Docstoc

Buku Panduan Kultur Jaringan

Document Sample
Buku Panduan Kultur Jaringan Powered By Docstoc
					http://e-
learning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20VI%20Mikropropagasi/VI3%20Faktor%20fakto
r%20yg%20berpengaruh%20pd%20mikro.htm

                           BAB I PENDAHULUAN
Kultur jaringan atau tissue culture atau sering juga disebut budidaya in vitro adalah
suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan
atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol
kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut
dapat memperbayak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.

Dasar teori yang digunakan dalam kultur jaringan adalah teori totipotensi yang ditulis
oleh SCHLEIDEN dan SCHWANN (Suryowinoto dan Suryowinoto, 1977). Bagian
tanaman yang hidup mempunyai sifat totipotensi, yaitu kemampuan untuk tumbuh dan
berkembang menjadi menjadi satu individu yang utuh/tanaman yang sempurna bila
dibudidayakan di dalam media yang sesuai.

Teknik kultur jaringan menuntut syarat-syarat tertentu yang harus dipenuhi dalam
pelaksanaannya. Syarat pokok pelaksanaan kultur jaringan adalah laboratorium dengan
segala fasilitasnya. Laboratorium harus menyediakan alat-alat kerja, sarana pendukung
terciptanya kondisi aseptik terkendali dan fasilitas dasar seperti, air listrik dan bahar
bakar.

Pelaksanaan kultur jaringan memerlukan juga perangkat lunak yang memenuhi syarat.
Dalam melakukan pelaksanaan kultur jaringan, pelaksana dituntut dalam hal
ketrampilan kerja, ketekunan dan kesabaran yang tinggi serta harus bekerja intensif,
selain itu juga pelaksana harus mempunyai latar belakang ilmu-ilmu dasar tertentu
yaitu botani, fisiologi tumbuhan ZPT, kimia dan fisika yang memadai. Pelaksana akan
banyak berhubungan dengan berbagai macam bahan kimia, proses fisiologi tanaman
(biokimia dan fisika) dan berbagai macam pekerjaan analitik. Kadang-kadang latar
belakang pengetahuan tentang mikrobiologi, sitologi dan histologi juga diperlukan.

Pekerjaan kultur jaringan meliputi : persiapan media, isolasi bahan tanam (eksplan),
sterilisasi eksplan, inokulasi eksplan, aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman
hasil kultur jaringan ke lapang. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena
setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar
pengetahuan tersendiri.

Sejarah Budidaya Jaringan Tumbuhan

Tokoh-tokoh yang berperan dalam sejarah dimulainya pengetahuan kultur jaringan
antara lain adalah:

• Orang yang pertama melakukan kultur jaringan adalah Gottlieb Haberlant pada
  tahun 1902.
• Tahun 1904 Hannig melakukan kultur embrio pada tanaman cruciferae.
• Knudson berhasil mengecambahkan anggrek secara in vitro di tahun 1922, pada
  tahun yang sama Robbins mengkulturkan ujung akar secara in vitro.
• Gautheret, nobecourt dan White yang menemukan auxin dan telah berhasil
  membudidayakan kalus pada tahun 1939.
• Skoog dkk. telah menemukan sitokinin dan orang pertama yang sukses dalam
  melakukan kultur jaringan pada tahun 1939.
• Tahun 1940 Gautheret melakukan ku.ltur jaringan kambim secara in vitro pada
  tanaman Ulmus untuk study pembentukan tunas adventif.
• Tahun 1941 Penggunaan air kelapa untuk campuran media dalam kultur Datura
  oleh van Overbeek.
• Pembentukan tunas adventif pertama pada kultur tembakau secara in vitro oleh
  Skoog pada tahun 1944.
• Baru pada tahun 1946, tanaman lengkap pertama dapat dihasilkan dari eksplan
  kultur tunas ujung pada Lupinus dan Tropaeolum oleh Ball.
• Pada tahun 1950 Ball mencoba menanam jaringan kalus tanaman Sequoia
  sempervirens dan dapat menghasilkan organ.
• Muir berhasil menumbuhkan tanaman lengkap dari kultur sel tunggal pada tahun
  1954.
• Tahun 1955 Miller dkk. Menemukan kinetin yang dapat memacu pembelahan sel.
• Produksi tanaman haploid pertama dihasilkan oleh Guha pada tahun 1964.
• Laminar air flow digunakan pertamakali pada akhir tahun 60-an.
• Power mencoba melakukan penyatuan (fusi) protoplas pertama kali pada tahun
  1970.
• Baru pada tahun 1971 tanaman lengkap dihasilkan dari eksplan protoplas oleh
  Takebe.
• Untuk mendapatkan tanaman yang tahan penyakit, Larkin pada tahun 1981
  mengadakan penelitian variasi somaklonal yang pertama kali.
• Salah satu cara untuk mendapatkan kultuvar unggul adalah dengan melakukan
  transformasi. Transformasi sel pertama dilakukan oleh Horch pada tahun 1984.
• Trasformasi tanaman pertama dilakukan oleh IPTC pada tahun 1986.
• Transformasi wheat oleh Vasil pada tahun 1992.
• Pada tahun 1996 pelepasan pertama tanaman hasil transformasi genetik.
Landasan Kultur Jaringan

Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman, yaitu:
       1.     Totipotensi      adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk
              tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi
              dengar benar dan sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua
              informasi tentang pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme
              terdapat di dalam sel. Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat
              totipotensi, tetapi yang mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel
              yang meristematik.
       2.     Rediferensiasi       adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali
              menjadi ke kondisi meristematik dan berkembang dari satu titik
              pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu
              melakukan reorganisasi manjadi organ baru.
       3.     Kompetensi        menggambarkan potensi endogen dari sel atau jaringan
              untuk tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu. Contohnya
              embrioagenikali kompeten sel adalah kemampuan untuk berkembang
              menjadi embrio fungsional penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau
              morfogenetikali tidak mempunyai kemampuan.

Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu istilah umum
yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang umumnya tembus
cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang artinya sebenarnya
adalah kultur di dalam gelas.

Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni:

1. Kultur biji    (seed culture), kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau
  seedling.
2. Kultur organ       (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya
  menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun,
  bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll.
3. Kultur kalus     (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan
  (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya.
4. Kultur suspensi sel     (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan media
     cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan
     menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang
     digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.
5. Kultur protoplasma. Eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian
     dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat
     dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur
     protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2
     protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).
6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman, yakni:
     kepala sari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), serbuk sari/ pollen (kutur
     pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid.




Istilah-istilah (terminologi) Dalam Kultur Jaringan

1.    Bahan tanam yang digunakan dalam kultur jaringan biasanya disebut dengan
      eksplan.
2.    Kalus : a. suatu jaringan yang tersusun oleh sel-sel terdediferensiasi yang
                 umumnya dihasilkan oleh jaringan yang luka atau kultur jaringan pada
                 media yang berisi auxin tertentu, atau
                 b. Pertubuhan aktif massa sel yang belum dan terdiferensiasi dan tidak
                 terorganisir yang berkembang dari jaringan luka atau kultur jaringan
                 yang ditanam pada media dengan tambahan zat pengatur tumbuh.
3.    Dalam kultur jaringan, sering dilakukan pemindahan eksplan dari media I (untuk
      induksi kalus) ke media II (media untuk induksi organ tunas dan akar).
      Pemindahan eksplan dari media satu ke media lain (baik jenis medianya sama atau
      lain) dikenal dengan istilah subkultur.
4.    Setiap masa inkubasi disebut passage. Passage pertama adalah subkultur pertama
      dari jaringan yang terbentuk dari eksplan awal.
5.    Bahan yang diambil pada setiap subkultur disebut inokulum.
6.    Kultur asenik adalah kultur dengan hanya satu macam organisme yang diinginkan.
7.   Eksplan yang ditanam pada media tumbuh yang tepat, dapat beregenerasi melalui
     proses yang disebut organogenesis atau embriogenesis. organogenesis adalah
     proses terbentuknya organ-organ seperti pucuk dan akar.
8.   Pucuk yang terbentuk pada tempat yang bukan jaringan asalnya (origin) yang
     biasa, disebut pucuk adventif. Seperti pucuk yang terbentuk dari kalus, hipokotil,
     kotiledon dan akar.
9.   Embriogenesis adalah proses terbentuknya embrio somatik.
10. Embrio somatik (nonzygotic embryo) adalah embrio yang bukan berasal dari
     zigot, tetapi dari sel tubuh tanaman.
11. Bila embrio terbentuk dari kultur anther atau mikrospora disebut androgenesis,
     bila berasal dari ovari yang belum mengalami fertilisasi disebut gynogenesis.
12. Anakan tanaman yang telah lengkap memiliki organ daun, batang dan akar hasil
     kultur jaringan disebut plantlet (plantula).
13. Plantula yang akan dipindah ke lapangan dan diperlakukan sebagai bibit, harus
     mengalami masa adaptasi dari kultur heterotropik menjadi kultur autotropik. Masa
     adaptasi plantula disebut dengan aklimatisasi.
14. Pucuk-pucuk yang terbentuk dari jaringan kalus, terutama yang sudah mengalami
     subkultur, dapat bervariasi. Variasi-variasi ini disebut variasi somaklonal.
     Penyebab variasi ini belum diketahui dengan pasti, ada kemungkinan variasi ini
     sudah ada dalam eksplan asal karena sifat kromosom mosaic dalam sel-sel somatik
     ataupun terjadi akibat lingkungan dalam kultur.
15. Salah satu variasi yang terjadi adalah tanaman yang aneuploid yaitu tanaman
     dengan jumlah kromosom 2n-1 atau 2n+1.
16. Sel-sel dalam kalus atau sel-sel dari jaringan daun di-isolasi dengan perlakuan
     enzim    merupakan     bahan    untuk    memperoleh   protoplasma.   Protoplasma-
     protoplasma diperoleh dengan menghilangkan dinding sel dengan bantuan enzim-
     enzim cellulase, hemicelluase dan pektinase. Protoplasma kemudian dapat
     “dipaksa” untuk saling menempel dan bersatu membentuk suatu fusi sel. Proses
     ini merupakan bidang pemuliaan yang disebut hibridisasi genetik.
17. Hasil gabungan dua atau lebih protoplasma yang berbeda jenis dengan inti-intinya
     dikenal dengan istilah heterokarion.
18. Bila hanya sitoplasma yang bergabung maka disebut dengan cybrid.
Peranan Kultur Jaringan

A. Dalam bidang hortikultura

Kultur jaringan sudah diakui sebagai metode baru dalam perbanyakan tanaman.
Tanaman yang pertama berhasil diperbanyak secara besar-besaran melalui kultur
jaringan adalah tanaman anggrek, menyusul berbagai tanaman hias, sayuran, buah-
buahan, pangan dan tanaman hortikultura lainnya. Selain itu juga saat ini telah
dikembangkan tanaman perkebunan dan tanaman kehutanan melalui teknik kultur
jaringan. Terutama untuk tanaman yang secara ekonomi menguntungkan untuk
diperbanyak melalui kultur jaringan, sudah banyak dilakukan secara industrial. Namun
ada beberapa tanaman yang tidak menguntungkan bila dikembangkan dengan kultur
jaringan, misalnya: kecepatan multiplikasinya terlalu rendah, terlalu banyak langkah
untuk mencapai tanaman sempurna atau terlalu tinggi tingkat penyimpangan genetik.

Dalam bidang hortikultura, kultur jaringan sangat penting untuk dilakukan terutama
pada tanaman-tanaman yang:

1. Prosentase perkecambahan biji rendah.
2. Tanaman hibrida yang berasal dari tetua yang tidak menunjukkan male sterility.
3. Tanaman hibrida yang mempunyai keunikan di salah satu organnya (bentuk atau
     warna bunga, buah, daun, batang dll).
4. Perbanyakan pohon-pohon elite dan/atau pohon untuk batang bawah.
5. Tanaman yang selalu diperbanyak secara vegetatif, seperti: kentang, pisang,
     stroberry dll.

B.     Dalam bidang agronomi

Kultur jaringan sangat membantu dalam usaha eliminasi patogen. Dengan metode ini
dapat dipilih bagian atau sel-sel yang tidak mengandung patogen, terutama virus dan
menumbuhkan sel-sel tersebut serta meregenerasikan kembali menjadi tanaman
lengkap yang sehat. Secara konvensional tidak ada cara yang efektif untuk
menghilangkan virus dari bahan tanaman. Kultur meristem yang disertai perlakuan
temperatur 38-40oC selama beberapa waktu, dapat menghilangkan virus dari bahan
tanaman. Bahan yang bebas patogen ini juga memudahkan pertukaran plasma nutfah
internasional.
Seleksi tanaman merupakan kegiatan agronomi yang telah ada sejak manusia mulai
membudidayakan tanaman. Pada metode konvensional, seleksi tanaman memerlukan
jumlah tanaman yang banyak sekali pada lahan yang luas, dengan pemeliharaan yang
intensif serta waktu yang lama. Dengan berkembangnya kultur jaringan, ditemukan
hasil yang tidak terduga. Dalam kultur yang membentuk sel-sel bebas, terjadi variasi
somaklonal dalam hal morfologi, produksi, pola pertumbuhan dan resistensi terhadap
penyakit. Dengan media seleksi, beberapa lini-lini sel ini dapat dibedakan dari sel-sel
lini yang biasa dalam beberapa petri-dish.

C.   Dalam bidang pemuliaan tananaman

Dalam bidang pemuliaan tanaman yang komersial, banyak ditemui kegagalan
pembentukan embrio yang viable. Kegagalan disebabkan oleh hambatan pada polinasi,
pertumbuhan pollen-tube, fertilisasi dan perkembangan embrio atau endosperm.
Setelah kultur protoplasma berkembang, diharapkan hambatan ini dapat dikurangai
dengan metode fusi protoplasma atau injeksi organel dan sitoplasma dari sel yang satu
ke sel lain.

Teknik kultur jaringan dapat diterapkan dalam bidang pemuliaan tanaman terutama
untuk mempercepat pencapaian tujuan dan membantu jika cara-cara konvensional
menemui rintangan alamiah. Melaui teknik kultur jaringan dapat dilakukan manipulasi
sebagai berikut:

        1.     Manipulasi jumlah kromosom melalui bahan kimia atau meregenerasikan
               jaringan tertentu dalam tanaman seperti: endosperma yang mempunyai
               kromosom 3n.
        2.     Tanaman haploid dan double haploid yang homogeneous melalui kultur
               anther atau mikrospora.
        3.     Polinasi in vitro dan pertumbuhan embrio yang secara normal abortif.
        4.     Hibridisasi somatik melalui teknik fusi protoplasma baik intraspesifik
               maupun interspesifik.
        5.     Variasi somaklonal.
        6.     Transfer DNA atau organel untuk memperoleh sifat tertentu.
                               BAHAN BACAAN I

     1.   Chawla, H.S., 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd ed. Science
          publishers,Inc. New Hampshire .
     2.   Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture
          general principles and commercial applications. Queensland Department of
          Primary Industries. Brisbane. 31 p.
     3.   Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press
          Limited. England. 236 p.
     4.   Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland
          University of Technology Printing Unit Garden's Point Campus.
          Queensland. 80p.
     5.   Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture.
          Cambridge University Press. London. 178 p.
     6.   Ganapathi, T.R., N.S. Higgs, P.J. Balint-Kurti, C.J. Arntzen, G.D May, and
          7 J.M. Van Eck, 2001. Agrobacterium -mediated transformation of
          embryogenic cell suspensions of the banana cultivar Rasthali (AAB). Plant
          cell reports (2001) 20: 157-162.
     7.   George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture.
          Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd.,
          Basingstoke, England. 546p.
     8.   Green, E.F. D.A. Somers, W.p. Hackett & D.P. Biesboer, 1987. Plant tissue
          and cell culture. Alan R. Liss, Inc. New York. 509 p.
     9.   Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. In vitro plant Breeding. The
          Haworth Press, Inc. New York.

..




                       BAB MEDIA KULTUR JARINGAN


2.1 Pendahuluan

Perkembangan yang sangat pesat tentang media nutrisi untuk pertumbuhan sel
tanaman dimulai sejak tahun 1960-an dan 1970-an. Nutrisi dasar untuk kultur sel
tanaman pada dasarnya mirip dengan nutrisi yang dibutuhkan oleh tanaman itu sendiri.
Namun, variasi komposisi nutrisi tergantung pada sel-sel, jaringan-jaring, organ-
organ dan protoplasma serta jenis tanaman yang akan dikulturkan. Sebelum pembuatan
nutrisi media, satu hal yang sangat penting untuk diketahui terlebih dahulu adalah
mengetahui tipe kultur yang mana yang akan digunakan, misalnya: kalus, sel, organ
atau protoplas yang akan diteliti serta tujuan akhir dari penelitian tersebut. Tipe kultur
yang berbeda akan mempunyai satu atau lebih komposisi media yang unik.
        Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bergantung
pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman menyediakan tidak hanya
unsur hara makro dan mikro, tetapi sumber karbohidrat yang pada umumnya berupa
gula menggantikan karbon yang biasanya dihasilkan dari atmosfer melalui melalui
proses fotosintesis.
       Hasil yang lebih baik dapat dijangkau/ diperoleh, bila ke dalam media tersebut
ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh. Walaupun
sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen yang tidak
jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air kelapa, yeast exstracts
dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang lebih
tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering
digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih
merupakan komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek.


2.2 Fasilitas dan Peralatan Yang Digunakan Dalam Pembuatan Media

        Peralatan yang digunakan untuk pembuatan media antara lain, adalah:
   1. Autoklaf atau dandang presto.
   2. Timbangan analitik digital.
   3. Kertas tissue, aluminium foil, plastik wrap, kertas wrap, label.
   4. Peralatan gelas untuk kultur jaringan tanaman, antara lain: botol kultur, gelas
       piala, erlenmeyer, cawan petri, gelas arloji, gelas pengaduk, gelas ukur, labu
       ukur, pipet dan lain-lain.
   5. Desikator.
   6. Unit filter disponsible.
   7. Kulkas dan freezer.
   8. Magnetik stirrer yang dilengkapi dengan hot plate.
   9. Microwave, oven atau kompor gas.
   10. Trolley atau rak dorong,
    11. pH meter atau pH stick.
    12. Vortek.
    13. Sumber air (Air sumur atau PDAM) dan sumber arus listrik.
    14. Water bath yang dilengkapi pengontrol temperatur.


2.3 Persiapan Membuat Larutan Dalam Satuan (Unit)


Konsentrasi dari satu substrat tertentu dalam media dapat digambarkan dalam variasi
satuan (unit) adalah sebagai berikut ini:


Satuan Berat digambarkan sebagai milligram per liter (mg/l atau dapat ditulis sebagai
mgL-1.
10-6 = 1,0 mg/l atau 1 part per million (ppm) atau seper juta bagian.
10-7 = 0,1 mg/l
10-9 = 0,001 mg/l atau µg/l


Satuan Konsentrasi.
Satu molar larutan (M) suatu senyawa sama dengan massa molekul dalam gram per
liter.
     1 molar (M) = massa molekul dalam g/l.
     1 mM         = massa molekul dalam mg/l atau 10-3 M.
     1 µM         = massa molekul dalam µg/l atau 10-6 M atau 10-3 mM.


