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					Microbiología Autor: Dra. Johanna Citalán

FAGOCITOSIS

Durante la fagocitosis las células engullen partículas grandes como bacterias, desechos celulares o incluso células intactas. La unión de la partícula a los receptores sobre la superficie de la célula fagocitica dispara la extensión de seudópodos, estos acaban rodeando a la particular y sus membranas se funden para formar una gran vesícula intracelular llamada Fagosoma. Los fagosomas se fusionan con los lisosomas, dando lugar a los fagolisosomas en los que el material ingerido se digiere por la acción de las hidrolasas acidas lisosomas, durante la maduración del fagolisosoma, alguna de las proteínas de membrana internalizadas se reciclan a la membrana plasmática como se describe: la ingestión por fagocitosis de partículas grandes desempeñan papeles distintos en los diferentes tipos de células. En los mamíferos la fagocitosis es la función principal de dos tipos de glóbulos blancos sanguíneos, macrófagos y neutrofilos a los que se denomina frecuentemente “fagocitos profesionales”. Tanto los macrófagos como los neutrofilos desempeñan un papel crítico en los sistemas de defensa del organismo, eliminando los microorganismos de los tejidos infectados.

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www.javeriana.edu.co/.../celular/REyAG.html

PRUEBA DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE TETRAZOLIO NITRADO
El azul de tetrazolio nitrado es un componente claro, amarillo soluble en agua, que al reducirse forma el formazan (sal de tetrazolio), tinción de color azul oscuro. Los neutrofilos pueden reducir el colorante después de la ingestión de otras partículas, subsecuente a la descarga abrupta generada por la vía derivada del monofosfato de hexosa. El colorante reducido se puede medir con facilidad por medio de fotometrías, la reducción de NBT de color azul, forma la base para la prueba de cuantificar del azul de tetrazolio nitrado. Se desconoce el mecanismo preciso de la reducción del NBT pero el fenómeno esta estrechamente unido a los proceso de explosión respiratoria que sigue a la ingestión que incluyen el aumento de actividad de la derivada del monosfosfato de hexosa, incremento de oxigeno y aumento de de la formación de peróxido de hidrogeno y radical superoxido. Ya que la generación de actividad reductora en neutrofilos intactos es paralela a las actividades que siguen a la ingestión la reducción NBT es un medio útil para analizar la integridad metabólica general de los neutrofilos fagocitantes. La falla de la reducción del colorante NBT es una anormalidad consistente y de importancia diagnostica para la enfermedad granulomatosa crónica. Los
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neutrofilos de este paciente no pueden dar muerte a ciertos microorganismos intracelulares, ni generar H2O2.

PRUEBA DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE TETRAZOLIO NITRADO

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En el frote secado al aire y fijado en metanol, con coloración Wright de Giemsa, se puede observar los neutrófilos con sus organelas grandes y se pueden observar grumos de color azul – morado, que corresponde a los restos de sal de tetrazolio de color azul.

INMUNIDAD HUMORAL

Precipitación en Gel de Agar y la Inmunodifusión:

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Es una técnica simple mediante la cual el antígeno y anticuerpo se colocan en contenedores separados dentro de un soporte semisólido (ej., agar) y posteriormente se les permite mezclarse a través del soporte por medio de difusión. Cuando se alcanza una zona de equivalencia, entonces aparece una línea de precipitación, lo cual resulta visible cuando se deja pasar la luz a través del gel. La difusión doble de agar, a menudo referida como análisis de Ouchterlony sirve para caracterizar la relación entre diferentes antígenos. En esta metodología los antígenos se colocan en contenedores de agar y el anticuerpo se coloca en un contener centra, de este modo, se permite que los reactivos se difundan en conjunto y que la naturaleza de las líneas de precipitación entre los contenedores se identifique. Aunque sencillos, los métodos de inmunodifusión tienen limitaciones en términos de insensibilidad y porque requieren cantidades relativamente grandes de antígeno o anticuerpos precipitantes, y la velocidad de difusión hace de esta prueba un método que consume mucho tiempo. Este ultimo problema a menudo se resuelve colocando la matriz de agar en un campo eléctrico, el cual dirige en conjunto a antígeno y anticuerpos una técnica llamada inmunoelectroforesis de contracorriente, también incrementa la eficacia en la formación de complejos antígeno-anticuerpo y suele aumentar la sensibilidad del ensayo. Anticuerpos sometidos rutinariamente a ensayos de la inmunodifusion o electroinmunodifusion: Anticuerpo dirigidos contra aintigenos nucleares extraibles (ENA) -anti-sn RNP, anti-Sm, anti-SSA (Ro), anti-SSB (La), Anti-Scl-70 (topoisomerasa I). Anticuerpos antifúnficos (coccidioidomicosis, aspergilosis, histoplasmosis). Anti-Entamoeba histolytica

