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					 NORMAS ESPECIALES DEL LABORATORIO DE
           MICROBIOLOGÍA.
 El laboratorio de microbiología es un lugar convenientemente
habilitado donde con las debidas precauciones se pueden
manejar y examinar microorganismos. Cuando manejamos
cualquier tipo de muestra debemos tener en cuenta la
posibilidad de riesgos, estos pueden ser biológicos, del
ambiente del Laboratorio o riesgos asociados como el manejo
substancias químicas, eléctricos, fugas de gas.
Todos los microorganismos que se manipulen deben ser
manejados con precaución por su potencial patogenicidad.
              Normas de laboratorio
1.         Es obligatorio el uso de bata larga de algodón, destinada
           exclusivamente para el Laboratorio de Microbiología. (Solo
           podrá retirarse para su aseo protegiéndola en una bolsa de
           plástico. Se recomienda lavar individualmente con jabón).

     NO PODRÁ USARSE EN OTRAS ÁREAS DE LA FACULTAD O EN
                 AMBIENTES HOSPITALARIOS.

            En caso que el profesor lo indique se deberá usar guantes
           y/o mascarilla, o propipetas.
2.         Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante lavara sus
           manos escrupulosamente con agua y jabón.
3.         El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado.
           Al inicio y al finalizar cada     práctica   es conveniente
           desinfectar la superficie de trabajo con alcohol de 70,
           solución de fenol o benzol.
4.         Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el
           Laboratorio. Los microorganismos deben manejarse cerca
           de la flama del mechero.
5.         Esta prohibido comer, beber, fumar y maquillarse. Cuando
           se manipulen microorganismos evite hablar sin necesidad o
           llevarse las manos a la nariz, boca, ojos etc.
6.         Utilice los recipientes adecuados para depositar los
           residuos peligrosos biológico infecciosos que se generen en
           la realización de la práctica. No tirar nada en los lavabos.
           El material de desecho no contaminado como papeles de
           envoltura depositarlos en los recipientes de basura común.
7.         Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta
           que la exposición a esta radiación es peligrosa.
8.         En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el
           Laboratorio notificar inmediatamente al instructor o al
           personal técnico para tomar las medidas higiénicas y de
           seguridad apropiadas, así como su registro.
9.         Incubar el material el tiempo que se indique, en caso
           contrario este será desechado.
10.        No almacenar material en el refrigerador. Esta
           estrictamente prohibido retirar del Laboratorio cultivos o
           cepas a menos que así lo indique el profesor. Al finalizar la
           práctica entregar el material empleado debidamente
           separado .
             TÉCNICAS BÁSICAS

Toma de muestras:




S
Siembra.




Tres Giros
              MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO.
1.         Compruebe que los lentes OCULARES Y OBJETIVOS
estén limpios, de no ser así límpielos cuidadosamente con
papel especial para lentes. NO toque los lentes con los dedos.
2          Coloque la preparación que se le proporcione sobre
la PLATINA, sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe
previamente que el objetivo de menor aumento este en
posición de empleo.
3.         Para Facteriología ilumine la preparación bajando
casi totalmente el Condensador, con el DIAFRAGMA abierto
totalmente.
4          Coloque el OBJETIVO10 X y enfoque, acercando al
máximo la lente a la preparación, empleando el tornillo
MACROMÉTRICO (NO haga esta operación mirando por el
ocular, correría el riesgo de destruir la preparación. Suba el
tubo lentamente observando por el ocular hasta que obtenga
un enfoque nítido.
5.       Pase   al    OBJETIVO    40x.Suba    ligeramente    el
CONDENSADOR, la imagen debe estar casi enfocada, afine el
foco con el tornillo MICROMÉTRICO. El objetivo de 40 X esta
muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos
tipos de accidente: Ser "clavado” en la preparación y resultar
manchado con aceite de inmersión si se observa una
preparación ya usada con este ultimo. Es preferible enfocar de
nuevo con el objetivo 10X.