Konversi dari mili molar (mM) ke mg/l.
Sebagai contoh, massa molekul auxin : 2,4 D = 221,0.
1M       larutan 2,4 D berisi 221,0 g/l.
1 mM larutan 2,4 D berisi 0,221 g/l = 221,0 mg/l
1 µM larutan 2,4 D berisi 0,000221 g/l = 0,221 mg/l


Konversi dari mg/l ke mili molar (mM)
Massa molekul CaCl2. 2H2O = 40.08 + 2 x 35..453 + 4 x 1.008 + 2 x 16 = 147.018
Massa atom: Ca = 40.08 ; Cl = 35..453 ; H = 1.008; O = 16
Jika 440 mg/l CaCl2. 2H2O akan di konversikan ke nM, maka:
                                Jumlah mg dari CaCl2. 2H2O
Jumlah mM CaCl2. 2H2O =
                                Massa molekul dari CaCl2. 2H2O

                                    440
                          =
                                  147.018

                          = 2.99 mM


Jadi 440 mg/l CaCl2. 2H2O = 2.99 mM.


2.4 Komposisi Media
Unsur hara di dalam media kultur tersusun atas beberapa komponen, sebagai berikut :
   1. Hara makro yang digunakan pada semua formulasi media kultur.
   2. Hara mikro selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media yang hanya
       menggunakan besi atau besi-kelat.
   3. Vitamin-vitamin    dan asam-asam       amino serta N organik,         umumnya
       ditambahkan dalam jumlah yang bervariasi.
   4. Sumber energi dan karbon berupa gula, merupakan keharusan, kecuali untuk
       tujuan yang sangat khusus.
   5. Persenyawaan-persenyawaan organik kompleks alamiah seperti: air kelapa,
       ekstrak ragi (yeast extract), juice pisang hijau, tauge, nanas, kentang dan
       sebagainya.
   6. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT): ada beberapa jenis, antara lain: auxin, sitokinin,
       geberelin, asam absisat, etilin dan sebagainya. ZPT merupakan komponen
       penting dalam media kultur jaringan. Jenis dan konsentrasi ZPT yang
       digunakan sangat tergantung pada jenis taman dan tujuan dari kultur tersebut.
   7. Buffer (chelating agent).
   8. Bahan Pemadat. Bahan ini digunakan untuk membuat media padat, yang biasa
       digunakan adalah agar.
   9. Arang aktif, berfungsi untuk menyerap senyawa toxic yang dihasilkan oleh
       eksplan sebagai anti oxidan juga sering digunakan untuk memacu pertumbuhan
       akar.
           LABORATORIUM DAN ORGANISASI KULTUR JARINGAN

3.1 Pendahuluan

Dalam kultur jaringan, pertumbuhan eksplan atau inokulum diusahakan dalam
lingkungan aseptik dan terkendali. Implikasi dari keadaan ini adalah bahwa setiap
langkah dalam pelaksanaanya harus dilakukan dalam laboratorium. Laboratorium yang
efektif merupakan salah satu unsur penting yang ikut menentukan keberhasilan suatu
kegiatan, baik untuk keperluan peneletian, maupun produksi. Laboratorium kultur
jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa
sehingga setiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainya, tetapi juga saling
berhubungan dan mudah dicapai.


Penataan ruangan dalam laboratorium, dikaitkan dengan langkah-langkah dalam
prosedur kultur jaringan dan alat-alat yang diperlukan. Kegiatan kultur jaringan di
dalam laboratorium, dibagi dalam 3 kelompok yaitu : (1) Persiapan media dan bahan
tanaman. (2) Isolasi dan penanaman. (3) Inkubasi dan penyinaran kultur.


Masing-masing kegiatan harus terpisah satu dengan lainya, dengan peralatan yang
tersendiri, karena kegiatan-kegiatan tersebut, maka ruangan yang dibutuhkan adalah :
      1.    Ruang persiapan dan ruang stok
      2.    Ruang isolasi dan penanaman.
      3.    Ruang kultur.
      4.    Ruang kantor.
      5.    Ruang mikroskop atau ruang analisa.


Ruang kultur biasanya merupakan ruang yang terbesar dari ruang laboratorium dan
harus dipikirkan kemungkinan perluasan. Ruang persiapan dan ruang transfer
tergantung dari jumlah dan besar alat-alat, sedangkan ruang stok merupakan ruangan
terkecil dan tergantung dari macam pekerjaan, kadang-kadang dibutuhkan ruang
mikroskop dan/atau ruang analisa. Ukuran tiap ruangan sangat tergantung dari: a. alat-
alat yang dipergunakan; b. jumlah personalisa yang terlibat; c. tujuan pekerjaan; d.
kapasitas produksi; e. biaya yang tersedia.
Ruangan laboratorium harus dijaga tetap bersih, serta bebas dari hewan kecil seperti
tikus dan insek (lalat, semut, kecoa dan lain-lain). Sarana dasar seperti : aliran listrik
yang cukup, air yang lancar, dan gas (untuk autoklaf manual/dandang presto),
merupakan perlengkapan yang dapat dikatakan harus dimiliki.


Ruang ini merupakan bagian pusat kegiatan laboratories dimana sebagian besar
aktifitas kegiatan dikerjakan diruang ini. Aktifitas-aktifitas yang dikerjakan disini
antara lain mempersipakan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan,
sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium dan tempat menyimpan alat-alat gelas.
Fasilitas yang dibutuhkan dalam ruangan ini adalah meja tempat meletakkan alat-alat
pemanas, meja untuk alat-alat timbang, meja untuk bekerja dan tempat mencuci.


Persiapan media meliputi penimbangan bahan, pengenceran media, penuangan ke
dalam wadah kultur dan sterilisasi. Persiapan bahan tanaman meliputi pencucian
kotoran-kotoran dari lapangan, pembuangan dan pemotongan bagian-bagian yang tidak
diperlukan serta perlakuan awal untuk mengurangi sumber kontaminasi yang ada pada
permukaan bahan tanaman.


Peralatan yang diletakkan dalam ruangan ini terdiri dari :
   1. Timbangan analitik timbangan makro.
   2. Refrigerator , Freezer dan desikator.
   3. Hot plate yang dilengkapi stirrer atau kompor gas
   4. Stirrer dengan magnetic stirrer.
   5. Autoklaf vertical atau horizontal.
   6. Microwave oven.
   7. pH meter.
   8. agar dispenser.
   9. Oven.
   10. Destiltor
   11. Water bath yang dilengkapi pengatur temperatur
   12. Centrifuge dan Vortex
   13. Alat-alat gelas standard, antara lain: labu takar berbagai ukuran, pipet biasa dan
       mikro pipet, erlenmeyer berbagai ukuran (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml),
       gelas piala berukuran (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml), pengaduk gelas,
       wadah kultur : botol, tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur dalam berbagai
       ukuran.
  17. Alat untuk mencuci.
  18. Rak-rak pengering.
  19. Lemari alat-alat, bahan kimia, serta bahan-bahan lain (alumunium foil, kertas
       timbang, karet gelang dan sebagainya).
  20. Alat-alat kecil: spatula, pisau , scalpel dan pinset.
  21. Fume hood (ruang asam)
  22. Hood tempat penimbangan bahan-bahan yang carcinogenic.
  23. Kereta dorong (cart) untuk memudahkan pemindahan alat-alat dan media dari
       ruang satu ke ruang lainnya.


                                  DESIKATOR
Gambar 7. Desikator ini di isi dengan silica gel yang berperan untuk menjaga agar
           ruangan dalam desikator tetap kering. Selanjutnya angsang dipasang di
           atas silica gel yang digunakan untuk menyimpan Zat pengatur tumbuh
                                                                o
            dan vitamin yang harus disimpan pada suhu ≤ 5 C . Pinggiran bibir
            desikator tersebut diolesi vaselin baru penutupnya ditutup dan desikator
            tersebut siap dimasukkan ke dalam freezer untuk disimpan.

 Tata Tertib Dan Keselamatan Kerja di Dalam Laboratorium Kultur Jaringan
      Jumlah orang yang di dalam ruangan kultur jaringan usahakan sesedikit
       mungkin atau yang berkepentiangan saja, usahakan tidak sampai berjubel-
       jubel.
      Usahakan ruangan selalu bersih dari barang-barang yang kotor, barang yang
       kotor usahakan untuk segera dicuci atau dibersihkan.
      Tidak diperkenankan menyimpan atau melakukan kegiatan makan dan minum
       di Ruang penabur/ steril dan ruang inkubator
      Pastikan sebelum meninggalkan ruang inkubator pintu inkubator dalam
       keadaan tertutup rapat.
      Semua bahan kimia yang masih baru dan akan dibuka harus diberi label:
       inisial nama pembuka dan tanggal dibukanya tutup segel tersebut. Begitu juga
       bila menyimpan larutan kimia atau larutan stok yang baru dibuat, harus diberi
       label: Nama senyawa, konsentrasi dan tanggal dibuat lalutan.
   Hati-hati dalam membuang pecahan pipet pastur, peralatan gelas, bekas jarum
    suntik, sebaiknya diletakkan dalam wadah tersendiri yang aman dari jangkauan
    orang.
   Hemacytometer harus dicuci menggunakan alkohol 70% dan dibungkus
    sebelum disimpan, jangan ditinggalkan disembarang tempat.
   Usahakan bersihkan tempat kegiatan (meja) dari tumpahan cairan atau serpihan
    bahan tanam atau media dengan menggunakan alkohol 70% dan jangan
    meninggalkan meja dalam keadaan kotor, pastikan selesai tepat pada waktunya,
    sehingga tidak merepotkan orang yang akan bekerja setelah anda.
   Jangan lupa mengisi buku kerja lab yang telah tersedia di lab. Apa yang telah
    dikerjakan pada hari, tanggal dan jam tersebut.
   Jangan menggunakan pipet yang masih tertutup kapas, pastikan kapas dibuka
    terlebih dahulu sebelum digunakan.
   Letakan semua peralatan yang telah digunakan dan telah dicuci pada tempatnya
    bila tidak tahu atau tidak dapat meletakkan pada tempatnya, bertanyalah atau
    minta tolonglah kepada laboran untuk membantunya.
   Ruang di dalam kulkas sangat terbatas, aturlah tempat media anda sehingga
    tidak memenuhi isi kulkas.
   Usahakan jangan menggunakan larutan stok orang lain tanpa permisi, bila ingin
    menggunakannya hendaknya bertanya dan minta izin terlebih dahulu.
   Tekan off laminar air flow setelah selesai kegiatan dan tekan on pada lampu
    UV setelah meja LAF dibersihkan.
   Usahakan seminimal mungkin membuka dan menutup ruang incubator.
   Sebelum bekerja bila menggunakan sarung tangan jangan lupa sarung tangan
    disemprot menggunakan alcohol 70% atau spiritus. Bila tidak menggunakan
    sarung tangan maka telapak tangan harus dilap dengan alcohol 70% atau
    disemprot spiritus terhebih dahulu sebelum bekerja.
   Pastikan semua peralatan seperti skalpei, pinset, cawan Petri, botol kultur
    disemprot menggunakan alcohol 70% atau spiritus.
   Bila kultur terkontaminasi, kuiltur tersebut segera dikeluarkan dari ruang
    incubator dan tutup aluminium foil tidak diperkenankan dibuka diruang
    inkubator tersebut.
                      Pemakaian Alat dan Instrument Lab
   Pastikan bila anda tahu cara mengoperasikannya, bila belum tahu tata caranya
    mintalah bantuan kepada laboran untuk membantu anda.


                     Penggunaan Timbangan Analitik/mikro
   Pintu dorong timbangan pastikan tertutup bila timbangan tidak digunakan.
   Setelah menimbang, bersihkan piringan timbangan dan ruangan disekitar
    piringan dengan menggunakan kuas atau sikat. Jangan pernah membebani
    piringan jika timbangan tidak digunakan.
   Tidak boleh menimbang barang melebihi 100 gram atau kapasitas untuk
    timbangan mikro.


                            Penggunaan pH Meter
   Letakan pH-meter pada keadaan standby on jika tidak dipakai; jangan ditekan
    off.
   Siramlah electrode dengan aquadest perlahan sebelum digunakan. Siramlah
    electrode dengan aquadest kembali sesudah digunakan dan letakan pada
    silinder kembali.
   Jangan dibiarkan elektrode diluar larutan pada waktu yang lama.





    Ruang stok sangat diperlukan untuk menyimpan larutan stok makronutrien,
    mikronutrien, senyawa khelat (Fe-EDTA), vitamin dan zat pengatur tumbuh.
    Pada skala laboratories ruang stok cukup kulkas (refrigerator), freezer, akan
    tetapi untuk skala industri dibutuhkan ruangan yang lebih besar, sehingga
    ruang ini berupa kamar yang berukuran sesuai kebutuhan, misalnya berukuran
    3 x 3 x 3 m3 .
   Untuk meningkatkan efisiensi kerja dalam pelaksanaan kultur jaringan,
    keperluan dalam tiap tahapan kerja sudah direncanakan terlebih dahulu.
    Sebelum pekerjaan penanaman baru dan subkultur rutin dilakukan, media
    tumbuh sudah dipersiapkan minimum 3 hari sebelum diperlukan. Media-media
       yang dipersiapkan ini harus disimpan di ruang yang dingin dan gelap. Ruang
       untuk penyimpanan media-media yang disediakan ini disebut ruang stok.
       Ruang stok harus berhubungan langsung 2 arah, satu arah dengan ruang
       persiapan dan arah lain dengan ruang transfer. Kebersihan ruangan harus
       diperhatikan. Tidak ada alat-alat yang diletakkan dalam ruang stok, Hanya
       perlu rak-rak untuk meletakkan media. Larutan stok yang sudah mengalami
       pengendapan atau terkontaminasi sebaiknya tidak digunakan lagi dan segera
       dikeluarkan dari ruang stok supaya tidak memenuhi ruangan.


                          RUANG ISOLASI DAN PENANAMAN
      Ruang isolasi sering diistalahkan dengan ruang steril atau ruang tabur. Ruangan
       ini untuk skala laboratories biasanya tidak begitu luas karena biasanya berisi
       satu laminar air flow yang diperuntukkan untuk seorang atau dua orang bekerja
       di dalamnya, akan tetapi untuk skala industri ruangan ini biasanya luas atau
       sangat luas tergantung berapa kapasitas orang yang bekerja sacara bersama-
       sama seperti gambar dibawah ini.
      Ruang penabur harus selalu terjaga kebersihannya atau kesterilannya. Setiap
       akan dan selesai kegiatan penanaman eksplan selalu dibersihkan dan disterilkan
       menggunakan alcohol 70% atau spiritus, terutama pada meja laminar air flow,
       sedangkan lantai dan dinding ruangan dibersihkan dengan larutan pembersih
       lantai yang dilengkapi oleh desinfektan.
      Di dalam ruangan Laminar air flow biasanya dilengkapi dengan lampu UV
       untuk sterilisasi ruangan di dalam LAF tersebut. Alat-alat yang selalu tersedia
       di dalam ruangan penabur selain LAF, adalah lampu Bunsen, hand sprayer,
       peralatan untuk isolasi eksplan yang sudah disterilkan dan rak dorong.


       Teknik kultur jaringan akan berhasil sukses bila dikerjakan di dalam
laboratorium yang bersih dan steril, ruangan yang kering dan dilengkapi untuk
memproteksi spora udara dari mikroorganisme. Sangat dianjurkan ruangan selalu
bebas dari debu, sebelum melakukan segala aktifitas. Kultur jaringan tanaman harus
diinkubasikan di bawah kondisi temperatur, pencahayaan, fotoperiode, kelembaban
dan sirkulasi udara yang terkontrol.
       Ruang inkubasi kultur biasanya merupakan ruang besar dengan kemungkinan
perluasan bila diperlukan. Pertambahan kultur terjadi secara periodik disebabkan
pertumbuhan satu jenis atau penambahan jenis kultur baru. Kultur yang tumbuh dan
telah memperbanyak diri, secara teratur harus disubkultur. Tergantung dari jenis
tanaman dan besarnya wadah kultur, subkultur dapat dilakukan setiap 4-6 minggu
sekali. Hal ini berarti tiap bulan ada pelipatan jumlah kultur.
       Botol kultur, biasa diatur pada rak-rak terbuka yang bersusun untuk
menghemat area. Jarak antara tiap lapisan rak pada umumnya 40-50 cm. Jarak antara
rak harus diatur sedemikian rupa sehingga memudahkan lalu lintas pemeriksaan kultur.
Di dalam ruang kultur pada keadaan tersusun di rak, lingkungan fisik pertumbuhan
diatur sedemikian rupa sehingga mendukung pertumbuhan yang optimal. Studi yang
sistematik tentang efek lingkungan ruang kultur untuk tiap tahap pertumbuhan eksplan,
sangat jarang dilakukan. Namun secara garis besar, ruang kultur harus mempunyai
pengaturan terhadap temperatur dan cahaya.
       Eksplan memang sudah dipenuhi kebutuhan karbohidrat dari gula dan media,
sehingga cahaya untuk keperluan fotosintetis tidak begitu mendesak, tetapi cahaya
amat penting untuk pengendalian perkembangan eksplan. Unsur-unsur dari cahaya
yang perlu diperhatikan adalah kwalitas cahaya, panjang penyinaran, dan intensitas
cahaya. Temperatur ruang kultur juga menentukan respon fisiologi kultur dan
kecepatan pertumbuhannya.
       Kualitas cahaya. Cahaya putih merupakan cahaya yang baik untuk
pertumbuhan kultur. Lampu fluorescent biasa digunakan sebagai sumber cahaya dalam
ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik dan sangat
efisien dalam penggunaan energi bila dibandingkan dengan lampu pijar. Bentuk lampu
memungkinkan penyebaran cahaya yang baik, dengan panas yang dikeluarkan relatif
rendah. Pada lampu pijar, hampir 90 persen merupakan energi panas sehingga
mempengaruhi temperatur ruangan. Kadang-kadang pada kultur tertentu, campuran
cahaya dari lampu pijar dan fluorescent memberi pertumbuhan yang lebih baik.
       Intensitas cahaya. Intensitas cahay yang baik dari lampu fluorescent adalah
antara 1000-400 ft-c (1000-4000 lux). Murashige menyatakan bahwa pengaruh
penyinaran dalam pertumbuhan asparagus, Gerbera, dan Saxifraga secara in vitro, yang
terbaik dalah 1000 ft-c untuk multiplikasi tunas, dan 300-1000 ft-c untuk perakaran
tunas. Intensitas cahaya diatur dengan menempatkan jumlah lampu dengan kekuatan
tertentu pada jarak antara 40-50 cm dari tabung kultur, untuk luas area tertentu.
       Panjang penyinaran. Total cahaya yang dibutuhkan suatu tanaman
merupakan fungsi dari periode penyinaran. Berapa lama cahaya harus diberikan,
tergantung dari jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Ada kultur yang
membutuhkan penyinaran terus-menerus, tapi banyak juga penelitian yang
memperoleh hasil bahwa penggunaan panjang penyinaran selama 14-16 jam
memberikan hasil yang baik. Pada tanaman tertentu membutuhkan penyinaran 10 jam,
dan sebagainya. Panjang penyinaran diatur dengan alat automatic time switch atau
lebih umum disebut timer.
       Temperatur. Temperatur di dalam ruang kultur diharapkan dapat diatur. Bila
dapat, temperatur antara periode gelap dan terang diatur berbeda sehingga proses
fisiologis yang diinginkan dapat terjadi. Banyak laporan menyatakan bahwa
temperatur yang baik untuk pertumbuhan tanaman dalam in vitro antara 25-280 C yang
merupakan suhu ruangan normal. Beberapa perlakuan khusus kadang-kadang
membutuhkan suhu yang rendah, misalnya untuk pengumbian pada kultur kentang,
suhu yang diperlukan adalah 18-20o C. Suhu ruangan di negara tropis dapat diturunkan
dengan pemasangan AC. Pemakain AC mutlak, karena ruang kultur merupakan ruang
tertutup yang sedikit sekali mempunyai aliran udara bebas.
       Alat-alat yang diperlukan dalam ruang kultur adalah :
       1. Rak-rak kultur 3-4 tingkat dengan lampu fluorescent atau lampu TL.
       2. Timer untuk mengatur lama penyinaran.
       3. AC dan remote untuk mengatur temperature.
       4. Mikroskop binokuler dan mikroskop inverted.
       5. Alat-alat penunjang (kertas millimeter, penggaris, alat pembesar, dan
           sebagainya).
       6. Shaker horizontal dan fermentor.
       7. Tangga-tangga pendek untuk keperluan memeriksa kultur di rak yang
           tinggi.
            Gambar 11. Timer untuk pengaturan Lamanya lampu nyala dan mati.