Inmunodifusión Doble: En el método de inmunodifusion de Ouchterlony. En el pozo del centro se coloca de un
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suero de Acs contra determinado antígeno. En los pozos de la periferia se colocan sueros de pecientes en las cuales se quiere determinar si un antígeno especifico esta presente. Las bandas de precipitación indican cuales sueros son positivos para el antígeno. En este caso las bandas formadas entre el pozo central con un Ac y los cuatro periféricos con muestras de diferente paciente deja apreciar que en los pozos 1 y 2 hay presente un antígeno que es reconocido por los Acs colocados en el centro.

Inmunodifusion Simple: En este método se utiliza un disco recubierto por una capa de Agar impregnado de Acuerpos contra un antígeno. Por ejemplo se incorpara al agar, Acuerpo producido de un animal contra la IgG humana. En los pozos perifericos se colocan muestra de sueros de diferentes pacientes. Si en el suero del paciente hay IgG esta se difunde en busca de los Anticuerpos presentes, y la reacción Ag-Ac se refleja por la formación de un halo alrededor del pozo. El paciente cuyo suero se coloco en el pozo 4 no tenía IgG. En el laboratorio se observó la determinación de C3 y C4, por medio de la medición del diámetro de los halos, en éste caso se tomo uno de cada uno, puesto que se midió el que presentaba mayor diámetro. Siendo el resultado:
ANTÍGENO DIÁMETRO CANTIDAD EN CADA POSILLO

C3 C4

7 mm 6 mm

211.6 mg/dL 141 mg/dL

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INMUNIDAD HUMORAL

En el cuadro A, se puede observar el halo producido por la unión antigeno – anticuerpo, que en éste caso el antígeno corresponde a la opsonina C3 del complemento, con un diámetro de 7mm. Mientras que en el cuadro B, se puede observar un halo de 6mm de diámetro, producido por la unión antígeno – anticuerpo, siendo el antígeno la molécula C4 del complemento.

AGLUTINACION Son reacciones antígeno – anticuerpo en el cual el antígeno se encuentra particulado y se puede unir a sitios de unión libres de los anticuerpos.

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Un antígeno celular o de partículas insolubles es aglutinado directamente por el anticuerpo. Un ejemplo de esto es la aglutinación de los eritrocitos del grupo A por antisueros anta-A, la aglutinación de los eritrocitos RH positivos por el antisuero anti-D o la aglutinación del antígeno brucelar por anticuerpos anti- Brucella. Gran cantidad de partículas como pueden ser eritrocitos, bacterias, hongos y virus pueden ser aglutinados por anticuerpos séricos, algunas veces de manera inespecífica y otras específicas, siendo éstas últimas, respuestas a una previa inmunización del organismo productor de los anticuerpos séricos. Las pruebas para identificar anticuerpos específicos son llevadas a cabo titulando seriadamente antisueros en diluciones al doble en presencia de una cantidad constante de antígeno. Cuando la acción de la Ac esta dirigida a Antigenos que estén en la superficie de las células o hacen partes de las membranas de microorganismos, el Anticuerpo produce la agregación de las diferentes células. La reacción suele ser más visible cuando el Anticuerpo es de tipo IgM que cuando es IgG. Es la reacción preferida para el diagnostico del tifo exantemático, reacción de Weil Felix y para la fiebre tifoidea, reacción de Widal. Es igualmente una reacción útil para la clasificación de los grupos mayores del os globulos rojos, sistema ABO y sistema RH. En el caso de los antígenos situados en la membrana de los hematíes reaccionan con los anticuerpos y el resultado de la reacción es la formación de grumos de hematíes o aglutinados. Las determinaciones de antígenos hemáticos y el estudio de anticuerpos en sueros se basan principalmente en la aglutinación de los hematíes, aunque en ocasiones la unión antígeno/anticuerpo que activa la vía clásica del sistema del complemento puede ser detectada por una hemólisis «in vitro». Los anticuerpos de grupo sanguíneo esencialmente hemolíticos son: anti-A, anti-B, anti-Lea, anti-Vel y anti-PP1p. Sin embargo en el laboratorio solamente se utilizaron los anti-A y anti-B.

