.1 Congelamiento (crioconservación) 3.2 Deshidratación L-drying: secado desde la fase líquida, silicagel, celulosa (papel), suelo, perlas de porcelana Liofilización (freeze-drying) CRIOCONSERVACIÓN Crioconservación es la conservación de material biológico a muy bajas temperaturas Rango -20 ºC a -196 ºC (nitrógeno líquido) El nitrógeno líquido es la temperatura práctica mas baja disponible. A la temperatura de equilibrio, la difusión molecular es extremadamente lenta y la probablilidad de que ocurran reacciones químicas es prácticamente nula CRIOINJURIA El proceso de congelamiento y descongelamiento produce cambios en las céluas que pueden resultar letales Los procesos perjudiciales son: formación de cristales de hielo, exosmósis, aumento de la solubilidad de gases, deshidratación, aumento de la concentración de osmolitos, disminución del pH, alteraciones de la actividad enzimática, acumulación de metabolitos, incremento del contacto entre moléculas, ruptura de puentes de H, distorsión de macromoléculas, solidificación, pérdidad de la integridad de membranas, ruptura de emulsiones, etc La formación de hielo intra o extracelular es quizás el evento mas crítico de la crioinjuria. INJURIA POR CONGELAMIENTO Congelamiento lento (efecto soluto) exosmósis Hielo extracelular shrinkage (efecto soluto) Congelamiento rápido ( efecto hielo ) Hielo intracelular Daño mecánico CRIOPROTECCIÓN Control de la velocidad de enfriamiento Balance óptimo entre el efecto soluto y la formación e hielo. En la práctica es aceptable 10 ºC/min. El descongelamiento debe ser lo mas rápido posible Incorporación de crioprotectores (CPs) CPs que permean la pared y membrana celular Me2SO ( Tp < 30 min), Glicerol, Metanol Cps que permean la pared pero no la membrana mono y disacáridos, aminoácidos, polímeros de bajo PM(PEG 600-1000) Cps no permeantes Polímeros de alto PM: proteínas, polisacáridos, PVP CRIOPROTECCIÓN El tipo de protección que ejerce el CPs depende de su permeabilidad Todos los CPs son altamente hidrofílicos CPs que permean totalmente ligan agua intracelular y reducen el efecto soluto CPs semipermeables forman entre la pared y la membrana celular una capa que proteje la célula del daño mecánico CPs no permeables se adorben en la superficie celular incrementando la viscosidad local lo cual manteniendo el hielo en forma amorfa evitando daño mecánico CONSERVACIÓN POR DESHIDRATACIÓN Este método implica la remoción de agua de las células (humedad final típica: 0.06-5.0 % de agua). La deshidratación puede llevarse a cabo desde la fase líquida (L-drying) o por sublimación desde el estado congelado (liofilización) Las pérdida de viabilidad durante la deshidratación es atribuida a alteraciones de la membrana celular. principalmente Las células deshidratadas son susceptibles al deterioro causado por oxígeno El deterioro de las células durante la deshidratación puede ser controlado por el agregado de aditivos. Algunos forman una matriz amorfa que dispersa los componentes tóxicos que la célula puede liberar durante el secado. Otro protectores interactúan con las membranas, estabilizando su estructura en el estado anhidro Los aditivos mas comunes son: leche descremada, aminoácidos (glutamato) y azúcares (sacarosa, trealosa) Principios de la liofilización muestra + protectores en ampollas vacío 30-60 militorrs manifold -70 ºC  - 5 ºC trampa de agua congelamiento etilenglicol + hielo seco (- 40 ºC) etanol + hielo seco (-70 ºC) Bomba de vacío de aceite La muestra colocada en una ampolla estéril con un plug de algodón, se congela entre - 40 ºC y -70 ºC. Una vez colocada la muestra en el manifold del equipo se comienza con el vacío y se retira el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5 ºC. A esta temperatura y con un vacío entre 30 y 60 militorrs, el secado es rápido. El tiempo es variable y depende del volumen de muestra. Al finalizar el proceso se sella la ampolla al vacío Consideraciones para la preservación de cultivos Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua (destilada, deionizada, corriente) empleados. Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, líquido, sólido), el estado fisiológico de las células al momento de la cosecha (cultivos líquidos cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase logarítmica), si se emplean células con medio ó lavadas. Determinar si el agente protector es tóxico. Definir condiciones de proceso: concentración de células, tiempo de secado, agregado de protectores En procesos industriales la viabilidad no es lo único importante. La cepa debe mantener sus propiedades productivas. Desarrollar un test de producción o bioensayo Durante la recuperación de la especie conservada deben determinarse: viabilidad, pureza, morfología, formación de producto, rasgos recombinates (plásmidos, resistencia a antibióticos, etc). Comparación de algunos métodos de preservación Método Almacenamiento (años) 0.5-2 Ventajas Simple, bajo costo, equipamiento requerido bajo bajo costo, equipamiento requerido bajo Desventajas Secado del agar, baja estabilidad genética, riesgo contaminación trabajo moderado, baja estabilidad genética Requiere protectores, Alto costo de freezer (-80ºC). Células pueden ser sensibles al O2 Suministro regular de N líquido Alto costo de equipamiento Agar Aceite mineral 2-20 Congelamiento 4-5 Equipamiento requerido bajo, buena estabilidad genética Preparación rápida, buena estabilidad genática Bajo riesgo de contaminación, buena a regular estabilidad genática Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido N líquido infinito Liofilización 15-20 Agua L-drying 1-5 3-10 Estabilidad genética regular estabilidad genética?