              Empleo del OBJETIVO DE INMERSIÓN .
  a)     Gire el revolver hacia el OBJETIVO DE INMERSIÓN
         dejándolo a medio camino entre este y el objetivo
         40X.
  b)     Coloque una gota mínima de ACEITE DE INMERSIÓN
         sobre el punto de luz.
  b)     Termine de girar suavemente el REVOLVER hasta la
         posición del objeto de inmersión, asegurándose que
         este no toca la preparación pero sí la gota de aceite.
  c)     Enfoque cuidadosamente con el MICROMÉTRICO. La
         preparación debería estar prácticamente enfocada si
         se ha realizado un enfoque cuidadoso            con el
         OBJETIVO 40x. (De no ser así es preferible volver a
         enfocar de nuevo un campo distinto partiendo del
         objetivo 10 X).La distancia de trabajo desde el lente
         frontal del OBJETIVO DE INMERSIÓN                a   la
         preparación es mínima por lo que el riesgo de
         accidente es ahora máximo.
  d)     Una vez que haya colocado aceite de inmersión
         sobre la preparación, ya no puede volver a colocar el
          OBJETIVO 40X sobre este campo, correría el riesgo
          de mancharlo de aceite. Por tanto si desea enfocar
          otro campo, debe retirar         el OBJETIVO DE
          INMERSIÓN girando el revolver hacia el OBJETIVO
          10 X.
  e)     Finalizada la observación de una preparación y antes
         de retirarla de la PLATINA, se colocará el objetivo de
         menor aumento. NUNCA RETIRE LA PREPARACIÓN
         CON EL OBJETIVO DE INMERSIÓN EN POSICIÓN DE
         OBSERVACIÓN.
  f)     Retire la preparación y limpie el OBJETIVO DE
         INMERSIÓN cuidadosamente empleando un papel
         especial para óptica .Compruebe también que el
         OBJETIVO 40X esta perfectamente limpio.



 MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES1.              Si no esta utilizando
el MICROSCOPIO este debe estar guardado y cubierto con una
funda de plástico con el fin de evitar que se ensucien y dañen
los lentes.2.     NO se deben tocar nunca los lentes con las
manos. Cuando se necesite use papel especial para óptica para
su limpieza.3. Nunca deje una preparación sobre la platina
cuando no esta utilizando el microscopio.4.       Después       de
utilizar el objetivo de inmersión, limpie el aceite que queda en
el objetivo con papel especial. Si el aceite ha llegado a secarse
y pegarse en el objetivo se debe limpiar cuidadosamente con
una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. (Una aplicación
excesiva de estos disolventes puede dañar los lentes.5. NO
force nunca los dispositivos giratorios del microscopio.
(REVOLVER, CONDENSADOR, MACROMETRICO,
MICROMÉTRICO).6. NO cambie nunca de objetivo mientras
está observando a través del ocular. Dirija su mirada a la
preparación y evite el rozamiento del lente con la muestra.7.
      Cuando finalice el trabajo ponga el Objetivo de menor
aumento en posición de observación.8.       Es        conveniente
limpiar, revisar y cubrir los microscopios al finalizar la sesión
práctica.
TINCION SIMPLE

Material
   Portaobjetos
   Asa de platino
   Cristalizador
   Pinzas portaobjetos
   Mechero
   Microscopio
   Aceite de inmersión

Reactivos
   Violeta de Genciana
   Fuchsina básica diluida
   Azul de metileno

Objetivo
Técnica de tinción que permite observar la forma y disposición de los
microorganismos.