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AGLUTINACION

Sangre Tipo A +

Sangre Tipo B+

Sangre Tipo O+

En éste caso se pudo observar la aglutinación, con una producción de grumos de hematíes en el fondo de la gota de sangre unida al anti-A, al igual que la falta de respuesta al anti-B (A). En el cuadro B, podemos observar una reacción positiva al anti-B, con una característica aglutinación de hematíes, y una negativa al anti-A, sin acúmulo de hematíes, con hemolisis de los eritrocitos, que hace parecer a la gota de sangre más líquida (B). En el caso de la sangre con grupo rh 0+, para ambos anticuerpos, anti-A y anti-B, fue negativo, causando hemólisis de las gotas de sangre (C).

INMUNIDAD CELULAR
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Rosetas E: El receptor de las células epiteliales timicas para el antígeno de membrana CD2 (T11) de los linfocitos T, es similar a un receptor que tienen los eritrocitos de carnero. Al poner los linfocitos T y B con eritrocitos de carnero, los linfocitos T se unen a los eritrocitos de carnero formando las rosetas y los linfocitos B no se unen lo cual se separan. Una persona tiene entre 60-70% de linfocitos en rosetas, las mismas deben de tener más de tres.

www.sanidadanimal.info/cursos/inmuno2/ca022.htm

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INMUNIDAD CELULAR

En esta imagen se pueden observar los eritrocitos de carnero, de tamaño menor a los linfocitos T, que son adheridos al eritrocito ya que presentan receptores de membrana (T 11) similares a los del ser humano.

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PRUEBAS INTRADERMICAS
Pruebas de hipersensibilidad cutánea tardía: la prueba intradérmica simple permanece como una arma útil y en ocasiones sirve para establecer diagnósticos. La prueba de hipersensibilidad cutánea tardía detecta hipersensibilidad cutánea a un antígeno o a un grupo. Sin embargo cuando se efectúa pruebas para enfermedades infecciosas, una respuesta positiva no indica una infección activa con el microorganismo de la prueba, estas pruebas también son de gran valor para la evaluación general de la inmunocompetencia en estudios epidemiológicos. La incapacidad para reaccionar contra un conjunto de antígenos cutáneos habituales se denominan anergias. Las pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada poseen en la clínica dos aplicaciones principales: 1) Evaluar la competencia inmunitaria 2) Determinar si el paciente posee células T de memoria. La prueba se llevan a cabo a través de inyecciones intradérmicas de antígenos preparados de manera esteril, en el antebrazo o alguno región cutánea de acceso fácil. El grado de induración se mide 48 horas después de la inyección. La respuesta de una piel que padece hipersensibilidad retardada requiere la participación de células T de memoria específicas del antígeno y produce una inflamación que muestra un pico máximo después de 48 horas a partir de la inyección. La inflamación es el resultado de la producción de citocinas y quimiocinas locales en el sitio de la inyección lo cual resulta de grandes cantidades de neutrofilos y células mononucleares. La respuesta de hipersensibilidad mediada por IgE produce un papula y enrojecimiento inmediato en el sitio de la inyección o tardia en el sitio. Técnica de la prueba cutánea: Se deben almacenar los antígenos estériles liofilizados a 4 C, protegidos de la luz y han de reconstituirse antes de su uso y verificar la fecha de caducidad del fabricante. Las soluciones por probar no deben almacenarse en jeringas durante periodos prolongados antes de su uso. Una jeringa con aguja 25 o 27.
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Las dimensiones mas grande de eritema e induración denen medirse con una regla y registrarse a las 24 y 48 horas. Ha de confirmarse la hiporreactividad a cualquier antígeno determinado mediante mayores concentraciones de antígeno o en circunstancias ambiguas por medio de una prueba repetida con la dosis intermedia.