Dalam penelitian kultur jaringan, reaksi suatu kultur terhadap media perlakuan harus
diikuti sejak awal inisiasi. Untuk membedakan struktur yang terbentuk pada awal
perkembangan, diperlukan bantuan mikroskop. Untuk keperluan ini diperlukan
stereoscope maupun inverted microscope.
       Penelitian yang lebih canggih seperti protoplast fusion, micro-injection DNA
atau organel ke dalam sel, memerlukan mikroskop dengan micro-manipular. Alat-alat
mikroskop ini memerlukan ruang khusus yang kering dan bersih yang dilengkapi air
conditioning sehingga kelembapan dan suhu ruangan dapat terkontrol. Dalam ruangan
ini diletakkan alat-alat seperti : mikroskop yang dilengkapi kamera, gelas preparat dan
penutup, homeositometer, AC dan termohigrometer.




1.    Bhojwani & Razdan, 1983. Plant Tissue Culture: Theory and Practise.
2.    Debergh & Zimmerman, 1990. Micropropagation: Technology & Application.
3.    Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge
      University Press. London. 178 p
4.    Evan, Sharp, Amminoto & Yamada., 1983/1984. Handbook of Plant Cell
      Culture (Vols 1 – 4).
5.    George, 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: Part 1 The Technology,
      Exegetics, London.
6.    Green, Somers, Hacket & Biesboer, 1987. Plant Tissue and Organ Culture.
7.    Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
      Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.
      Bogor.
8.    Kantharajah, A.S., -. Plant tissue culture and crop improvement laboratory
      manual. Indonesia Australia Eastern Universities Project. Universitas Mataram.
      Mataram.
9.    Pierik, 1987. In vitro Culture of Higher Plants.
10.   Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. In vitro plant Breeding. The
      Haworth Press, Inc. New York.
11.   Thorpe, 1981. Plant Tissue Culture: Methods & Applications in Agriculture.
12.   Torres, 1989. Tissue Culture techniques for Horticultural Crops.
13.   Trigiano, R.N. & D.J. Gray, 2000. Plant Tissue culture concepts and laboratory
      exercises. 2nd Adt. CRC Press. New York.




                                   PENDAHULUAN


        Perkembangan yang sangat pesat tentang media nutrisi untuk pertumbuhan sel
tanaman dimulai sejak tahun 1960-an dan 1970-an. Nutrisi dasar untuk kultur sel
tanaman pada dasarnya mirip dengan nutrisi yang dibutuhkan oleh tanaman itu sendiri.
Namun, variasi komposisi nutrisi tergantung pada sel-sel, jaringan-jaring, organ-
organ dan protoplasma serta jenis tanaman yang akan dikulturkan. Sebelum pembuatan
nutrisi media, satu hal yang sangat penting untuk diketahui terlebih dahulu adalah
mengetahui tipe kultur yang mana yang akan digunakan, misalnya: kalus, sel, organ
atau protoplas yang akan diteliti serta tujuan akhir dari penelitian tersebut. Tipe kultur
yang berbeda akan mempunyai satu atau lebih komposisi media yang unik.
        Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bergantung
pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman menyediakan tidak hanya
unsur hara makro dan mikro, tetapi sumber karbohidrat yang pada umumnya berupa
gula menggantikan karbon yang biasanya dihasilkan dari atmosfer melalui melalui
proses fotosintesis.
       Hasil yang lebih baik dapat dijangkau/ diperoleh, bila ke dalam media tersebut
ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh. Walaupun
sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen yang tidak
jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air kelapa, yeast exstracts
dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang lebih
tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering
digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih
merupakan komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek.


Fasilitas dan Peralatan Yang Digunakan Dalam
Pembuatan Media

       Peralatan yang digunakan untuk pembuatan media antara lain, adalah:
   15. Autoklaf atau dandang presto.
   16. Timbangan analitik digital.
   17. Kertas tissue, aluminium foil, plastik wrap, kertas wrap, label.
   18. Peralatan gelas untuk kultur jaringan tanaman, antara lain: botol kultur, gelas
       piala, erlenmeyer, cawan petri, gelas arloji, gelas pengaduk, gelas ukur, labu
       ukur, pipet dan lain-lain.
   19. Desikator.
   20. Unit filter disponsible.
   21. Kulkas dan freezer.
   22. Magnetik stirrer yang dilengkapi dengan hot plate.
   23. Microwave, oven atau kompor gas.
   24. Trolley atau rak dorong,
   25. pH meter atau pH stick.
   26. Vortek.
   27. Sumber air (Air sumur atau PDAM) dan sumber arus listrik.
   28. Water bath yang dilengkapi pengontrol temperatur.


Persiapan Membuat Larutan Dalam Satuan (Unit)


Konsentrasi dari satu substrat tertentu dalam media dapat digambarkan dalam variasi
satuan (unit) adalah sebagai berikut ini:
Satuan Berat digambarkan sebagai milligram per liter (mg/l atau dapat ditulis sebagai
mgL-1.
10-6 = 1,0 mg/l atau 1 part per million (ppm) atau seper juta bagian.
10-7 = 0,1 mg/l
10-9 = 0,001 mg/l atau µg/l


Satuan Konsentrasi.
Satu molar larutan (M) suatu senyawa sama dengan massa molekul dalam gram per
liter.
     1 molar (M) = massa molekul dalam g/l.
     1 mM         = massa molekul dalam mg/l atau 10-3 M.
     1 µM         = massa molekul dalam µg/l atau 10-6 M atau 10-3 mM.


Konversi dari mili molar (mM) ke mg/l.
Sebagai contoh, massa molekul auxin : 2,4 D = 221,0.
1M       larutan 2,4 D berisi 221,0 g/l.
1 mM larutan 2,4 D berisi 0,221 g/l = 221,0 mg/l
1 µM larutan 2,4 D berisi 0,000221 g/l = 0,221 mg/l


Konversi dari mg/l ke mili molar (mM)
Massa molekul CaCl2. 2H2O = 40.08 + 2 x 35..453 + 4 x 1.008 + 2 x 16 = 147.018
Massa atom: Ca = 40.08 ; Cl = 35..453 ; H = 1.008; O = 16
Jika 440 mg/l CaCl2. 2H2O akan di konversikan ke nM, maka:


                                  Jumlah mg dari CaCl2. 2H2O
Jumlah mM CaCl2. 2H2O =
                                  Massa molekul dari CaCl2. 2H2O

                                      440
                              =
                                   147.018

                              = 2.99 mM


Jadi 440 mg/l CaCl2. 2H2O = 2.99 mM.
Komposisi Media
Unsur hara di dalam media kultur tersusun atas beberapa komponen, sebagai berikut :
   10. Hara makro yang digunakan pada semua formulasi media kultur.
   11. Hara mikro selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media yang hanya
       menggunakan besi atau besi-kelat.
   12. Vitamin-vitamin    dan asam-asam      amino serta N organik,         umumnya
       ditambahkan dalam jumlah yang bervariasi.
   13. Sumber energi dan karbon berupa gula, merupakan keharusan, kecuali untuk
       tujuan yang sangat khusus.
   14. Persenyawaan-persenyawaan organik kompleks alamiah seperti: air kelapa,
       ekstrak ragi (yeast extract), juice pisang hijau, tauge, nanas, kentang dan
       sebagainya.
   15. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT): ada beberapa jenis, antara lain: auxin, sitokinin,
       geberelin, asam absisat, etilin dan sebagainya. ZPT merupakan komponen
       penting dalam media kultur jaringan. Jenis dan konsentrasi ZPT yang
       digunakan sangat tergantung pada jenis taman dan tujuan dari kultur tersebut.
   16. Buffer (chelating agent).
   17. Bahan Pemadat. Bahan ini digunakan untuk membuat media padat, yang biasa
       digunakan adalah agar.
   18. Arang aktif, berfungsi untuk menyerap senyawa toxic yang dihasilkan oleh
       eksplan sebagai anti oxidan juga sering digunakan untuk memacu pertumbuhan
       akar.




                      Macam-macam Formulasi Media Kultur


       Formulasi media kultur jaringan pertama kali dibuat berdasarkan komposisi
larutan yang digunakan untuk hidroponik, khususnya komposisi unsur-unsur
makronya. Unsur-unsur hara diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik.
Koposisis media dan perkembangan formulasinya didasarkan pada jenis jaringan,
organ dan tanaman yang digunakan serta pendekatan dari masing-masing peneliti.
Beberapa jenis sensitif terhadap konsentrasi senyawa makro tinggi atau membutuhkan
zat pengatur tertentu untuk pertumbuhannya. Pada periode tahun 1930an, formulasi
media terutama ditujukan untuk menumbuhkan akar, tuber dan kambium. Media untuk
penumbuhan akar yang dikembangkan oleh White (1934 dalam Gunawan 1988),
pertama White menggunakan media yang berisi garam anorganik, yeast ekstrak dan
sucrose, tetapi kemudian yeast ekstrak digantikan dengan 3 macam vitamin B, yaitu
pyridoxine, thiamine dan nicotinic acid (Chawla, 2002).
         Kultur kalus biasanya ditumbuhkan pada media dengan konsentrasi garam-
garam yang rendah seperti dalam kultur akar. Nobecourt (1937) dalam George &
Sherrington, 1984), menggunakan setengah konsentrasi dari larutan Knop yang biasa
digunakan untuk hidroponik, digunakan juga untuk menumbuhkan kalus wortel. Pada
media Knop sumber karbon berupa glucosa dan dan vitamin berupa cysteine
hydrochloride. Media White juga dikembangkan oleh Hildebrant dkk (1946 dalam
Gunawan 1988), dengan memodifikasi unsur-unsur makro yang lebih tinggi
dibandingkan pada media kultur tembakau, media ini media ini digunakan
mengkulturkan jaringan tumor tembakau dan bunga matahari. Konsentrasi untuk NO3-
    +
K       lebih tinggi dibandingkan pada media White, namun konsentrasi tersebut masih
lebih rendah dibandingkan media yang lain yang banyak digunakan pada kultur
jaringan sekarang, sedangkan kandungan unsur P, Ca, Mg dan S pada media tumor
matahari, sama dengan media untuk jaringan tanaman pada umumnya seperti pada
media yang dikembangkan sekarang. Perbaikkan formulasi media yang penting adalah
pengembangan unsur makro yang universal, untuk mendukung pertumbuahan jaringan
tumbuhan. Dalam media perlu ditambahkan ammonium dengan meningkatkan
konsentrasi NO3- dan K +.
         Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur
kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah
seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine,
thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dodds and Roberts, 1983).
          Media White dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan
tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut,
lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S
pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan
normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan
Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-
media lain yang umum digunakan sekarang.
       Media Knudson dan media Vacin and Went, media ini dikembangkan
khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan
baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun
1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik
untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata
dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.
      Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup
tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan
ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang
menurun. Mereka mengambil           kesimpulan, bahwa NH4+         sangat   menunjang
pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, (1956 dalam Gunawan 1988).
      Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor
tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan
ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan
yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama
dengan yang dikembangkan oleh Miller (Wood & Braun (1961 dalam Gunawan 1988).
      Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan perbaikan komposisi
media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan
optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam
bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi
dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau
Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan
sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya
dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk
kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur
jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan
kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-
media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media :
      1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur
         makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya
         10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625
         mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan
         oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan
         juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta
         Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur
         anther.
      2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam
         Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara
         mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.
      3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan
         konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk
         Bougainvillea glabra.
       Senyawa-senyawa     di    dalam   media   MS    dapat   terjadi   pengendapan
persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang
mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah
Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur
C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari
Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur
tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi
jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi
pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi
sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap.
       Media Gamborg B5 (media B5) pertama kali dikembangkan untuk kultur
kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media
MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta
sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada
masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan
dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena
konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat
yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM
(Gamborg et al, 1968).
       Media Schenk & Hildebrant (media SH) merupakan media yang juga cukup
terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil (Trigiano & Gray, 2000).
Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada
media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih
tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman
dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh
dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk
pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman
tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman
legume.
       Media WPM (Woody Plant Medium) yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc
Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah
dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan
oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM.
Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan
perdu dan pohon-pohon.
     Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media
perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara
esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan
dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada umumnya
diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam
kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya. Beberapa media dasar
yang banyak digunakan antara lain:
       1. Media dasar Murhasige dan skoog (1962) yang dapat digunakan untuk
          hampir semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceous.
       2. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain.
       3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman
          tomat.
       4. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur jaringan
          anggrek.
       5. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung
          sari (pollen) dan kultur sel.
                 6. Media dasar schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok
                     untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil.
                 7. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM)
                 8. Media N6 untuk serealia terutama padi.


                 Dari sekian banyak media dasar yang paling sering dan banyak digunakan
          adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur
          tertentu, kombinasi zat kimia dari murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi
          konsentrasinya yang diubah. Sebagai contoh media ½ MS, berarti konsentrasi
          persenyawaan yang digunakan adalah setengah konsentrasi media MS. Tabel 2.
          memperlihatkan sususnan persenyawaan dalam beberapa komposisi media dasar.

                                       Resep Formulasi Media


                           Tabel 2. Komposisi medium dasar kultur jaringan.
                                                                                                Shenk
                    Nitsch                                                     Vacin               &
                                                                                       Knud            Gres
               Knop   &         MS      B5      N6     White Heller WPM         &               Hilde
 Bahan Kimia                                                                           son C            &D
               mg/l Nitsch      Mg/l    Mg/l    mg/l   mg/l mg/l    mg/l       Went             brandt
                                                                                        mg/l             mg
                     mg/l                                                      mg/l                mg/
                                                                                                     l
(NH4)2SO4       -         -      -      134     463       -       -       -     500      500       -     20
NH4 NO          -       720    1650      -       -        -       -     400       -       -        -    10
NH4H2P O4       -         -      -       -       -        -       -       -       -       -       300    30
NaNO3           -         -      -       -       -        -     600       -       -     1000       -       -
Na2HPO4. H2O    -         -      -       -       -        -       -       -       -       -        -      3
NaH2PO4         -         -      -       -       -        -       -       -       -       -        -      9
KNO3           250      950    1900    2500    2830      80       -       -     525       -      2500      -
Ca(NO3)2.4H2O 1000        -      -       -       -      300       -     576       -       -        -       -
CaCl2 . 2H2O    -       166     440     150     166       -      75      96     250       -       200    15
MgSO4 . 7H2O   250      185     370     250     185     720     250     370     250      250      400    25
KH2 PO4        250       68     170      -      400       -     125     170       -      250       -       -
NaH2PO4 . H2O   -         -      -      150      -      16.5      -       -       -       -        -       -
Na2SO4          -         -      -       -       -      200       -       -       -       -        -       -
Fe2(SO4)3       -         -      -       -       -       2.5      -       -       -       -        -       -
FeSO4 . 7H2O    -       27.8   27.8    27.8    27.2       -       -     27.8      -     25.0     15.0    27
FeCl3. 6H2O     -         -      -       -       -        -      1.0      -       -       -        -       -
Fe2 Tartrat     -         -      -       -       -        -       -       -     28.0      -        -       -
Na2EDTA         -       37.3   37.3    37.3    37.2       -       -     37.3      -       -      20.0    37
MnSO4 . 4H2O    -         -    22.3      -      4.4      7.0    0.01    22.3     7.5     7.5     10.0    10
MnSO4 . H2O     -       18.9     -     10.0      -        -       -       -       -                -       -
ZnSO2 . 7H2O    -       10.0    8.6     2.0     1.5      3.0     1.0     8.6      -    0.331      1.0     3.
H3BO3            -     10.0     6.2     3.0    1.6       1.5       1.0    6.2     -      0.056     5.0    3.
KI               -      -      0.83    0.75    0.8      0.75      0.01     -      -        -      1.03   0.7
KCl              -      -        -       -      -        65       750      -      -        -        -      -
Na2MoO4 .
                 -     0.25    0.25    0.25     -         -        -      0.25    -      0.026    0.1    0.2
2H2O
CuSO4 . 5H2O     -    0.025 0.025 0.025   -     -    0.03   -     -   0.040  0.2                          0.2
CoCl2 . 6H2O     -       -  0.025 0.025   -     -      -    -     -     -    0.1                          0.2
NiCl2. 6H2O      -       -    -      -    -     -    0.03   -     -     -     -                             -
AlCl3            -       -    -      -    -     -    0.03   -     -     -     -                             -
Biotin           -     0.05   -      -    -     -      -    -     -     -     -                             -
Myi-inositol     -     100   100   100    -     -      -   100    -     -    100                          10
Niacin           -      5.0  0.5    1.0  0.5   0.5     -   0.5    -     -    5.0                           0.
Pyridoxine-HCl   -      0.5  0.5    1.0  0.5   0.1     -   0.5    -     -    0.5                           0.
Thiamine-HCl     -      0.5  0.1   10.0  1.0   0.1    1.0   -     -     -    5.0                           1.
Glycine          -      2.0  2.0     -   2.0   3.0     -    -     -     -     -                             -
Folic acid       -      0.5   -      -    -     -      -    -     -     -     -                             -
Sucrosa          -    20000 30000 20000 50000 20000 20000 20000 20000 20000 30000                        200
Ca D-                                                             -     -     -                             -
                 -       -    -      -    -    1.0     -    -
pantothenat
Adenin           -       -       -       -      -         -        -       -      -           -   67.5     -

             Tabel 3. Berat atom Unsur-Unsur yang Sering Digunakan dalam Kultur Jaringan
                                                                         Simbol       Berat
                                                     Nama Unsur
                                                                         Unsur        Atom
                                               Hidrogen
                                                                           H           1.00
                                               (Hydrogen)
                                               Karbon (Carbon)             C          12.01
                                               Oksigen (Oxygen)            O          16.00
                                               Boron                       B          11.00
                                               Kapur (Calcium)            Ca          40.08
                                               Khlor (Chlorine)            Cl         35.50
                                               Kobalt (Cobaltum)          Co          58.93
                                               Tembaga
                                                                          Cu          63.54
                                               (Cupprum)
                                               Iod (Iodium)                I          126.90
                                               Besi (Ferrum)               Fe         55.84
                                               Magnesium                  Mg          24.31
                                               Mangan
                                                                          Mn          54.94
                                               (mangaanium)
                                       Molybdenium            Mo          95.94
                                       Nitrogen                N          14.00
                                       Fosfor
                                                               P          30.97
                                       (Phosphorus)
                                       Potassium
                                                               K          39.10
                                       (Kalium)
                                       Sodium (Natrium)       Na          22.99
                                       Belerang (Sulfur)       S          32.06
                                       Seng (Zincum)          Zn          65.37
                                       * Umumnya dibulatkan ke angka satuan
       terdekat