Tecnica

  1. Depositar con un asa de platino una gota del material a
     examinar en el centro de un portaobjetos bien limpio y
     desengrasado. Extender suavemente hasta ocupar una
     superficie de aproximadamente 1 cm2. Si se trata de examinar
     un microorganismo que se encuentra en un medio de cultivo
     sólido, se debe poner previamente una gota de agua destilada
     en el centro del portaobjetos y a continuación tocando
     ligeramente la colonia realizar la extensión.
  2. Secar la preparación con calor suave.
  3. Fijar la preparación con calor. Para ello se toma el portaobjetos
     con las pinzas y se corta 3-4 veces la llama del mechero.
  4. Se deja enfriar el portaobjetos para evitar la precipitación del
     colorante.
  5. Inundar la preparación con la solución del colorante elegido
     manteniendo el tiempo adecuado para su actuación (ver Tabla).
  6. Lavar con agua destilada para arrastrar el exceso de colorante.
  7. Secar la preparación al aire o con calor suave.
  8. Observar al microscopio con el objetivo de x 100 añadiendo una
     gota de aceite de inmersión en el centro de la preparación.
Tiempos y coloraciones de los reactivos empleados

Los tiempos indicados en la Tabla son los establecidos según el
método. Pueden modificarse dependiendo del tiempo que lleve
preparado el reactivo, pero esa variación será indicada por el profesor
si lo considera necesario.

  Violeta de           1 minuto        Violeta
  Genciana
  Fuchsina básica      3 minutos       Rojo-rosado
  diluida
  Azul de Metileno     10 minutos      Azul




Resultados
Observar la forma y disposición de los microorganismos y dibujar el
campo del microscopio.


Distribución
Personal
TINCION NEGATIVA

Material
   Portaobjetos
   Asa de platino
   Cristalizador
   Pinzas portaobjetos
   Mechero
   Microscopio
   Aceite de inmersión

Reactivos
   Solución de Nigrosina

Objetivo
  Técnica de tinción que permite observar estructuras extracelulares
  de los microorganismos (cápsulas etc.), así como su morfología.

Técnica

     1. Depositar en el centro del porta un gota de agua destilada y
        resuspender     el microorganismo objeto de estudio (no
        realizar extensión).
     2. En un extremo del porta se depositan un par de asas o una
        gota de la solución de Nigrosina.
     3. Se toma otro portaobjetos y se apoya sobre el primero
        formando un ángulo de 30º tocando la gota de Nigrosina, y
        se realiza un movimiento extensivo como si estuviéramos
        realizando un frotis (izquierda a derecha).
     4. Dejar secar al aire la preparación o con calor muy suave.
        Obsérvese que con esta técnica NO se fija la preparación, ni
        tampoco se elimina el colorante.
     5. Observar al microscopio con el objetivo de x 100 añadiendo
        una gota de aceite de inmersión en el centro de la
        preparación.

Resultados
Observar la forma y disposición de los microorganismos, que
aparecen incoloros sobre fondo negro. Dibujar el campo del
microscopio

Distribución
Personal
TINCION DE GRAM

Material
   Portaobjetos
   Asa de platino
   Cristalizador
   Pinzas portaobjetos
   Mechero
   Microscopio
   Aceite de inmersión

Reactivos
   Violeta de Genciana
   Fuchsina básica diluida
   Solución de Lugol
   Alcohol de 96º

Objetivo
Técnica de tinción diferencial que permite clasificar las bacterias en
Gram positivas y Gram negativas, según el tipo de coloración que
adquieran

Técnica

  1.    Extensión.
  2.    Desecación.
  3.    Fijación.
  4.    Teñir con Violeta de Genciana durante 1 minuto.
  5.    Sin lavar, reemplazar el colorante por la solución de Lugol,
        dejándole actuar durante 1 minuto.
   6.   Lavar con agua.
   7.   Decolorar con alcohol durante 30 segundos.
   8.   Lavar con agua.
   9.   Teñir con Fuchsina básica diluida durante 3 minutos.
  10.   Lavar, secar y observar al microscopio con el objetivo de
        inmersión.

Resultados
Los microorganismos Gram positivos aparecen de color violeta
mientras que los Gram negativos son de color rojo-rosado (fucsia).
Dibujar el campo del microscopio.

Distribución
Personal
ESTUDIO DE LA FLORA CUTÁNEA.