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Pruebas de tuberculina: La prueba de tuberculina es un examen que se hace para probar si una persona ha estado en contacto con la bacteria (bacilo) de la tuberculosis. Consiste en inyectar intradérmicamente en el brazo una preparación de tuberculina. Tras un periodo de 48-72 horas se observará una inflamación en el lugar de la inyección. Se medirá el diámetro de la inflamación para dar como (+) ó (-) la prueba. Esta prueba, mejor conocida como PPD (Derivado de Proteína Purificada) es utilizada para diagnosticar la infección por tuberculosis y tiene valor para el diagnóstico en las personas que desarrollan los síntomas, tienen evidencias radiográficas o presentan basiloscopías positivas para el bacilo de la tuberculosis. Lectura de la tuberculina Para hacer esta prueba se aplica una substancia que se llama tuberculina en el antebrazo de la persona. La lectura de la prueba se realiza dos o tres días después de la aplicación de la substancia, por un profesional de la salud debidamente autorizado. La prueba es positiva si aparece un endurecimiento del tamaño de la goma de borrar de un lápiz o de mayor tamaño. Una reacción positiva a la tuberculina indica que la persona estuvo o está en contacto con la bacteria de la tuberculosis por lo que se refiere a ese paciente como una persona infectada por TB. Esta persona tiene que visitar a un médico quien le orientará y hará estudios que sirven para descartar la posibilidad de desarrollar la enfermedad de tuberculosis. (El médico pudiera indicar el uso de medicamentos). Si el resultado de la prueba es negativo y usted sabe que ha estado expuesto(a) al germen de TB, debe repetir la prueba unas semanas después. Existen otras pruebas que revelan si la persona tiene la enfermedad de TB. Una placa de pecho revela si los pulmones han sufrido daño a causa de TB. Una prueba de esputo (flema) consiste en colectar la flema que la persona elimina al toser. Esta muestra se

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lleva a un laboratorio para determinar si la persona tiene la enfermedad de TB.

www.florida-allergy.com/spanish/services.htm

PRUEBAS INTRADERMICAS

En la prueba intradérmica de la tuberculina, se observo una reacción a las 36 horas, que consistió en una hiperemia y picazón, con una induración de 7*10 mm, no muy elevada, sin bordes definidos completamente. Según el instructivo de laboratorio, este tipo de reacción es de resultado dudoso ya que no era muy definida y la misma solo se presento brevemente, puesto que a las 48 horas, ya había desaparecido y quedando la hiperemia que marcaba el sitio donde
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alguna vez se encontraba la induración. Durante las 48 horas precedentes, hubo ardor y molestia en el brazo de la paciente.

BIBLIOGRAFÍA

Inmunología Básica y Clínica. 10ª. Edición, Editorial El Manual Moderno, 2002. Capítulos 15 y 16 Inmunología Básica y Clínica. 9ª. Edición, Editorial El Manual Moderno, 2002. Capítulos 14 y 15 Cooper, Geoffrey M. Cooper´s la Célula, 3ª. Edición, Editorial Marban Libros, España. 2006. Pag 510. William Rojas Montoya, Inmunología. 8ª. Edición, CIR, Medellín, Colombia. 1990. Capítulos 3 y 9. Publicación: VI. Reacciones de aglutinación. Gaceta Médica. México Vol. 140, Suplemento No. 3, 2004. Autor Vicente Aguilar-García*

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ANEXOS

ANEXO I:
Prueba de NBT.

ANEXO II:
Precipitación en Gel de Agar, por inmunodifusión simple.

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ANEXO III:
Determinación del grupo sanguíneo por medio de la técnica de Reacción de Aglutinación.

ANEXO IV:
Prueba intradérmica de la tuberculina. Se observa una pequeña induración a las 24 horas.

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