                                Pembuatan Media


       Dewasa ini beberapa media kultur jaringan dapat dibeli dalam bentuk bubuk
yang telah dipersiapkan. Tergantung dari jenisnya, ada yang hanya mengandung garam
makro dan mikro serta vitamin, ada juga yang lengkap sampai hormon dan gula.
Formula ini memang memudahkan pekerjaan, tapi untuk suatu penelitian yang
memerlukan perubahan komposisi dalam satu atau beberapa komponen, maka
pemisahan komponen-komponen penyusun media perlu dilakukan.
       Dalam pembuatan media, langkah pertama adalah membuat stok dari media
terpilih. Penggunaan larutan stok menghemat pekerjaan menimbang bahan yang
berulang–ulang setiap kali membuat media. Selain itu, kadang-kadang timbangan yang
dibutuhkan untuk menimbang jumlah kecil tidak tersedia dalam laboratorium. Setiap
larutan stok dapat dipergunakan sampai 100 liter media, bahkan larutan stok mikro
dapat dipergunakan sampai 100 liter media. Larutan stok dapat disimpan ditempat
yang bertemperatur rendah dan gelap.
       Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokan dalam : Stok makro, stok
mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormone terutama bila larutan stok tidak
disimpan terlalu lama (segera digunakan habis). Stok hormone dapat disimpan antara
2-4 minggu, sedangkan stok hara dapat disimpan 4-8 minggu. Dengan adanya larutan
stok, pembuatan media selanjutnya hanya dengan teknik pengenceran dan
pencampuran saja.
                        Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah penyimpanan
                 (daya simpan) larutan. Larutan yang sudah mengalami pengendapan, tidak dapat
                 digunakan lagi. Pengendapan larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan dapat
                 dihindari dengan membuat larutan yang tidak terlalu pekat atau tidak menggunakan
                 larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan stok hanya untuk satu jenis
                 bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi simpan juga diperhatikan, karena
                 ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi atau cahaya.
                        Larutan stok kadang-kadang ditumbuhi mikroorganisme. Larutan stok yang
                 terkontaminasi mikroorganisme ini, juga tidak dapat digunakan lagi. Oleh karena itu
                 kondisi simpan harus dijaga kebersihan dan tempat (wadah) larutan harus diusahakan
                 cara-cara pembuatan larutan stok untuk media Murashige dan Skoog (1962).
                        Stok Hara Makro. Senyawa-senyawa sumber unsur hara makro diperlukan
                 dalam jumlah yang cukup besar. Oleh karena itu sebaiknya dibuat dalam larutan stok
                 tunggal. Selain itu jenis anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama,
                 kemungkinan hal tersebut akan mempercepat pengendapan larutan bila dibuat larutan
                 stok campuran. Biasanya larutan stok hara dibuat beberapa macam dan diberi nama
                 sebagai berikut :


                              Tabel 4. Pembuatan larutan stok media MS untuk skala besar.
No     Larutan stok          Kersenyawaan                Berat        Pelarut Aquadest      Konsentrasi larutan    V
                                                    persenyawaan             (ml)               stok (kali)       laru
                                                         (mg)                                                     untu
                                                                                                                  me
1           A                NH4NO3                     83500         1000                          50
2           B                KNO3                       95000         1000                          50
3           C                CaCl2.H2O                  44000         1000                         100
4           D                MgS4.H2O                  (37000+        1000                         100
                             KH2PO4                     17000)
5           E                FeSO4.7H2O                 (5570+        500                          200
                             Na2EDTA.                   7450)         500
6           F             1. MnSO4.H2O                 (3380.0+       1000                         200
     (senyawa mi kro)     2. ZnSO4.H2O                 1720.0+
                          3. H3BO3                     1240.0+
    4. KI                          1240.0+
    5. Na2MoO4.H2O                  50.0+
    6. CoCl.6H2O                    5.0+
    7. CuSO4.5H2O                   5.0)




                        Cara Pembuatan Larutan Stok


     Menimbang persenyawaan yang tertera dalam kolom tersebut misalnya
      (NH4NO3) sebanyak yang tertera dalam kolom berat senyawa misalnya
      (83500 mg).
     Bahan yang telah ditimbang, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer atau gelas
      piala bersih yang sudah berisi aquadest atau air bebas ion kira-kira 500 ml
      lalu diaduk hingga larut merata, bila jenis senyawanya banyak, masukkan
      satu senyawa diaduk hingga larut baru dimasukkan senyawa yang lain,
      begitu untuk selanjutnya).
     Larutan, kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 1 liter yang telah
      dibilas dengan aquadest dan air bilasan dituang ke dalam labu takar
      (sebaiknya bilaslah dengan 50 ml aquadest 2-3 kali). Kemudian
      ditambahkan aquadest hingga volume larutan tepat pada 1 liter. Larutan
      telah telah dibuat, dipindahkan ke dalam Erlenmeyer/botol reagent ukuran
      1 liter yang bersih, diberi label “A” atau yang lain dan ditutup rapat.
      Larutan stok yang telah jadi disimpan pada suhu kamar.
     Untuk membuat 1 liter media, dibutuhkan 20 ml untuk larutan stok A, dan
      kebutuhan larutan stok lainnya dapat dilihat dalam table 6 diatas.
                        Gb. 16. Larutan stok yang disimpan di dalam kulkas.

                  Alat-alat yang habis dipakai segera dibersihkan dan dibilas dengan
                   aquadest.
                  Khusus untuk pembuatan larutan stok E ada sedikit perbedaan karena Fe
                   dan Ca yang sulit larut. Untuk melarutkannya ada teknik khusus, yaitu
                   sebagai berikut:
                  Timbang 5570 mg FeSO4.7H2O dan 7450 mg Na2EDTA.
                  Kedua bahan tersebut dilarutkan secara terpisah dalam kira-kira 250 ml
                   aquadest, gelas piala yang digunakan volumenya 1 liter. Larutan Na2EDTA
                   dipanaskan hingga 40-60o C selama beberapa menit, kemudian tambahkan
                   larutan FeSO4.7H2O dan diaduk hingga tercampur merata. Bila masih sulit
                   larut, larutan ditambah HCl 1 N setetes demi setetes hingga larutan
                   homogen. Biarkan hingga suhu kembali ke suhu kamar.
                  Setelah mendingin, masukkan larutan campuran itu ke dalam labu ukur,
                   tambahkan aquadest hingga volume mencapai 1 liter. Setelah volume tepat
                   1 liter, pindahkan ke dalam erlenmeyer/botol reagen 1 liter yang bersih dan
                   seluruh sisinya sudah tertutup alumunium foil. Larutan stok E dapat
                   disimpan dalam kondisi suhu kamar, tetapi lebih baik disimpan dalam
                   lemari es. Karena larutan Fe ini peka terhadap cahaya, maka perlu
                   diselubungi alumunium foil pada Erlenmeyer/botol penyimpannya.




                       Tabel 5. Pembuatan Larutan stok skala laboratories
No   Larutan            Kersenyawaan               Berat per          Pelarut      Konsentrasi     Volume lar
      stok                                      senyawaan (mg)       Aquadest      larutan stok   stok untuk 1
                                                                       (ml)           (kali)         media (m
1    Makro         1. NH4NO3                        (16500+            1000             10              100
     nutrien       2. KNO3                           19000+
                   3. CaCl2.H2O                      4400+
                   4. MgS4.H2O                       3700+
                   5. KH2PO4                          1700)
2    Mikro          1. MnSO4.H2O                     (2230+            1000            100              10
     nutrien       2. ZnSO4.H2O                       860+
                    3. H3BO3                            620+
                    4. KI                               83+
                    5. Na2MoO4.H2O                      25+
                    6. CoCl.6H2O                        2,5+
                    7.CuSO4.5H2O                        2,5)
3   Fe-EDTA         1. FeSO4.7H2O                      (278+               50          20             5
                    2. Na2EDTA                          373)               50
                    Atau
                    1. NafeEDTA                         367               100
4   Vitamin         1. Glycine                          200               100          10            10
                    2. Nicotinic acid                    50
                    3. Pyridoxine HCl                    50
                    4. Thyamine HCl                      10
                    5. Myo-Inositol                    10000
5    Auxin          NAA                                  50          + 1-5 tetes    0,5 ppm/     Disimpan
                                                                     Ethanol       1ml larutan    ruang 4o
                                                                     95% hingga
                                                                     larut
                                                                     + 100 ml
                                                                     aquadest
6   Sitokinin       BAP                                  50          + <1 ml        0,5 ppm/     Disimpan
                                                                     10% KOH       1ml larutan    ruang 4o
                                                                     atau 0,1 M
                                                                     HCl
                                                                     +100 ml
                                                                     aquadest



                        Cara Pembuatan Media MS 1 L Dari Larutan Stok


         1. Erlenmeyer diisi aquadest sebanyak 600 ml dan diberi magnetic stirrer,
              tumpangkan pada alat stirrer, selanjutnya alat tersebut di on-kan.
                Tambahkan 100 ml larutan stok makronutrien.
                 Tambahkan 10 ml larutan stok mikronutrien.
                Tambahkan 10 ml larutan stok vitamin.
                Tambahkan 5 ml larutan stok Fe-EDTA.
  2. Tambahkan zat pengatur tumbuh sitokinin dan atau auxin sesuai dengan
      kebutuhan.
  3. Tambahkan sukrosa 20-30 gram L-1
  4. Tambahkan aquadest hingga 990 ml.
  5. Ukur pH 5,6-5,8.
  6. Tambahkan agar 8-10 gram L-1. Selanjutnya media dipanaskan di atas tungku
      gas atau kompor listrik. Selama pemanasan, perlu diaduk dengan teratur.
      Pemanasan segera dihentikan, bila larutan telah terlihat jernih (agar telah larut).
  7. Setelah semua media dibotolkan, tutuplah botol kultur rapat-rapat dengan
      alumunium foil atau tutup yang khusus dibuat dengan bahan yang tahan panas.
      Pada tutup tersebut, selanjutnya dibubuhkan label nama media dengan spidol
      yang tahan air dan panas.
  8. Botol kultur tersebut kemudian disterilkan ke dalam autoklaf selama 15 menit
      setelah suhu mencapai 121 oC, dan tekanan 1 atmosfer atau 15 psi.


Hal-hal yang perlu diperhatikan pada larutan stok :
       a.   Larutan stok media, sebaiknya tidak disimpan lebih dari 2 bulan sebelum
            dipergunakan.
       b.   Stok vitamin dan zat pengatur tumbuh, sebaiknya digunakan segar (kurang
            dari 2 minggu). Oleh karena itu sebelum membuat larutan stok, harus
            ditentukan dahulu kebutuhan media, jadwal pembuatan media dan semua
            sarana pembuatan media harus benar-benar sudah siap.
       b.   Larutan stok yang telah mengalami pengendapan dan yang sudah
            ditumbuhi mikroorganisme (terkontaminasi), tidak boleh digunakan lagi
            (dibuang).
       c.   Semua alat-alat gelas (alat ukur, takar, wadah) sebelum dipergunakan
            untuk membuat larutan, harus dibilas dulu dengan aquadest. Setelah
            selesai digunakan atau sebelum digunakan lagi, harus pula segera dibilas
            dengan aquadest. Bila tidak digunakan lagi, tempatkanlah pada rak
            penyimpanan secara terbalik supaya kering dan bagian dalamnya tidak
            berdebu.
Gambar 17 : PhytoTechnology Laboratories, L.L.C. Deficient Plant Tissue Culture
         Media http://www.phytotechlab.com.




Senyawa Mikro:

     Besarnya konsentrasi senyawa mikro yang digunakan sangat kecil yaitu
berukuran mikromolar, antara lain: besi (Fe), mangan (Mn), boron (Bo), tembaga (Cu),
seng (Zn), Iodine (I), molybdenum (Mo), cobalt (Co). Unsur-unsur tersebut adalah
merupakan komponen protein sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme
dan proses fisiologi.
        Penggunaan unsur mikro awalnya dilakukan oleh Knudson pada tahun 1922,
dengan menambahkan Fe dan Mn dalam media kultur untuk perkecambahan anggrek,
yang ternyata hasilnya sangat baik. Barthelot, Gautheret, dan Nobecourt pada tahun
1934-1939, menyarankan penggunaan Cu, Co, Ni, Ti dan Bo dalam media kultur.
Hildebrant dan kawan-kawannya pada tahun 1946, menyatakan kebutuhan Bo, Mn, Zn
dan Fe yang optimum, untuk pertumbuhan kalus tanaman tembakau dan bunga
matahari,sedangkan penggunaan Mo diperkenalkan oleh Buerk Holder dan Nickel.
Percobaan Heller tahun 1953 membuktikan pentingnya penggunaan unsur Fe, Bo,
Mn, Zn, dan Cu dalam media kultur wortel yang ditumbuhkan pada media Gautheret,
Heler. Zn sangat diperlukan untuk pertumbuhan akar tomat yang normal (Eltinge &
Reed, 1940 dalam George & Sherrington, 1984), sedangkan tanpa Cu, pertumbuhan
terhenti sama sekali seperti yang diulas oleh Glasstone pada tahun 1947 (George &
Sherringtone, 1984).

       Sewanya Mangan (Mn) diperlukan dalam kultur kotiledon selada untuk
memacu pertumbuhan jumlah pucuk yang dihasilkan. Mn dalam level yang tinggi
dapat mengsubstitusikan Mo dalam kultur akar tomat. Mn dapat menggantikan fungsi
Mg dalam beberapa sistem enzym tertentu seperti yang dibuktikan oleh Hewith pada
tahun 1948.
       Kekurangan Boron mengurangi laju pertumbuhan kultur sel tebu, bunga
matahari, dan wortel. Sebaliknya konsentrasi lebih tinggi dari 2 mg/l, dapat berubah
sisatnya menjadi racun dalam media kultur. Dalam beberapa species, ternyata terdapat
interaksi antara Bo dan auksin dalam pengaturan pengakaran pada percobaan setek.

       Unsur seng, Alumunium, dan Nikel, tidak banyak dipelajari efeknya terhadap
pertumbuhan kultur. Untuk seng, diketahui bahwa unsur ini dibutuhkan dalam sintesa
tryptophan, sedangkan untuk Al dan Ni belum ada bukti-bukti yang cukup yang
menyatakan bahwa unsur-unsur tersebut terlibat dalam metabolisme penting dalam sel.
Unsur Al dan Ni jarang ditambahkan dalam formulasi media, hanya Heller dan
beberapa peneliti lain yang menambahkan. Penambahan Al dan Ni pada kultur
meristem Prunus, tidak mempunyai pengaruh apa-apa.

       Iodine juga merupakan unsur yang tidak diketahui kontribusinya dalam kultur
jaringan tanaman, 65% dari komposisi media yang dikembangkan, menambahkan
unsur ini. Penambahan ini dilakukan setelah white menyatakan bahwa Iodine dapat
memperbaiki pertumbuhan akar tomat yang dikultur in vitro. Dalam media Eeuwens
yang dikembangkan pada tahun 1976 untuk kelapa, iodine yang ditambahkan 0.05
mM; nilai ini 10 kali lebih tinggi dari level yang terdapat dalam komposisi MS.



Fungsi Unsur-unsur Anorganik:

   1. Kalium (K) berperan dalam sintesa protein, penggerak beberapa enzim,
       membuka dan menutupnya stomata.
   2. Kalsium (Ca) sebagai penyusun struktur dinding sel, cofactor enzim,
       permeabilitas sel, komponen dari kalmodulin.
   3. Fosfor (P) sebagai penyusun ATP, asam nukleat, coenzim dan fosfolipid.
   4. Magnesium (Mg) penyusun molekul klorofil, membantu aktifitas enzim.
   5. Mangan (Mn) mengatur oksidasi auksin, sebagai aktifator enzim.
   6. Sulfur (S) sebagai penyusun beberapa asam amino, protein dan coenzim A.
   7. Besi (Fe) berperan dalam sintesa klorofil, cytokrom.
   8. Clorine (Cl) berperan dalam proses osmosis dan kesetimbangan ion.
   9. Tembaga (Cu) berperan dalam cofactor enzim.
   10. Zinc (Zn) berperan menahan oksidasi auksin, berguna dalam sintesa triptofan
       dan sebagai aktifator enzim.
   11. Boron (Bo) berperan mempengaruhi penggunaan kalsium.
   12. Cobalt (Co) diperlukan oleh organisme dalam memfiksasi N2.
   13. Yodium (I) berperan dalam transport auksin.




1. Vitamin
       Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman,
adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine (vitamin B6).
Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman.
      Nicotinic acid, penting keberadaannya di dalam media kultur akar tomat, ercis
dan lobak (Bonner dan Devirian, 1939), begitu juga pyroxidin diperlukan dalam kultur
akar tomat (Robbins dan Schmidt, 1939).
      Myo-inositol atau meso-inositol atau i-inositol digunakan dalam media untuk
memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis, sehingga myo-inositol dianggap sebagai
golongan vitamin untuk tanaman. Menurut Myo-inositol berperan dalam keikutsertaan
dalam lintasan biosintesa asam-D-galakturonat yang menghasilkan vitamin C dan
pectin serta kemungkinan inkorporasinya dalam fosfoinositida dan fosfatidil inositol
yang berperanan dalam pembelahan sel. Penambahan myo-inositol dengan konsentrasi
antara 20-100 mg/l pertama kali ditunjukkan oleh Jacquiot dalam kultur kambium
tanaman elm (George dan Sherringtone, 1984). Myo-inositol berpengaruh            dalam
morfogenesis kultur, misalnya dalam kultur Haworthia sp. Pembentukan pucuk dalam
Haworthia sp. tergantung dari keberadaannya myo-inositol (Kaul dan Sabharwal,
1972, 1975). Di alam Myo-inositol ditemukan dalam air kelapa, dan dalam jumlah
kecil didalam agar dipasaran. Myo-inositol juga digunakan dalam pembuatan media
Wood & Braun dan Murashige & Skoog (George dan Sherringtone, 1984).
      Pantothenic acid mempunyai peranan penting dalam pertumbuhan jaringan
   tanaman tertentu, seperti Salix sp. (Telle dan Gautheret, 1947), tidak semua jenis
   tanaman membutuhkan penambahan pantothenic acid, contohnya pada kultur
   jaringan wortel.   Vitamin E (tocopherol) yang ditambahkan ke dalam kultur
   jaringan tanaman dapat memacu pembentukan kalus friable (remah) dalam kultur
   embrio jagung sedangkan dalam kultur suspensi kedelai, merangsang penyebaran
   sel pada konsentrasi 0.95 mM (Oswald et al, 1977).


2. Fungsi bebetrapa vitamin
       Setiap jenis vitamin mempunyai fungsi yang berbeda-beda didalam tubuh
tanaman, antara lain:
   1. Inositol (a vit. B) bagian dari berbagai macam membrane (kloroplas).
   2. Thyamin (vit. B1) berperan sebagai coenzim dari siklus kreb.
   3. Nicotinic acid (niacin) berperan dalam fotosintesa.
   4. Pyridoxine (vit. B6) berperan sebagai coenzim pada beberapa enzim.
   5. Pantothenic acid (a vit. B) berperan sebagai coenzim dalam metabolisme
      lemak.
   6. Riboflavin (vit. B12) berperan sebagai coenzim, reseptor sinar biru.
   7. Biotin (vit. H) berperan sebagai coenzim dalam metabolisme lemak.