Introducción
Aunque estamos acostumbrados en Microbiología a estudiar cultivos
puros, esto es una situación artefactual en la Naturaleza. La mayoría
de los ambientes contienen una gran variedad de microorganismos
que se interrelacionan unos con otros en la lucha por crecer y
sobrevivir.
Un ejemplo de esta mezcla de poblaciones la tenemos en nuestro
propio cuerpo. La especificidad encontrada en cada zona depende de
numerosos factores entre los que se encuentran: el pH, la
concentración de oxígeno,       la humedad presente y el tipo de
secreción asociada.
En     la   piel   se    encuentran     generalmente     estafilococos
(predominantemente S. epidermidis), estreptococos (alfa hemolíticos,
no hemolíticos y enterococos), bacilos difteroides, levaduras y
hongos. Por lo tanto es un buen ejemplo para el estudio de
poblaciones mixtas. Por otra parte es importante diferenciar entre la
flora propia que tiene un ser humano y que se define como aquella
que coloniza la piel en el momento del nacimiento y que nos
acompaña hasta la muerte, y la flora transitoria que es la que vamos
adquiriendo a partir del contacto con el medio ambiente y
conseguimos eliminar tras el lavado de la zona con agua y jabón.
Con la finalidad de comprobar tanto la existencia de poblaciones
mixtas, como la diferencia entre la flora propia y transitoria se ha
diseñado la práctica que reseñamos a continuación, con la salvedad
de que sólo se investigarán las colonias aparecidas a las 24 horas de
incubación. Se ha de entender entonces que si el tiempo fuera más
prolongado, el número y diversidad de microorganismos sería mucho
mas alto, ya que los hongos por ejemplo son mucho más lentos en su
crecimiento que las bacterias o levaduras.


Material
   Placas de Agar Mueller-Hinton


Objetivo
Estudiar la flora cutánea propia diferenciando entre la flora
permanente y la transitoria, así como la existencia de poblaciones
mixtas en la Naturaleza.

Técnica
           1 Tomar una placa de Agar Mueller-Hinton y rotularla en
             dos sectores como antes y después. (Se emplea el
            agar Mueller-Hinton ya que es un medio rico que no
            inhibe el crecimiento de ninguna especie).
          2 Con el dedo de la mano imitando un escobillón, pasarlo
            suavemente sobre la superficie del agar en el sector
            rotulado como antes.
          3 Lavarse las manos con agua y jabón y volver a repetir
            la operación anterior en el sector marcado como
            después.
          4 Incubar las placas a 37ºC durante 24-48.

Resultados
Observar las diferencias que existen tanto en número como en tipo
de colonias en los sectores marcados antes y después. Realizar un
Gram de cada tipo de colonia diferente y anotar la coloración
obtenida y la forma del microorganismo. Observar que en la
Naturaleza es normal la existencia de flora mixta más que cultivos
puros.

Distribución
Personal
     UNA FERMENTANCIÓN MIXTA.

      El Kefir es una bebida alcohólica, a base de leche fermentada,
de origen balcánico.
      Se fabrica con un cultivo mixto de bacterias y levaduras
capaces de fermentar la lactosa. Las bacterias son similares a las del
yogur, las levaduras producen CO2 y una pequeña cantidad de
alcohol. Algunas bacterias producen una goma viscosa que atrapa a
los microorganismos formando grumos. Estos grumos son los granos
de Kefir que se separan y se reutilizan para reiniciar otra
fermentación. La bebida es un "yogur" chispeante y refrescante.

OBJETIVOS:
Observar una fermentación mixta (láctico-alcohólica).

MATERIALES.

Papel pH.
Leche UHT.
Granos de Kefir y un colador.


Protocolo

  1. Poner 40 ml de leche en los tubos "falcon". Cubrirlos e
     incubarlos 10 min. a 43º C (no necesario).
  2. Añadir una cucharadita de granos de Kefir.
  3. Incubar a temperatura ambiente y en oscuridad hasta el día
     siguiente.
  4. Agitar el producto. Tomar muestras para medir el pH final.
     Realizar tinciones gram al kefir líquido y al grano. Para teñir el
     grano aplastarlo una pequeña muestra entre dos portas.

				
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posted:7/11/2011
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