3. Asam-asam Amino dan Senyawa N Organik
       Asam amino spesifik diperlukan        untuk memacu respon fisiologi, seperti
penambahan L-methionine berfungsi dalam jalur biosintesa ethyline berpengaruh
sebagai stimulator terjadinya proses xylogenesis (Roberts dan Baba (1978 dalam
Dodds dan Roberts (1982), begitu juga senyawa nitrogen komplek seperti: arginine,
urea, glutamine, asparagin dan amonia. Menurut Thom et al (1981, dalam George &
Sherrington, 1984), asam-amino merupakan sumber N organik yang lebih cepat
diambil daripada N anorganik dalam media yang sama. Sumber N yang berbeda ini
memberikan pengaruh yang berbeda juga. Pada kultur sel sycamore, Simpkin dkk.
(1970, dalam George & Sherrington, 1984) menemukan bahwa sel-sel menjadi
panjang-panjang, tetapi sel yang ditumbuhkan dalam media dengan nitrat, tidak
menunjukkan gejala yang demikian. Menurut Gamborg, dalam media dengan
komposisi garam anorganik yang tepat, penambahan campuran asam amino seperti
yang terdapat dalam casein hidrolisat tidak memberikan pengaruh nyata. Dalam media
B5 untuk pertumbuhan sel akar kedelai, tidak diperlukan penambahan bahan organik
lain. Beberapa asam amino memang dibuktikan mempunyai pengaruh positif terhadap
pertumbuhan dan perkembangan kultur. L-cysteine misalnya, mempunyai pengaruh
mengurangi browning pada kultur jaringan tebu, seperti yang dilaporkan Liu (1981).
L-asparagine digunakan oleh Green dan Phillips (1974) untuk merangsang regenerasi
dalam kultur jaringan jagung. Penambahan asparagin dan alanin merangsang
pembentukan pucuk dalam kultur Torenia (Kanada dan Harada, 1979).
       Glycine merupakan asam amino yang ditambahkan sejak tahun 1939, setelah
White menunjukkan bahwa dalam kultur tomat, penambahan Glycine lebih baik
daripada ekstrak ragi. Glycine dengan konsentrasi 2 mg/l merupakan komposisi tetap
dalam banyak formulasi media. Linsmaier dan Skoog pada tahun 1965 menemukan
bahwa glycine tidak memacu pertumbuhan kalus tembakau.
       Lysine dan threonine merupakan asam amino yang harus digunakan secara
hati-hati, karena dapat menghambat pertumbuhan walaupun pada konsentrasi yang
rendah. Kedua asam amino tersebut mempunyai efek co-operasi dalam penghambatan
seperti diulas oleh George dan Sherrington (1984). Sebaiknya tidak menambahkan
keduanya bersama-sama. Ada beberapa asam amino saling antagonis terhadap
sesamanya, seperti phenylalanine dan tyrosine, L-leucine dan L-valine, L-argine dan
L-lysine.
       Di dalam kultur jaringan, eksplan yang dipergunakan merupakan bagian kecil
dari tanaman dan tidak merupakan suatu sistem yang lengkap. Untuk itu banyak
bahan-bahan organik yang harus ditambahkan ke dalam media untuk mendukung
pertumbuhan yang optimal. Karbohidrat terutama gula, merupakan komponen yang
selalu ada dalam media tumbuh, kecuali dalam media untuk tujuan yang spesifik. Gula
putih yang biasa digunakan untuk keperluan sehari-hari cukup memenuhi syarat untuk
mendukung pertumbuhan kultur.
       Perkembangan pemilihan jenis karbohidrat dimulai tahun 1946 oleh Gautheret
yang membandingkan pengaruh berbagai jenis gula pada kultur jaringan wortel
(George & Sherringtone, 1984). Gautheret mendapatkan bahwa sukrosa adalah yang
paling baik, lalu glukosa, maltosa, dan rafinosa. Fruktosa dan galaktosa kurang efektif,
sedangkan manosa dan laktosa merupakan karbohidrat yang paling tidak efektif. Pada
umumnya urutan yang demikian berlaku hampir semua tanaman. Namun ada saja
perkecualian dalam semua kasus. Kultur pucuk mulberry yang tidak dorman, tumbuh
baik pada media dengan maltosa, glukosa, dan fruktosa sedangkan penambahan
sukrosa, tidak merangsang pertumbuhan pucuk. Induksi sitodiferensiasi ke arah
pembentukan elemen trachea dapat terjadi dengan pemilihan jenis karbohidrat dan
konsentrasi yang tepat dalam media kultur (Dodds dan Robert, 1982).
       Sukrosa di     dalam media dihidrolisa menjadi monosakharida selama masa
kultur. Hidrolisa terjadi karena aktifitas enzim invertase yang terdapat pada dinding
sel. Hidrolisa sukrosa paling efektif dalam media dengan pH rendah (George &
Sherrington, 1984).
       Konsentrasi optimum sukrosa tergantung dari jenis jaringan yang dikultur.
Pada kultur kalus dan pucuk, konsentrasi sukrosa yang digunakan adalah antara 2-4 %
yang merupakan konsentrasi optimum. Namun dalam kultur embrio, konsentrasi gula
dapat mencapai 12 %. Menurut Szweykowske, 1974 yang dikutip oleh George &
Sherrington (1984), pembelahan sel protonema Ceratodon purpureus dipengaruhi oleh
interaksi antara glukosa dan 2iP.
       Gula berfungsi ganda di dalam media yaitu berfungsi sebagai sumber energi,
dan sebagai penyeimbang tekanan osmotik media. Menurut George & Sherrington
(1984), 4/5 bagian dari potensial osmotik dalam media White disebabkan oleh gula,
sedangkan dalam media MS hanya setengah dari potensial osmotiknya disebabkan
adanya gula. Dalam percobaan Yoshida et al pada tahun 1973 yang menerangkan
bahwa pertumbuhan kalus Nicotiana glutinosa yang terbaik bila potensial osmotik
yang disebabkan adanya sukrosa dalam larutan: -2.2 atm. Dengan garam-garam lain
memberikan -2.7 atm. Kombinasi yang lain adalah : sukrosa - 0.9 atm., garam-garam -
3.6 atm (George & Sherringtone, 1984).




    Gmbar 17. Macam-macam gula yang sering digunakan dalam kultur jaringan.




      Disamping golongan persenyawaan organik yang konstitusinya jelas, kadang-
kadang dalam media kultur jaringan, juga ditambahkan persenyawaan yang kompleks
                                 yang dimaksud adalah: air kelapa, casein
                                 hydrolysate, ekstrak ragi, juice tomat, ekstrak
                                 kentang dan ekstrak pisang.
                                          Air kelapa. Penggunaan air kelapa pertama
                                    kali dilaporkan oleh van Overbeek (1941 dalam
                                    Gunawan 1988) dalam kultur embrio Datura
                                    stramonium. Pada tahun-tahun berikutnya (1942
dalam Gunawan 1988). Gautheret menemukan bahwa air kelapa dapat digunakan
untuk mempertahankan pertumbuhan jaringan yang diisolasi dari sumber yang
berlainan. Pada tahun 1948, Caplin & Steward memperoleh pertumbuhan kalus yang
lebih baik pada media dengan 5 % air kelapa dan casein hydrolysate dari pada media
dengan IAA.

       Penelitian yang lebih mendalam, menemukan bahwa efek air kelapa pada
pertumbuhan menjadi lebih baik, bila dalam media juga diberikan auksin. Auksin
tertentu dan air kelapa, dapat bersifat sinergis. Steward dan Caplin (1951 dalam
Gunawan 1988) mendapatkan bahwa antara 2,4-D dan air kelapa terjadi reaksi
sinergistik yang memacu pertumbuhan kalus Daucus carota.

Gambar 7. Kelapa „Genjah‟ hijau, air kelapa yang digunakan untuk tambahan media
kultur yang bagus berasal dari kelapa muda yang berwana hijau.

       Namun tidak semua auksin dan air kelapa mempunyai kerja sama yang
sinergis. Lin & Staba (1961 dalam Gunawan 1988) menemukan bahwa pada
pertumbuhan kalus peppermint dan spearmint, penambahan air kelapa dalam media
yang mengandung 2,4-D meningkatkan pertumbuhan kalus, sedangkan dengan 2-
benzothiazoleoxyacetic acid, tidak.

       Bahan-bahan yang terkandung dalam air kelapa, antara lain: asam amino,
asam-asam organik, asam nukleat, purin, gula, gula alkohol, vitamin, mineral, dan zat
pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh yang ditemukan dalam air kelapa antara lain :

              a. 9-B-D ribofuranosyl zeatin ditemukan oleh Letham pada tahun 1968
                 (George & Sherrington, 1984).
              b. Zeatin (Zwar & Bruce, 1970 dalam George & Sherrington, 1984).
              c. N-N‟-Diphenyl urea (Shantz & Steward, 1955 dalam George &
                 Sherringtone, 1984).
              d. 2(3-methyl but-2-enylaming)-purin 6-one (Letham, 1982 dalam
                 George & Sherrington, 1984).



       Casein hydrolysate. Dalam media yang tidak mengandung ion ammonium,
penambahan asam amino dapat memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis. sumber
asam amino campuran yang relative murah adalah casein hydrolysat dan ekstrak ragi.
Dalam kultur jagung, Green et al (1974 dalam Gunawan 1988) menemukan bahwa
penambahan ekstrak ragi 800 mg/l atau casein hydrolysate 200 mg/l memperbaiki
pertumbuhan kalus, walaupun dalam media sudah ada ion ammonium seperti media
Linsmaier & Skoog.

       Penambahan casein hydrolysate dalam media regenerasi padi, meningkatkan
jumlah pucuk yang terbentuk dalam kalus padi. Dalam kasus padi ini, penambahan
asam amino yang sama dengan sam amino dalam casein hydrolysate tidak
menghasilkan pengaruh yang sama. Hal ini disebabkan ada persenyawaan lain yang
penting dalam casein hydrolysate. Casein hydrolysate yang diberikan pada konsentrasi
200-300 mg/l (Inoue & Maeda, 1982 dalam George & Sherringtone, 1984).

       Ekstrak ragi. Penggunaan bahan organik ini pada kultur jaringan dalam
percobaan-percobaan     awal   seperti   pertumbuhan     akar.   Ekstrak   ragi   juga
menyumbangkan asam amino, peptida, vitamin, untuk pertumbuhan kultur.
Konsentrasi yang digunakan dalam kultur berkisar antara 0.5 gram/l sampai 2 gram/l.

       Juice tomat dan ekstrak pisang, banyak digunakan untuk kultur embrio
anggrek. Dalam perkembangan komposisi media, penambahan bahan-bahan yang
underfined ini dihindarkan, karena bahan-bahan organic ini dapat berbeda bila varietas
tanaman berbeda. Lingkungan tumbuh, nutrisi tanaman, dan sebagainya,
mempengaruhi kandungan persenyawaan-persenyawaan tersebut. Hasil yang diperoleh
di suatu saat, kadang-kadang tidak dapat diulangi lagi (unreproducable).

       Juice orange yang ditambahkan ke dalam media kultur, ternyata dapat
memacu pertumbuhan eksplan dengan pesat pada beberapa jenis Citrus

       Ekstrak kentang digunakan dalam kultur anther padi. Penambahan ekstrak
kentang kedalam media, dengan nyata meningkatkan pertumbuhan kalus dan
regenerasi anther beberapa jenis padi (Zhou et al, (1966 dalam Gunawan 1988).
Ekstrak kentang biasanya digunakan setara 10-30 % dengan hasil terbaik 20 %. Tetapi
tidak dijelaskan tentang kentang yang dipergunakan. Juice tomat, ekstrak pisang, dan
ekstrak kentang. Bahan-bahan ini pada umumnya merupakan sumber gula, vitamin,
zat pengatur tumbuh, dan asam amino.
                                       Agar

       Bahan pemadat yang paling banyak digunakan adalah agar. Keuntungan dari
pemakain agar adalah :

       1. Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperature
          100o C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam
          keadaan beku yang stabil.
       2. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman.
       3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media.



       Agar merupakan campuran polisakharida yang diperoleh dari beberapa spesies
Algae. Dalam analisa unsur diperoleh data, bahwa kandungan agar meliputi unsur
Ca, Mg, K, dan Na dalam jumlah yang sedikit (Debergh, (1982 dalam Gunawan 1988).
Kekentalan media pada umumnya meningkat secara linier oleh pertambahan
konsentrasi agar. Kekentalan media juga dipengaruhi oleh :

       a. Merek agar yang digunakan, merek agar yang berbeda, memberikan
          kekentalan yang sedikit berbeda walaupun beratnya sama.
       b. pH media.
       c. Penambahan arang aktif. Arang aktif 0.8-1 g/l menghambat pembekuan
          agar (Horner et al (1977 dalam George & Sherrington, 1984).
       Dalam    perbanyakan    komersial   dan   percobaan-percobaan    yang   tidak
dimaksudkan untuk mempelajari metabolisme sel, penggunaan agar murni bukan
suatu keharusan mengingat harga agar murni sangat tinggi. Bahan-bahan yang tidak
diinginkan dari agar, dapat dihilangkan dengan cara perendaman dalam aquadest
selama 24 jam. Agar kemudian dibilas dengan ethanol dan dikeringkan dalam oven
pada 60o C selama 24 jam.
       Konsentrasi agar yang diberikan berkisar antara 0.6-1.0 %. Konsentrasi agar
yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah eksplan
sehingga pengambilan hara dan zat tumbuh berkurang, sedangkan zat penghambat dari
eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan (Deberg, (1982 dalam Gunawan 1988).

       Selain agar, akhir-akhir ini dikembangkan juga zat pemadat lain yang juga
merupakan polisakharida, tetapi diisolasi dari mikroorganisme jenis yang lain. Gelrite
yang diproduksi oleh Kelco, merupakan polisakharida yang dihasilkan dari bakteri
Pseudomonas sp.

       Beberapa sifat gelrite yang berlainan dengan agar adalah:

       1. Gelrite membentuk gel yang lebih bening dari agar.
       2. Untuk mencapai kekentalan gel tertentu, pemakaian gelrite lebih rendah
           dari agar, pada umumnya konsentrasinya hanya 2 gram/l media, Namun
           kekentalan gel dari gelrite sangat dipengaruhi oleh kehadiran garam-garam
           seperti NaCl, KCl, MgCl2, 6H2O dan CaCl2. Garam NaCl dan KCl
           menurunkan kekentalanan gel, tetapi MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan
           kekentalan gel.



                              Arang Aktif (Charcoal)
       Arang aktif atau charcoal adalah arang yang sudah dipanaskan selama beberapa
jam dengan menggunakan uap atau udara panas (George & Sherrington, 1984). Bahan
ini mempunyai sifat adsorpsi yang sangat kuat. Arang aktif dapat ditambahkan ke
dalam media pada berbagai tahap perkembangan kultur. Bahan ini dapat ditambahkan
pada media inisiasi, media regenerasi, atau media perakaran.

       Penambahan arang aktif dapat membantu pertumbuhan perkembangan kultur,
tergantung dari jenis kulturnya. Secara umum, pengaruh arang aktif adalah sebagai
berikut:

       1. Mengadsorpsi persenyawaan-persenyawaan toxic yang terdapat dalam
           media yang dapat menghambat pertumbuhan kultur, seperti :
              a. Persenyawaan-persenyawaan fenolik dari jaringan yang terluka
                  waktu inisiasi.
               b. Persenyawaan 5-hidroksimetil furfural yang diduga terbentuk dari
                   gula yang berada dalam larutan asam lemah dan mengalami
                   pemanasan dengan tekanan tinggi (Nitsch et al, 1968 dalam
                   Gunawan 1988).
       2. Mengadsorpsi zat pengatur tumbuh sehingga:
               a. Mencegah pertumbuhan kalus yang tidak diinginkan, seperti dalam
                   androgenesis dan pucuk yang ingin diakarkan.
               b. Membantu embryogenesis kultur dalam media regenerasi tanpa
                   auksin, mungkin dengan bertindak sebagai sink yang menarik
                   auksin dari dalam sel sehingga embryogenesis dapat terjadi (Drew,
                   (1979 dalam George & Sherringtone, 1984).
       3. Merangsang perakaran dengan mengurangi tingkat cahaya yang sampai ke
            bagian eksplan yang terdapat dalam media.
       Arang aktif ditambahkan dengan konsentrasi yang bervariasi yakni 0.5-6 %,
tergantung dari tujuan. Dalam media yang ditambahkan arang aktif, harus diusahakan
agar arang aktif terbagi rata dalam media. Sesudah sterilisasi dalam autoklaf botol
media harus sering dikocok sampai agar        mulai membeku. Bila tidak diadakan
pengocokan, maka hampir semua arang aktif berada di lapisan bawah media.




                                         pH Media




       Faktor penting lain adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga
tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain
memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor
:

       1.    Kelarutan dari garam-garam penyusun media
       2.    Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain
       3.    Efisiensi pembekuan agar.
       Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5.5-5.8
(Gamborg dan Shyluk, 1981). Tanaman Ericaceae seperti Rhododendron pengaturan
pH, biasa dilakukan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau
HCl pada waktu semua komponen sudah dicampur, beberapa saat sebelum disterilkan
dengan autoklaf. Sekalipun media sudah ditetapkan, seringkali setelah sterilisasi pH-
nya berubah. Pada umumnya terdapat penurunan pH setelah distrerilkan dalam
autoklaf. Untuk mencapai pH sekitar 5.7-5.9, Nann dkk. (dalam George dan
Sherrington, 1984) membuat pH 7.0 dalam media yang belum disterilkan.

       Untuk menghindarkan perubahan pH yang cukup besar. Murashige dan Skoog
menyarankan     agar   dilakukan   pemanasan    untuk    melarutkan   agar-agar   dan
memanaskan media didalam autoklaf selama beberapa menit, baru diadakan penetapan
media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah yang besar, media disterlkan dan
kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai pH yang diinginkan. Setelah itu
media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam laminar
air flow cabinet.




                              Buffer (chelating agent)




Penambahan asam amino seringkali juga bersifat sebagai buffer organik. Penambahan
KH2PO4 sendiri tidak efektif sebagai buffer. Banyak peneliti terdahulu seperti Tausson
dan Kordan (George & Sherringtone, 1984) menyarankan untuk menambahkan Fe
SO4 dan Na-EDTA dalam media untuk bertindak sebagai buffer.




1. Chawla, H.S. 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd Edt. Science
   Publishers, Inc. New Hampshire.
2. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
   England. 236 p.
3. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
   Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
4. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge
   University Press. London. 178 p.
5. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
   principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
   Industries. Brisbane. 31 p.
6. George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture.
   Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd., Basingstoke,
   England. 546 p.
7. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
   Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.
   Bogor. 304 h.
8. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshamanan, 2002. In vitro plant breeding. The
   Haworth Press, Inc. New York.

9. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
   procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
       Sterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan
mikroorganisme. Pemiliharaan suci hama dan penyakit (keaseptikan) atau kondisi
steril sangat esensial untuk keberhasilan dalam prosedur kultur jaringan. Keadaan
aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur yanga akan digunakan, media kultur,
peralatan yang akan digunakan dalam kegiatan penanaman eksplan dan eksplan yang
akan dikulturkan itu sendiri. Pemeliharaan kebersihan udara di dalam ruang kultur dan
lantai kultur dari debu itu dua hal yang sangat penting dan harus tetap terjaga
kebersihannya. Laminar Air Flow (LAF) harus tetap terjaga kebersihannya dan
sebaiknya alat yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman dan kultur mikrobiologi
serta patogi terpisah. LAF yang digunakan oleh mikrobiologist dan patologist
sebaiknya menggunakan LAF yang mempunyai arah blower dari atas ke bawah (aliran
hembusan udara dari arah atas ke bawah) atau vertical airflow model sedangkan LAF
yang digunakan untuk keperluan kultur jaringan mempunyai arah hembusan udara
dari belakang ke depan atau horizontal airflow model
       Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah
kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat
berasal dari :
     1. Eksplan, baik eksternal maupun internal.
     2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia,
         yang paling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut.
     3. Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril.
     4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara).
     5. Kecerobohan dalam pelaksanaan.
         Berdasarkan perbedaan benda yang akan disterilkan, umumnya prosedur
sterilisasi dapat dikelompokan dalam tiga kategori, yakni:
     a. Sterilisasi lingkungan kerja.
     b. Sterilisasi alat-alat dan media.
     c. Sterilisasi bahan tanaman (eksplan).
       Penanaman ekplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, sering kali
dilakukan dalam kotak pindah steril atau dikenal dengan Laminar Air Flow cabinet.
kotak pindah ini sudah disempurnakan dengan adanya aliran udara halus yang
dihembuskan dari blower kira-kira 100 hembusan per menit, melalui suatu filter yang
sangat halus sehingga mikrobia dapat tersaring olh adanya filter tersebut. Dengan
demikian udara yang mengalir atau hembusan udara tersebut adalah udara steril yang
dapat mencegah kontaminan yang berasal dari airborne selama kegiatan penanaman.
Kotak pindah dengan aliran udara melalui suatu filter HEPA (High Efficiency
Particulate Air) dengan pori-pori < 0.3 um.
       Dulu, kotak pindah ini tertutup bidang mukanya selama masa pelaksanaan
dengan pembukaan seminimum mungkin, hanya tempat memasukkan tangan, kotak
pindah semacam ini disebut dengan entkas. Entkas ini dapat dibuat dari kaca semua
atau kayu dan bagian mukanya saja yang terbuat dari kaca. Di dalam kotak ini terdapat
lampu germisida yang memancarkan radiasi ultraviolet untuk mensterilkan permukaan
tempat kerja dalam kotak pindah ini. Disamping lampu ultra violet, kotak ini dapat
juga disterilkan dengan penyemprotan alkohol 70% atau formalin tablet atau larutan
formalin.
       Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet
dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam alcohol 70% atau dalam larutan kaporit
atau dapat juga disemprot menggunakan spiritus (untuk menghemat biaya). Ada juga
tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum
kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara ½-1 jam untuk
mematikan kontaminan di permukaan tempat kerja. laminar air flow cabinet harus
dijaga dibersihkan dengan alkohol dengan menyalakan lampu ultra violet sebelum
mulai bekerja atau sesudah melakukan kegiatan selama ½-1jam.
         Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses
isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf
yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang
sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber
uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat
menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan
temperatur diatur dengan jumlah panas dari api.
        Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas
secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai
keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang
sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih
cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.
       Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya
dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan
baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain.
Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan
media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf.
Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan
didihkan.

       Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan
sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat
diprogam waktu sterilisasi, serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat
selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam
waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable, panas ini diatur secara
atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.

                                       Autoklaf


       Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap
air. Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-
17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm.

       Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air
disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume
bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :
    1. Penguraian gula.
    2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
    3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
    4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.



Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap dari
pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada
laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.

Bagian-bagian autoklaf :

    1. Panci luar.
    2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.
    3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
    4. Katup pengeluaran uap.
    5. Pengunci atau klem.



              Sterilisasi Media Mmenggunakan Autoklaf Portable

                           (Pemanasan menggunakan api)

     1. Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan
         pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk
         autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf besar.
     2. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panel-dalam.
         Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel.
     3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang
         terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar .

      4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat)
      5. Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka.
      6. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen.
      7. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari
         katup pengeluaran uap.
      8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara
          mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave.
     9. Tutup katup pengeluaran uap.
     10. Amati kenaikan temperature dan tekanan.
     11. Setelah tekanan mencapai 15 psi, api kompor dikecilkan.
     12. Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor
          secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan
          mengerjakan hal lain diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai
          melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan
          alat.
     13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.
     14. Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap
          (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan
          uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up
     15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang
          berisi media.
                     Sterilisasi Aquadest dan Media Menggunakan

                       Autoklaf Listrik (Digital Atau Non Digital)

        Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang
mempunyai volume antara 300 – 500 ml. Isi wadah tersebut sampai 80% volume, dan
tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet gelang.

         Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan
dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar
sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat
waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm.
       Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile,
sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi
atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan
volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran
50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20
botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol
volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52
menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah
waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan
tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya
mendidih dan meluap (bubbled up).

       Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan
dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um.
Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin
disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung
jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-
panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.

                             Sterilisasi Peralatan Kultur

      1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau
          aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan al-foil). Untuk
          botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu
          kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.
      2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,
          gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan
          pipet.
      3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh
          dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum
          dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan
          sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan.
          Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus
          dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil
          karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang
          efektif.
      4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
          merang.
      5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-
          alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121o C pada
          tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit.
           Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang
           diinginkan tercapai.
      .

      Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril. Alat-alat
logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan
gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam
bacticinerator. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan,
namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam
temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi
dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

                            Sterilisasi menggunakan Oven

          Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah,
biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke
dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan
dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka
sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan alumunium foil.




                                                          Sumber: Kantharajah, - .
                                LAMINAR AIR FLOW


       Laminar air flow cabinet adalah suatu alat yang digunakan dalam pekerjaan :
persiapan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke
botol yang lain dalam kultur in vitro. Alat ini diberi nama Laminar Air Flow Cabinet,
karena meniupkan udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat
kerja bebas dari, debu dan spora-spora yang mungkin jatuh kedalam media, waktu
pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke
dalam alat melalui filter pertama (pre-filter), yang kemudian ditiupkan keluar melalui
filter yang sangat halus yang disebut HEPA (High efficiency Particulate Air FilterI),
dengan menggunakan blower.
      Pada Laminar Air Flow Cabinet, terdapat 2 macam filter:
      1. Pre-filter, yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu dan
            benda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5 m sehingga efisiensinya
            dapat mencapai 95 m untuk objek-objek yang ≥ 5 m.
      2. HEPA filter dengan pori-pori 0.3 m dan terdapat pada bidang keluar udara
            kearah permukaan tempat kerja.
Pre-filter harus sering dibersihkan dengan cacum cleaner dan sebaiknya diganti 1
tahun sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan
particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge.
       Laminar air flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu U.V., ada juga
yang tanpa. Pada laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu U.V.,
blower harus dijalankan terus menerus walaupun laminar air flow cabinet tersebut
sedang tidak dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja
didalam laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan
lampu U.V., dianjurkan agar menyalakan lampu U.V. minimum 30 menit sebelum
laminar air flow digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu U.V.
harus dimatikan, sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet
yang dilengkapi dengan lampu U.V., hanya dijalankan pada saat laminar air flow
sedang digunakan.
       Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet:
       1.     Lampu alkohol/Bacti cinerator.
       2.     Wadah alkohol: botol/gelas piala ≥ 250 ml.
      3.   Pinset, skalpel, gunting, dan jarum.
      4.   Petri-dish steril.
      5.   Disceting Microscope, bila sedang isolasi meristim.
      6.   Kertas tissue/kapas.
      7.   Sprayer berisi alkohol 70% (tidak harus dalam cabinet).


                                CARA MENGGUNAKAN


      1.   Nyalakan lampu U.V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air
           flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.
      2.   Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang
           dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet, disemprot terlebih
           dahulu dengan alcohol 70% atau spiritus.
      3.   Meja dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau spiritus
           untuk mensterilkan LAF.
      4.   Blower pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.
      5.   Nyalakan lampu dalam LAF.
      6.   LAF sudah siap untuk digunakan.


Hal yang perlu diperhatikan :


      1.   Jangan meletakkan lampu bunsen
           terlalu dekat dengan filter        dan
           alkohol untuk merendam peralatan kultur.
      2.   Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media, dan lain-lain benda di
           depan tempat bekerja sehingga menghalangi aliran udara.
      3.   Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol (nyala
           api alkohol yang terdapat pada alat tanam, tidak terlihat dengan jelas di
           tempat
           yang terang     HATI-HATI !!!).
      4.   Jangan mendekati lampu bunsenl, dengan tangan yang baru disemprot
           alkohol atau spiritus.
       5.    Bersihkan Laminar Air Flow Cabinet, setelah selesai bekerja. Jangan
             meninggalkan botol bekas, kapas bekas, dan sebagainya di dalam LAF
                    Gambar 20: Isolasi eksplan dan penanaman eksplan dii dalam LAF
.




1. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
    England. 236 p.
2. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
    Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
3. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
    principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
    Industries. Brisbane. 31 p.
4. George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture.
    Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd., Basingstoke,
    England. 546 p.
5. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
    Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.
    Bogor. 304 h.
6. Kantharajah, AS. 1995. Plant tissue culture and crop improvement laboratory
    manual. Indonesia Australia Eastern Universities Project and UNRAM. Mataram.
7. Negrón,     JA. 2007. Plant tissue culture. UIPR Barranquitas, 2006. On line
    http://plant20%tissue%20A%20color; diakses 1-2-2007
8. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
    procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
Kultur Organ



        Teknik kultur jaringan semakin berkembang dan popular sebagai salah satu
alternatif dari propagasi tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagasi
aseksual dan tujuan utamanya adalah membuat tanaman lebih unggul. Kesuksesan dari
beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetic pada tanaman tingkat tinggi
tergantung pada kesuksesan dari regenerasi tanaman in vitro.

        Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ.
Menurut Shabde – Moses & Murhasige (1979), Hannig, pada tahun 1904 telah berhasil
mendapatkan kecambah tanaman jenis crucifer dari embrio-embrio yang diisolasi dari
biji yang belum matang (immature). Pertumbuhan organ yang tidak terbatas didalam
kultur in vitro, pertama diperlihatkan oleh White dalam kultur akar tomat sekitar tahun
1934.

        Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun
1940-1960. Setelah itu penalitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur
pucuk/meristem. Kultur pucuk atau maristem mempunyai aspek praktis sebagai cara
perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit. Dewasa ini kultur maristem sudah
merupakan tindakan komersial yang dikelola oleh perusahaan –perusahaan pembibitan.

        Disamping kultur pucuk, pada tahun 60 an, kultur akar mendapat perhatian lagi
pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi bahan sekunder,
terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar. Namun kultur
akar yang pertumbuhannya tidak terbatas tersebut, dewasa ini pada umumnya
dipusatkan pada hasil transformasi dengan Agrobacterium rhizogenes yang merupakan
kultur auksin autotroph.
        Secara keseluruhan kultur organ dalam ilmu fisiologi dipergunakan dalam studi
diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan
lingkungan, dapat dieksplorasi antara lebih tepat dalam kultur in vitro. Organ-organ
tanaman yang sering digunakan sebagai eksplan tergangtung dari jening tanamannya,
organ tersebut antara lain adalah:




                                 1. Jaringan meristem,     8. Helaian daun,

                                 2. Pucuk,                 9. Tuber rhizogenum

                                 3. Pucuk kormus,          10. Tuber caulogenum

                                 4. Buku kormus,           11. Inflorescentia,

                                 5. Buku bulb              12. Mata Tunas samping

                                 6. Buku batang tunggal,   13. Hipokotil dan epikotil

                                 7. Ruas batang muda,      14. Akar




        Tabel 8. Spesies dan organ tanaman serta teknik kultur jaringan yang
digunakan

   No          Nama Tanaman                      Eksplan                         Hasil

    1       Begonia sp.                 Helaian daun             Multiplikasi pucuk

    2                                   daun                     Multiplikasi pucuk
            Coleus parviflorus
    3       Gardenia sp.                Hypantium (dasar         Multiplikasi pucuk
                                        bunga)

    4       Musa sp.                    Inflorescentia           Multiplikasi pucuk

                                        Pucuk kormus
    5     Amorphophallus sp.       Buku kormus              pucuk

    6                              Pucuk                    Multiplikasi pucuk
          Dioscorea alata
                                   Buku bulbil

    7                              Buku batang              Multiplikasi pucuk
          Dioscorea
          microstachya
    8                              Jaringan meristem        Tanaman bebas virus
          Manihot esculenta
    9                              Jaringan meristem        Tanaman bebas virus
          Ipomoea batatas




Gambar 27. A. Jaringan dan organ tanaman berbiji; B. Penampang melintang batang;
              C. Penampang menintang akar. Pucuk/ tunas apikal dan terminal
              sangat bagus untuk sumber eksplan (sumber Taji, Kumar &
              Lakshmanan, 2002).
       Propagasi klonal in vitro dikenal dengan istilah mikropropagasi. Kata klon
digunakan pertama kali oleh Webber untuk tanaman budidaya yang dihasilkan dari
propagasi vegetatif. Jadi propagasi klonal adalah multiplikasi dari individu gen identik
melalui reproduksi aseksual sedangkan klon itu sendiri adalah satu populasi tanaman
derivat (turunan) dari satu individu tunggal yang dihasilkan         melalui reproduksi
aseksual.

       Seiring dengan perkembangan pemahaman dan kemajuan kultur jaringan maka
dewasa ini teknik-teknik kultur jaringan telah digunakan untuk berbagai tujuan
termasuk industri bibit tanaman. Teknik perbanyakan mikro (mikropropagasi) telah
lama digunakan dan merupakan salah satu contoh menarik dan klasik dari penerapan
teknik kultur jaringan. Teknik ini dilakukan dengan cara menanam eksplan berupa
pucuk beserta jaringan meristemnya yang dikenal sebagai teknik kultur pucuk (Shoot
tip culture) atau menanam tunas lateral dengan satu atau lebih buku (single node and
multiple node culture). Teknik terakhir juga dikenal dengan istilah in-vitro layering.

       Perbanyakan mikro secara umum dapat diartikan sebagai usaha menumbuhkan
bagian tanaman dalam media aseptis kemudian memperbanyak bagian tanaman
tersebut sehingga dihasilkan tanaman sempurna dalam jumlah banyak. Tujuan
utamanya adalah memproduksi tanaman dalam jumlah besar dan waktu yang singkat.
       Teknik ini juga dikenal dengan upaya clonning untuk memproduksi klon
tanaman dari jaringan vegetatif. Oleh karena itu tanaman yang dihasilkan melalui
upaya clonning ini adalah identik atau serupa dengan induknya. Untuk mengenal lebih
jauh tentang mikropropagasi lebih jauh akan dibahas tentang:

   1. Manfaat      Teknik Mikropropagasi.
   2. Metode Perbanyakan Secara In-vitro.
   3. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Keberhasilan Perbanyakan Tanaman Secara
       In-vitro.
   4. Contoh Teknik Perbanyakan Tanaman Hortikultura.




Manfaat Teknik Mikropropagasi Dalam Bidang Hortikultura

    Teknik perbanyakan in-vitro ini dilakukan dalam industri bibit karena teknik ini
memiliki manfaat , antara lain:

1. Dapat digunakan untuk memproduksi bibit dalam jumlah banyak dan waktu yang
   relatif singkat. Salah satu keunggulan mikropropagasi adalah perbanyakan organ
   tanaman    yang    dihasilkannya.   Penggunaan   hormon     pertumbuhan   sintetis
   memungkinkan perbanyakan eksplan dalam jumlah banyak dan waktu singkat.
   Perbanyakan di dalam wadah kecil memungkinkan dilakukan perbanyakan cepat
   ini. Dewasa ini telah dilakukan automatisasi dalam mikropropagasi menggunakan
   mesin pembuat media dan sterilisasi media, pemotongan dan sterilisasi ekspan
   yang dikendalikan dengan komputer sehingga dapat dilakukan perbanyakan secara
   lebih cepat dan lebih efisien.
2. Dapat menghasilkan bibit dengan ukuran seragam. Produksi klon secara in vitro
   dapat dikontrol lebih mudah dbandingkan produksinya dilapangan karena
   perbanyakan dilakukan dalam wadah kecil. Oleh karena itu bisa dihasilkan klon
   dengan ukuran yang seragam dalam saat yang bersamaan. Penanaman bibit yang
   seragam mempermudah pemeliharaan tanaman di lapangan dan panen dapat
   dilakukan secara serempak.
3. Tidak membutuhkan eksplan dalam jumlah banyak sehingga menghindari
   kerusakan tanaman induk. Sebaliknya stek, cangkok, penyambungan/penempelan
   yang intensif dari satu pohon induk dapat mengganggu pertumbuhan tanaman
   induk bahkan dapat merusaknya.
4. Dapat digunakan untuk perbanyakan cepat tanaman langka, tanaman dengan nilai
   ekonomis tinggi, atau varietas unggul hasil pemuliaan tanaman.
5. Dapat digunakan untuk memproduksi dan memperbanyak tanaman yang bebas
   virus melalui teknik kultur meristem. Penyakit virus menyebabkan banyak
   kerugian dan kehilangan produksi tanaman pertanian. Seringkali infeksi virus tidak
   menyebabkan gejala awal yang dapat dilihat, namun akan nampak mengurangi
   vigor atau penampilan tanaman dan menurunkan kualitas maupun kuantitas hasil.
   Dewasa ini belum ada cara pengendalian dan pemberantasannya yang efektif. Hal
   ini menjadi masalah bagi tanaman hortikultura yang diperbanyak secara vegetatif
   misalnya kentang dan jeruk karena virus akan terbawa oleh keturunanannya. Isolasi
   dan penaman jaringan yang bebas virus (meristem) secara in vitro telah berhasil
   memproduksi klon kentang dan jeruk bebas virus.
       Selain manfaatnya tersebut, perbanyakan dengan teknik kultur jaringan ini juga
memiliki kelemahan antara lain agar usaha ini berhasil diperlukan ketrampilan khusus,
fasilitas pendukung produksi yang khusus, mungkin diperlukan metode-metode khusus
untuk mengoptimalkan produksi masing-masing varietas tanaman dan spesies dan
karena metode yang dewasa ini tersedia membutuhkan banyak tenaga kerja maka biaya
produksinya umumnya tinggi.

       Selain hal tersebut dapat terjadi variasi tanaman yang dihasilkan dari
perbanyakan secara in-vitro sehingga tanaman yang dihasilkan berbeda dengan
induknya. Variasi ini dikenal dengan istilah “variasi somaklonal”     karena variasi
muncul pada klon yang dihasilkan dari organ-organ somatik (vegetatif). Hal ini dapat
terjadi karena tanaman terus menerus dan dalam waktu lama ditanam dan diperbanyak
dalam media yang mengandung hormon pertumbuhan tertentu.

       Variasi ini juga timbul bilamana eksplan ditanam dalam media yang
memungkinkan terbentuknya kalus. Pembelahan sel yang sangat cepat pada kalus
dapat mengakibatkan perubahan genetis sel-sel kalus akibat penyimpangan informasi
genetis yang diterima oleh masing-masing sel kalus tersebut. Variasi somaklonal ini
dapat dikurangi dengan cara:

   1) membatasi jumlah sub-kultur dan perbanyaknnya,
   2) menanam dalam medium tanpa hormon pertumbuhan untuk satu atau dua
       periode sub kultur dan
   3) jika memungkinkan menghindari perbanyakan melalui kultur kalus. Namun
       pada beberapa jenis tanaman, terutama tanaman yang tidak bisa diperbanyak
       dengan stek dan sulit dirangsang pembentukan tunas-tunas adventifnya maka
       kultur kalus yang diregenerasikan melalui organogenesis dan embryogenesis
       merupakan alternatif perbanyakan yang memungkinkan. Apabila variasi
       somaklonal tidak dapat dihindari, perlu dilakukan pengujian sifat-sifat tanaman
       yang diregenerasikan sebelum klon dijual secara komersial.



Manfaat Mikropropagasi Dalam Pemuliaan Tanaman
      Teknik mikropropagasi dalam pemuliaan tanaman pada umumnya digunakan
antara lain, untuk:
   a. Untuk menghasilkan tanaman bebas penyakit (nematoda, mycoplasma, viroid,
       virus, jamur dll.).
   b. Menghasilkan kultivar baru atau tanaman superior, hybrid baru, seleksi dan
       klon local, genotip elit.
   c. Menghasilkan galur tetua jantan steril.
   d. Menghasilkan induksi mutan secara spontan
   e. Membuat variasi genetik.
       Metode perbanyakan vegetatif tanaman secara in-vitro adalah merupakan
pengembangan dari teknik-teknik perbanyakan vegetatif yang telah dilakukan secara
konvensional seperti stek, layering dan cangkok. Tujuan perbanyakan konvensional,
misalnya stek, adalah merangsang terbentuknya organ adventif (akar pada stek batang,
akar dan tunas pada stek daun dan stek akar) pada bahan stek dan jumlah bibit yang
diperoleh dari satu bahan stek umumnya hanya satu. Pada perbanyakan vegetatif
secara in- vitro umumnya digunakan tidak hanya untuk merangsang terbentuknya
organ tanaman (akar, batang dan daun) namun juga memperbanyaknya sebelum
tanaman kecil (plantlet) ini dipindahkan dari tabung kultur ke lapangan.

       Metode yang dapat dilakukan dalam mikropropagasi tanaman dilakukan secara
bertahap sejak tahap persiapan dan perlakukan stok tanaman (tahap 0) sampai tahap
aklimatisasi (tahap IV).
Tahapan Dalam Mikropropagasi
         Di atas telah dijelaskan bahwa mikropropagasi dilakukan dalam beberapa
tahapan. Tahapan-tahapan ini bukan hanya menjelaskan prosedur mikropropagasi,
namun juga menjelaskan saat perubahan pada lingkungan kultur misalnya perubahan
komposisi dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam media. Ada
lima tahapan dalam mikropropagasi, yakni:

Tahap 0: tahap persiapan (preparasi).

Tahap 1: tahap induksi (pemacuan).

Tahap 2: tahap multiplikasi (perbanyakan).

Tahap 3: tahap pengakaran.

Tahap 4: tahap transplantasi (pemindahahan) ke media terrestrial.




      Tahap 0: tahap persiapan (preparasi), Seleksi dan Persiapan Pohon Induk

         Tahapan ini dilakukan sebelum eksplan diambil untuk perbanyakan. Pohon
induk yang akan digunakan sebagai sumber eksplan harus dipilih secara hati-hati.
Pohon ini adalah pohon dari spesies atau verietas yang akan diperbanyak, mempunyai
vigor yang sehat dan bebas dari gejala serangan hama atau penyakit. Kadang-kadang
pohon induk atau bagian tanaman yang akan diambil sebagai eksplan perlu
diperlakukan khusus agar mikropropagasi berhasil.

         Perlakuan-perlakuan tersebut antara lain :

(1)    Penaman di green house atau pot untuk mengurangi sumber kontaminan,

(2)    Pemberian lingkungan yang sesuai atau perlakuan kimia untuk meningkatkan
       kecepatan multiplikasi dalam kondisi in-vitro,

(3)     Indexing atau prosedur lain untuk mengetahui adanya penyakit sistemik oleh
       virus atau bakteri,

(4)    Perangsangan pertumbuhan tunas-tunas dorman, dll.
       Pada permulaan pengerjaan kultur jaringan problem terbesar yang dihadapi
adalah mengatasi kontaminasi. Tempat pengambilan eksplan sangat berpengaruh
besarnya resiko kontaminasi oleh infeksi jamur. Eksplan yang diambil dari rumah kaca
yang terjamin kondisi kehegienisannya akan jauh dapat mengurangi resiko
terkontaminasi oleh infeksi jamur dibanding bila eksplan diambil dari lapangan.
Namun ada yang lebih sulit untuk menghindari kontaminasi terhadap bakteri, karena
sering sulit untuk membedakan apakah kontaminasi tersebut berasal dari bakteri
endogin atau eksogin.

       Idialnya tanaman induk yang akan dijadikan sebagai eksplan sebaiknya
ditanam di dalam rumah kaca yang terjaga kehegienisannya. Ini tidak hanya dapat
mereduksi populasi jumlah mikroorganisme yang hidup di permukaan tanaman, tetapi
juga membantu untuk memproduksi tanaman berkualitas.

       Pada tahap 0 termasuk juga beberapa intervensi yang dapat membuat eksplan
lebih sesuai atau lebih siap sebagai material awal. Faktor-faktor yang berpengaruh
dalam tanaman induk kultur jaringan adalah cahaya, temperatur dan zat pengatur
tumbuh.

       Cahaya. Pada tanaman petunia yang diberi perlakuan cahaya sinar merah
dengan panjang gelombang 640-700 nm pada sore hari dapat memacu pertumbuhan
percabangan sedangan pada tanaman yang disinari dengan panjang gelombang 700-
795 nm menyebabkan pertumbuhan tumbuhan tunas terminal yang tegak dan tidak
menghasilkan tunas horizontal. Lebih jauh, jika helaian daunnya digunakan sebagai
eksplan pada perlakuan panjang gelombang 640-700 nm akan dapat memproduksi
lebih banyak tunas per eksplan dibandingkan pada eksplan yang berasal dari tanaman
yang diberi perlakuan dengan panjang gelombang 700-795 nm.

       Temperatur. Umbi lapis (bulbus) tanaman kebanyakan mengalami dormansi,
untuk memecahkan dormansi dan memacu pertumbuhan perlu adanya perlakuan
penyimpanan di dalam ruang dingin dengan temperatur 4o C untuk umbi bunga lili.
Perlakuan temperatur dingin juga dapat memacu pertumbuhan anak umbi (bulblet)
yang lebih berat pada tanaman hyacin setelah disimpan selama 70 hari pada suhu 15o
C.
       Zat pengatur tumbuh. Adanya BA pada perkecambahan biji Brassica
campestris, dapat menyebabkan kotiledon yang diambil dari perkecambahan tersebut
akan lebih mudah melakukan regenerasi lebih efisien. Untuk menambah respon
eksplan tanaman kayu, tanaman induk dapat diperlakuan dengan larutan sucrose, 8-
hydroxyquinoline citrate, BA dan GA3.

                        Tahap 1: tahap awal atau induksi (Inisiasi)

        Tahap awal ini amat sangat penting dan menentukan bagi keberhasilan
mikropropagasi. Keberhasilan tahap ini pertama kali terlihat dari keberhasilan
penanaman eksplan pada kondisi aseptis (bebas dari segala kontaminan) dan harus
diikuti dengan pertumbuhan awal eksplan sesuai tujuan penanamannya (misalnya:
perpanjangan pucuk, pertumbuhan awal tunas, atau pertumbuhan kalus pada eksplan).
Setelah 1 – 2 minggu inkubasi, kultur yang terkontaminasi oleh bakteri atau jamur
(baik pada media maupun eksplannya) dibuang. Tahap ini selesai dan kultur bisa
dipindahkan ke tahap berikutnya bila eksplan yang tidak terkontaminasi telah tumbuh
sesuai dengan harapan (misalnya tunas lateral atau tunas adventif tumbuh). Untuk
eksplan yang mengalami kontaminasi berat atau yang sulit untuk disterilisasi maka
eksplan terlebih dahulu dapat ditanam pada media inkubasi atau establishment yaitu
media yang hanya mengandung gula dan agar saja dengan tujuan untuk isolasi eskplan
yang tidak terkontaminasi sebelum diinisiasi pada tahap 1 mikropropagasi.

       Tujuan dari tahap ini adalah memproduksi kultur axenic. Untuk kebanyakan
pekerjaan mikropropagasi, eksplan yang dipilih adalah tunas aksilar atau terminal;
hanya pada tanaman terbatas eksplan yang digunakan dapat dari potongan daun seperti
pada Begonia dan Saintpaulia (African violet) atau perbungaan pada tanaman Gerbera
spp. Faktor-faktor yang berpengaruh pada keberhasilan pada tahap ini adalah:

      Umur tanaman induk
      Umur fisiologis dari eksplan
      Tahap perkembangan dari eksplan
      Ukuran dari eksplan.
Reaksi hipersensitif:
        Ketika jaringan tanaman diekspos pada situasi stress seperti luka mekanikal,
metabolisme fenolik komplek tersimulasi. Intervensi ini menyebabkan reaksi
hipersensitif, seperti:

         Melepaskan isi sel-sel yang rusak.
         Reaksi-reaksi di dalam sel-sel tetangganya tetapi tanpa menunjukkan gejala
          adanya luka itu sendiri.
         Dan / atau mati premature dari sel-sel yang spesifik dalan lingkungan luka atau
          tempat infeksi.
Pada umumnya metabolisme fenolik komplek mempunyai 3 tipe reaksi dalam
merespon stress atau luka, yakni:

         Oksidasi dari terbentuknya fenolik komplek (mumculnya senyawa quinon dan
          material polymerisasi).
         Pembentukan turunan monomerik.
         Pembentukan turunan polimer fenolik.
Pembentukan        monomer     fenolik   di    dalam   jaringan   dapat   memacu   untuk
mengakumulasi sejumlah besar produk, atau munculnya produk baru yang berperan
dalam mekanisme proteksi dari jaringan yang luka. Peranan dari pruduk ini dapat
membentuk pembatas fisik melawan invasi (seperti lignin), atau senyawa inhibitor dari
pertumbuhan mikrobia (seperti quinon atau fitoalexin).

        Umumnya, jaringan mengandung senyawa fenolik komplek berkonsentrasi
tinggi, maka jaringan tersebut sulit untuk dikulturkan. Senyawa fenol adalah produk
yang labil dan sangat mudah teroksidasi dan fenol teroksidasi dapat menjadi fitotoksit.
Strategi untuk mereduksi atau menghilangkan senyawa fenolik komplek tersebut
adalah:

         Mencuci atau membersihkan pruduk senyawa fenolik komplek dengan
          membersihkannya dengan merendam kedalam air pada jangka yang panjang
          atau mengabsorbsinya dengan arang aktif atay senyawa polyvinylpyrrolidone).
         Mmenghambat kerja enzim fenolase menggunakan agen khelat.
         Mereduksi aktifitas fenolase dan kemampuan substrat dengan menggunakan
          pHrendah, dengan penambahan senyawa antioksidan seperti: asam askorbat,
          asam sitrat atau menginkubasikan kultur di dalam ruang gelap.
       Mereduksi terjadinya stress pada eksplan, terutama pada waktu sterilisasi atau
        penanaman, induk tanaman yang higienis dapat mengurangi stress.
       Penggunaan mikroelemen tertentu dapat menyetimulasi terbentuknya senyawa
        fenol, seperti Mn2+ (berperan sebagai cofactor peroksidasi) dan Cu2+
        (merupakan bagian dari enzim fenolase komplek). Oleh karena itu untuk
        jaringan yang menghasilkan fenolik komplek berlebihan disarankan untuk
        mengurangi konsentrasi atau tidak menggunakan unsur tersebut dalam media.
       Menginkubasikan kultur dalam ruangan yang bersuhu rendah.
       Sebaiknya sebelum eksplan ditanam pada media perlakuan ditempatkan pada
        media tanpa zat pengatur tumbuh untuk mengurangi terjadinya pencoklatan
        atau penghitaman pada eksplan.



                   Tahap 2 : Tahap perbanyakan (Multiplikasi)

       Tujuan dari tahapan ini adalah untuk memperoleh dan memperbanyak tunas.
Kultur axenik yang telah dihasilkan pada tahap I pada tahap II dipindahkan pada media
yang kaya akan cytokinin agar eksplan dapat menghasilkan tunas yang banyak yang
selanjutnya pada tahap III nanti tunas-tunas tersebut dipindahkan pada media
pengakaran untuk memacu pertumbuhan akar.

       Pada tahap ini, eksplan dapat juga membentuk kalus (callogenesis) atau
membentuk tunas (caulogenesis).       Pada pertumbuhan kalus        sering dihasilkan
embrioid dan setiap embrioid nantinya akan membentuk individu tanaman baru
(somatic embriogenesis), atau kadang memproduksi meristemoid yang akan tumbuh
menjadi tunas (organogenesis). Callogenesis sering menimbulkanterjadinya aberasi
genetik yang dikena dengan istilah variasi somaklonal, sehingga tanaman yang
dihasilkan tidak identik dengan tanaman induknya.

       Cara lain yaitu tengantung dari jenis organ yang digunakan sebagai eksplan,
seperti pada tanaman Saintpaulias dan Begonia rex, eksplan yang digunakan biasanya
berupa: akar, daun atau tangkai daun, akan dihasilkan tunas yang dikenal dengan
istilah tunas advintif. Tanaman yang dihasilkan dari tenik ini adalah identik dengan
induknya. Jarang terjadi abnormalisasi genetic apabila digunakan tunas ketiak atau
ujung sebagai eksplan asal melalui pertumbuhan caulogenesis..
      Tunas yang diperoleh pada tahapan ini digunakan sebagai bahan perbanyakan
berikutnya, oleh karena itu pada tahapan ini dilakukan banyak sub kultur untuk
melipatgandakan jumlah plantlet yang dihasilkan. Pada tahapan ini, tunas yang
dihasilkan dipotong-potong dengan teknik single-node/ multiple node culture maupun
dengan mengambil pucuknya sebagai eksplan untuk perbanyakan. Bahan tersebut
kemudian ditanam pada media baru yang umumnya mengandung sitokinin pada
konsentrasi yang lebih tinggi dari auksin. Pada tahap ini dapat digunakan media cair
(media tanpa agar), semi padat maupun media padat. Dengan modifikasi media yang
sesuai, tunas-tunas baru akan tumbuh dari potongan eksplan. Tahapan ini umumnya
dilakukan sebanyak 8 – 10 kali sehingga akan dapat dihasilkan sejumlah besar tunas
(ribuan tunas) dari satu eksplan pada tahapan inisiasi. Tunas tersebut selanjutnya
dibesarkan atau diakarkan pada tahap mikropropagasi berikutnya.




    Tahap 3 : Persiapan plantlet sebelum aklimatisasi (tahapan pengakaran)

      Tunas atau plantlet yang dihasilkan dari tahapan ke 2 tersebut umumnya masih
sangat kecil atau tunas yang belum dilengkapi dengan akar sehingga belum mampu
untuk mendukung pertumbuhannya dalam kondisi in-vivo. Oleh karena itu, dalam
tahap ini masing-masing plantlet yang dihasilkan ditumbuhkan untuk pembesaran,
pengakaran dan perangsangan aktifitas fotosintesisnya. Teknik untuk mendapatkan
plantula yang siap untuk di pindahkan ke media terrestrial pada tahap IV antara lain,
adalah:

 (1) Media untuk pengakaran dan perpanjangan tunas. Media perakaran yang
      digunakan tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Kluster            tunas yang
      dihasilkan pada tahap II disimpan pada media tanpa ZPT dengan kelembaban
      yang sangat tinggi.

 (2) Individu tunas (propagul) disubkultur ke media dengan mengurangi konsentrasi
      atau tanpa penambahan sitokinin dan menambah konsentrasi auxin serta kadang
      dengan mengurangi konsentrasi senyawa anorganik. Pada beberapa jenis
      tanaman pengakaran dapat dilakukan dengan cara menempakan tunas hasil tahap
      II (propagul) diletakan pada aerasi media cair lebih baik dari pada pada media
      padat. Atau dengan cara memindahkan propagul ke media yang berisi auxin
      selama 1-2 hari, kemudian disubkultur lagi ke media tanpa auxin (induksi akar
      dipacu oleh adanya auxin, tetapi pertumbuhan akar dapat dihambat oleh
      keberadaan auxin dalam media). Atau propagul dicelupkan dalam larutan
      pangakaran (auxin) sebentar dan selanjutnya ditanam dalam medium tanpa
      auxin.

 (3) Tahapan pemanjangan ini dapat ditempuh dengan cara meletakan propagul
      medium agar tanpa atau dengan konsentrasi yang sangat rendah sitokinin
      selamas 2-4 minggu. Pada beberapa tanaman menggunakan penambahan GA3
      dalam medium. Selanjutnya propagul dipindahkan ke media lainnya seperti
      teknik sebelumnya.

 (4) Penggunaan media praaklimatisasi dan lingkungan kultur dengan penyinaran
      yang lebih intensitas cahayanya untuk perangsangan aktifitas fotosintesis
      misalnya penggunaan media dengan konsentrasi gula rendah/tanpa gula,
      penambahan intensitas cahaya, perlakuan dengan carbon dioksida, dll.



                               Tahap 4 : Aklimatisasi

     Tahapan aklimatisasi ini adalah tahap pemindahan plantet dari kondisi in-vitro
ke kondisi in-vivo. Tahap ini sangat penting dan harus dilakukan secara hati-hati,
karena jika tidak dilakukan dengan baik maka sebagian besar plantet yang dihasilkan
dapat mati/musnah. Plantlet dikeluarkan dari botol dan agar yang melekat pada
akarnya dibersihkan, direndam dalam larutan fungisida, lalu ditanam dalam kompos
atau medium porous yang bersih untuk merangsang pembentukan akar-akar
serabutnya. Untuk mencegah kematian plantlet akibat transpirasi, plantlet disungkup
dengan plastik atau ditempatkan pada ruangan dengan kelembaban tinggi, dengan suhu
ruangan dan diletakkan ditempat yang ternaungi dengan intensitas cahaya 30 %. Pada
kasus tertentu, daun tanaman disemprot dengan anti transpirant (misalnya Abscicic
acid) untuk mencegah penguapan yang terlalu besar dari daun. Secara perlahan,
kelembaban dikurangi dan intensitas cahaya ditambah untuk merangsang fotosintesis.
                      Gambar 31: Teknik mikropropagasi: dari eksplan diinisiasi
                      langsung untuk membentuk multiplikasi tunas; eksplan dapat
                      berasal dari jaringan meristem, pucuk atau tunas samping
                      (sumber: Taji, Kumar & Lakshmanan, 2002).


     Faktor-faktor Yang Berpengaruh Pada Keberhasilan Mikropropagasi


1. Genotip Tanaman
       Salah satu faktor yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis
eksplan dalam kultur in-vitro adalah genotip tanaman asal eksplan diisolasi. Hasil-
hasil penelitian menunjukkan bahwa respon masing-masing eksplan tanaman sangat
bervariasi tergantung dari spesies, bahkan varietas, tanaman asal eksplan tersebut.
Pengaruh genotip ini umumnya berhubungan erat dengan faktor-faktor lain       yang
mempengaruhi pertumbuhan eksplan, seperti kebutuhan nutrisi, zat pengatur tumbuh,
lingkungan kultur, dll. Oleh karena itu, komposisi media, zat pengatur tumbuh dan
lingkungan pertumbuhan yang dibutuhkan oleh masing-masing varietas tanaman
bervariasi meskipun teknik kultur jaringan yang digunakan sama.
       Perbedaan respon genotip tanaman tersebut dapat diamati pada perbedaan
eksplan masing-masing varietas untuk tumbuh dan beregenerasi. Masing-masing
varietas tanaman berbeda kemampuannya dalam merangsang pertumbuhan tunas
aksilar, baik jumlah tunas maupun kecepatan pertumbuhan tunas aksilarnya. Hal
serupa juga terjadi pada pembentukan kalus, laju pertumbuhan kalus serta regenerasi
kalus menjadi tanaman lengkap baik melalui pembentukan organ-organ adventif
maupun embrio somatik. Regenerasi dan perkembangan organ adventif dan somatic
embrio juga sangat ditentukan oleh varietas tanaman induk. Perbedaan pengaruh
genetik ini disebabkan karena perbedaan kontrol genetik dari masing-masing varietas
serta jenis kelamin tanaman induk.


2. Media Kultur
Perbedaan komposisi media, komposisi zat pengatur tumbuh dan jenis media yang
digunakan akan sangat mempengaruhi pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang
dikulturkan.

       a. Komposisi Media. Perbedaan komposisi media, seperti jenis dan komposisi
garam-garam anorganik, senyawa organik, zat pengatur tumbuh sangat mempengaruhi
respon eksplan saat dikulturkan. Perbedaan komposisi media biasanya sangat
mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan. Meskipun demikian, media
yang telah diformulasikan tidak hanya berlaku untuk satu jenis eksplan dan tanaman
saja. Beberapa jenis formulasi media bahkan digunakan secara umum untuk berbagai
jenis eksplan dan varietas tanaman, seperti media MS. Namun ada juga beberapa jenis
media yang diformulasikan untuk tanaman-tanaman tertentu misalnya WPM, VW dll.
Media-media tersebut dapat digunakan untuk berbagai tujuan seperti perkecambahan
biji, kultur pucuk, kultur kalus, regenerasi kalus melalui organogenesis dan
embriogenesis. Media yang dibutuhkan untuk perkecambahan biji, perangsangan
tunas-tunas aksilar umumnya lebih sederhana dibandingkan dengan media untuk
regenerasi kalus baik melalui organogenesis maupun embryogenesis.
       b. Komposisi Hormon Pertumbuhan. Komposisi dan konsentrasi hormon
pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan
dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon
pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung dari jenis
eksplan yang dikulturkan dan tujuan pengkulturannya.            Konsentrasi hormon
pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan
yang dikulturkan serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada
eksplan tersebut. Komposisi yang sesuai ini dapat diperkiraan percobaan-percobaan
yang telah dilakukan sebelumnya dibarengi percobaan untuk mengetahui kompisisi
hormon pertumbuhan yang sesuai dengan kebutuhan dan arah pertumbuan eksplan
yang diinginkan.
       Hormon pertumbuhan yang digunakan untuk perbanyakan secara in-vitro
adalah golongan auksin, sitokinin, giberelin, dan growth retardan. Auksin yang umum
dipakai adalah IAA (Indole Acetic Acid), IBA (Indole Butyric Acid), NAA
(Naphtalena Acetic Acid dan 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy Acetic Acid). Selain itu
beberapa peneliti pada beberapa tanaman menggunakan juga CPA (Chlorophenoxy
Acetic Acid). Sitokinin yang banyak dipakai adalah Kinetin (Furfuryl Amino Purine),
BAP/BA (Benzyl Amino Purine/Benzyl Adenine), 2i-P (2-isopentenyl Adenin).
Beberapa sitokinin lainnya yang juga digunakan adalah Zeatin, Thidiazuron dan PBA
(6(benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine). Hormon pertumbuhan golongan
giberellin yang paling umum digunakan adalah GA3, selian itu ada beberapa peneliti
yang menggunakan GA4 dan GA7, sedangkan growth retardant yang sering digunakan
adalah Ancymidol, Paraclobutrazol dan TIBA, AbA dan CCC.

       c. Keadaan Fisik Media. Media yang umum digunakan dalam kultur jaringan
adalah medium padat, medium semi padat dan medium cair. Keadaan fisik media akan
mempengaruhi pertumbuhan kultur, kecepatan pertumbuhan dan diferensiasinya.
Keadaan fisik media ini mempengaruhi pertumbuhan antara lain karena efeknya
terhadap osmolaritas larutan dalam media serta ketersediaan oksigen bagi pertumbuhan
eksplan yang dikulturkan.
       Media yang umum digunakan dalam mikropropagasi adalah semi-solid (semi
padat) media dengan cara menambahkan agar. Media semi padat ini digunakan karena
beberapa alasan antara lain 1) eksplan yang kecil mudah terlihat dalam media padat, 2)
selama kultur eksplan tetap berada pada orientasi yang sama, 3) eksplan berada di atas
permukaan media sehingga tidak diperlukan teknik aerasi tambahan pada kultur, 4)
orientasi pertumbuhan tunas dan akar tetap, dan 5) kalus tidak pecah seperti jika
ditempatkan pada media cair. Namun penambahan agar dalam beberapa kasus dapat
menghambat pertumbuhan karena 1) agar mungkin mengandung senyawa penghambat
yang dapat menghambat morfogenesis beberapa kultur atau memperlambat
pertumbuhan kultur, 2) eksudasi fenolik dari eksplan terserap oleh media yang
menempel dengan eksplan sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan eksplan, 3)
agar harus dicuci bersih dari akar sebelum diaklimatisasi, dan 4) perlu waktu yang
lebih banyak untuk mencuci gelas kultur misalnya botol-botol harus diautoklave untuk
melarutkan agar sebelum dicuci.



3. Lingkungan Tumbuh

       a. Suhu. Tanaman umumnya tumbuh pada lingkungan dengan suhu yang tidak
sama setiap saat, misalnya pada siang dan malam hari tanaman mengalami kondisi
dengan perbedaan suhu yang cukup besar. Keadaan demikian bisa dilakukan dalam
kultur in vitro dengan mengatur suhu siang dan malam di ruang kultur, namun
laboratorium kultur jaringan selama ini mengatur suhu ruang kultur yang konstant baik
pada siang maupun malam hari. Umumnya temperatur yang digunakan dalam kultur in
vitro lebih tinggi dari kondisi suhu in vivo. Tujuannya adalah untuk mempercepat
pertumbuhan dan morfogenesis eksplan.
      Pada sebagian besar laboratorium, suhu yang digunakan adalah konstan, yaitu
25C (kisaran suhu 17 - 32C). Tanaman tropis umumnya dikulturkan pada suhu yang
sedikit lebih tinggi dari tanaman empat musim, yaitu 27C (kisaran suhu 24 - 32C).
Bila suhu siang dan malam diatur berbeda, maka perbedaannya umumnya adalah 4 -
8C, variasi yang biasa dilakukan adalah 25C siang dan 20C malam, atau 28C siang
dan 24C malam. Meskipun hampir semua tanaman dapat tumbuh pada kisaran suhu
tersebut, namun kebutuhan suhu untuk masing-masing jenis tanaman umumnya
berbeda-beda. Tanaman dapat tumbuh dengan baik pada suhu optimumnya. Pada suhu
ruang kultur dibawah optimum, pertumbuhan eksplan lebih lambat, namun pada suhu
diatas optimum pertumbuhan tanaman juga terhambat abibat tingginya laju respirasi
eksplan.
      b. Kelembaban Relatif. Kelembaban relatif dalam botol kultur dengan mulut
botol yang ditutup umumnya cukup tinggi, yaitu berkisar antara 80 - 99%. Jika mulut
botol ditutup agak longgar maka kelembaban relatif dalam botol kultur dapat lebih
rendah dari 80%. Sedangkan kelembaban relatif di ruang kultur umumnya adalah
sekitar 70%. Jika kelembaban relatif ruang kultur berada dibawah 70% maka akan
mengakibatkan media dalam botol kultur (yang tidak tertutup rapat) akan cepat
menguap dan kering sehingga eksplan dan plantlet yang dikulturkan akan cepat
kehabisan media. Namun kelembaban udara dalam botol kultur yang terlalu tinggi
menyebabkan tanaman tumbuh abnormal yaitu daun lemah, mudah patah, tanaman
kecil-kecil namun terlampau sukulen. Kondisi tanaman demikian disebut "vitrifikasi"
atau "hiperhidrocity". Sub-kultur ke media lain atau menempatkan planlet kecil ini
dalam botol dengan tutup yang agak longgar, tutup dengan filter, atau menempatkan
silica gel dalam botol kultur dapat membantu mengatasi masalah ini.

      c. Cahaya. Seperti halnya pertumbuhan tanaman dalam kondisi in-vivo,
kuantitas dan kualitas cahaya, yaitu intensitas, lama penyinaran dan panjang
gelombang cahaya mempengaruhi pertumbuhan eksplan dalam kultur in-vitro.
Pertumbuhan organ atau jaringan tanaman dalam kultur in-vitro umumnya tidak
dihambat oleh cahaya, namun pertumbuhan kalus umumnya dihambat oleh cahaya.
       Pada perbanyakan tanaman secara in-vitro, kultur umumnya diinkubasikan
pada ruang penyimpanan dengan penyinaran. Tunas-tunas umumnya dirangsang
pertumbuhannya dengan penyinaran, kecuali pada teknik perbanyakan yang diawali
dengan pertumbuhan kalus. Sumber cahaya pada ruang kultur ini umumnya adalah
lampu flourescent (TL). Hal ini disebabkan karena lampu TL menghasilkan cahaya
warna putih, selain itu sinar lampu TL tidak meningkatkan suhu ruang kultur secara
drastis (hanya meningkat sedikit). Intensitas cahaya yang digunakan pada ruang
kultur umumnya jauh lebih rendah (1/10) dari intensitas cahaya yang dibutuhkan
tanaman dalam keadaan normal. Intensitas cahaya dalam ruang kultur untuk
pertumbuhan tunas umumnya berkisar antara 600 - 1000 lux . Perkecambahan dan
inisiasi akar umumnya dilakukan pada intensitas cahaya lebih rendah.
       Selain intensitas cahaya, lama penyinaran atau photoperiodisitas juga
mempengaruhi pertumbuhan eksplan yang dikulturkan. Lama penyinaran umumnya
diatur sesuai dengan kebutuhan tanaman sesuai dengan kondisi alamiahnya. Periode
terang dan gelap umumnya diatur pada kisaran 8 - 16 jam terang dan 16 - 8 jam gelap
tergantung varietas tanaman dan eksplan yang dikulturkan. Periode siang/malam
(terang/gelap) ini diatur secara otomatis menggunakan timer yang ditempatkan pada
skaklar lampu pada ruang kultur. Dengan teknik ini penyinaran dapat diatur konstan
sesuai kebutuhan tanaman.



4. Kondisi Eksplan
       Pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur jaringan sangat dipengaruhi oleh
keadaan jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan. Selain faktor genetis
eksplan yang telah disebutkan di atas, kondisi eksplan yang mempengaruhi
keberhasilan kultur adalah jenis eksplan, ukuran, umur dan fase fisiologis jaringan
yang digunakan sebagai eksplan.
       Meskipun masing-masing sel tanaman memiliki kemampuan totipotensi,
namun masing-masing jaringan memiliki kemampuan yang berbeda-beda untuk
tumbuh dan beregenerasi dalam kultur jaringan. Oleh karena itu, jenis eksplan yang
digunakan    untuk    masing-masing     kultur   berbeda-beda    tergantung   tujuan
pengkulturannya.
       Umur eksplan sangat berpengaruh terhadap kemampuan eksplan tersebut untuk
tumbuh dan beregenerasi. Umumnya eksplan yang berasal dari jaringan tanaman yang
masih muda (juvenil) lebih mudah tumbuh dan beregenerasi dibandingkan dengan
jaringan yang telah terdiferensiasi lanjut. Jaringan muda umumnya memiliki sel-sel
yang aktif membelah dengan dinding sel yang belum kompleks sehingga lebih mudah
dimodifikasi dalam kultur dibandingkan jaringan tua. Oleh karena itu, inisiasi kultur
biasanya dilakukan dengan menggunakan pucuk-pucuk muda, kuncup-kuncup muda,
hipokotil, inflorescence yang belum dewasa, dll. Jika eksplan diambil dari tanaman
dewasa, rejuvenilisasi tanaman induk melalui pemangkasan atau pemupukan dapat
membantu untuk memperoleh eksplan muda agar kultur lebih berhasil.
       Ukuran eksplan juga mempengaruhi keberhasilan kultur. Eksplan dengan
ukuran kecil lebih mudah disterilisasi dan tidak membutuhkan ruang serta media yang
banyak, namun kemampuannya untuk beregenerasi juga lebih kecil sehingga
dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk pertumbuhan dan regenerasinya.
Sebaliknya semakin besar eksplan, maka semakin besar kemungkinannya untuk
membawa penyakit dan makin sulit untuk diterilkan, membutuhkan ruang dan media
kultur yang lebih banyak. Ukuran eskplan yang sesuai sangat tergantung dari jenis
tanaman yang dikulturkan, teknik dan tujuan pengkulturannya.




                           Macam-macam Mikropropagasi


1. Produksi Tanaman dari Tunas-tunas Aksilar.
        Produksi tanaman dengan merangsang terbentuknya tunas-tunas aksilar
merupakan teknik mikropropagasi yang paling umum dilakukan. Ada 2 metode
produksi tunas aksilar yang dilakukan yaitu (1) kultur pucuk (shoot culture atau shoot-
tip culture) dan (2) kultur mata tunas (satu mata tunas: single-node culture; lebih dari
satu mata tunas: multiple-node culture). Kedua teknik kultur ini berdasarkan pada
prinsip perangsangan terbentuknya atau munculnya tunas-tunas samping dengan cara
mematahkan dominasi apikal dari meristem apikal.



2. Kultur Pucuk (Shoot Culture atau Shoot-Tip Culture).

Kultur Pucuk (Shoot culture) adalah teknik mikropropagasi yang dilakukan dengan
cara mengkulturkan eksplan yang mengandung meristem pucuk (apikal dan lateral)
dengan tujuan perangsangan dan perbanyakan tunas-tunas/cabang-cabang aksilar.
Tunas-tunas aksilar tersebut selanjutnya diperbanyak melalui prosedur yang sama
seperti eksplan awalnya dan selanjutnya diakarkan dan ditumbuhkan dalam kondisi in
vivo.
        Istilah yang digunakan untuk teknik kultur pucuk ini tergantung dari eksplan
yang digunakan. Jika eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk-pucuk apikal
(panjang  20 mm) saja maka tekniknya disebut sebagai “Shoot-tip Culture”, namun
bila eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk apikal beserta bagian tunas lain
dibawahnya disebut debagai “Shoot Culture”. Besar kecilnya eksplan yang digunakan
mempengaruhi keberhasilan kultur pucuk. Semakin kecil eksplan, semakin kecil
kemungkinannya untuk terkontaminasi oleh mikroorganisme namun semakin kecil
juga kemampuannya untuk beregenerasi dan memperbanyak diri. Sebaliknya, semakin
besar eksplan yang digunakan maka semakin besar kemampuannya untuk beradaptasi
dalam    kondisi   in-vitro,   namun   makin    besar   juga   kemungkinannya     untuk
terkontaminasi, makin banyak kebutuhannya akan media dan makin besar wadah/botol
kultur yang diperlukan. Oleh karena itu perlu diketahui ukuran eksplan yang sesuai
untuk masing-masing varietas dan spesies tanaman.
       Pertumbuhan pucuk, inisiasi dan perbanyakan tunas aksilar yang dihasilkan
umumnya dirangsang dengan cara menambahkan hormon pertumbuhan (umumnya
sitokinin) ke dalam media pertumbuhannya. Perlakuan ini dapat merangsang
pertumbuhan tunas samping dan mematahkan dominasi apikal dari pucuk yang
dikulturkan. Selain itu, dominasi apikal juga dapat dihilangkan dengan perlakuan-
perlakuan lain misalnya pemangkasan daun-daun yang terdapat pada buku-buku tunas
atau meletakkan eskpan dalam posisi horisontal (Gambar 2). Tunas-tunas aksilar yang
dihasilkan selanjutnya digunakan sebagai stek miniatur bagi proses perbanyakan
berikutnya. Dengan teknik ini dan dibarengi dengan sub kultur dapat diperoleh banyak
sekali plantet dari satu eksplan. Dengan membatasi jumlah sub kultur sampai
maksimal 8 – 10 kali dapat diperoleh klon tanaman yang “true-to-type”. Teknik ini
telah digunakan secara luas untuk perbanyakan tanaman termasuk tanaman
hortikultura seperti pisang, asparagus, anggrek Cymbidium, dll.

3. Kultur Mata Tunas (Single-node atau Multiple-node Culture) ( In-vitro Layering).

Kultur mata tunas ini merupakan salah satu teknik in-vitro yang digunakan untuk
perbanyakan tanaman dengan merangsang munculnya tunas-tunas aksilar dari mata
tunas yang dikulturkan. Seperti halnya kultur pucuk, eksplan yang digunakan dalam
kultur mata tunas dapat berasal dari tunas lateral, tunas samping atau bagian dari
batang yang mengandung satu atau lebih mata tunas (mengandung satu atau lebih
buku). Dikenal dua teknik kultur mata tunas yaitu (1) eksplan yang mengandung mata
tunas lebih dari satu ditanam secara horisontal di atas medium padat (teknik in-vitro
layering) atau (2) tiap buku yang mengandung satu mata tunas dipotong-potong dan
ditanam secara terpisah dalam tiap-tiap botol kultur.

       Seperti halnya teknik kultur pucuk, pertumbuhan tunas-tunas aksilar juga
berdasarkan pada prinsip pematahan dominasi apikal. Oleh karena itu, pertumbuhan
tunas-tunas aksilar ini terjadi jika eksplan (mata tunas) ditanam pada media yang
mengandung sitokinin dalam konsentrasi cukup tinggi sehingga sitokinin ini dapat
menghentikan dominasi pucuk apikal dan menyebabkan berkembangnya tunas-tunas
aksilar. Tunas aksilar yang terbentuk selanjutnya dipisah-pisahkan dan dapat langsung
ditanam pada media pengakaran sehingga diperoleh tanaman baru yang sempurna atau
digunakan kembali sebagai bahan tanam untuk perbanyakan selanjutnya. Tunas-tunas
tersebut selanjutnya diakarkan dan diaklimatisasi dan selanjutnya ditanam di lapangan.
Teknik ini telah lama dan banyak dipergunakan untuk perbanyakan tanaman
hortikultura seperti kentang, asparagus, melon, semangka, anggrek, dan banyak lagi
lainnya.


4. Induksi pembentukan tunas dari meristem bunga.
       Meristem bunga dapat juga dirangsang untuk membentuk tunas-tunas vegetatif
dalam kondisi in-vitro. Eksplan yang digunakan adalah inflorescence bunga yang
belum matang (immature inflorescences) yaitu yang belum membentuk organ-organ
kelamin jantan dan betinanya. Penggunaan infloresence yang telah dewasa akan
menghasilkan pembentukan organ bunga bukan kuncup vegetatif. Beberapa contoh
tanaman hortikultura yang diperbanyak dengan teknik ini adalah brokoli, kol bunga,
krisan dan sugar beat.


5. Inisiasi Langsung Tunas Adventif .
       Tunas adventif adalah tunas yang terbentuk dari eksplan pada bagian yang
bukan merupakan tempat asal terbentuknya (bukan dari mata tunas atau buku). Tunas-
tunas adventif ini dapat terbentuk langsung dari eksplan tanpa melalui proses
terbentuknya kalus terlebih dahulu. Teknik ini merupakan salah satu teknik
mikropropagasi yang juga banyak dilakukan dan dapat menghasilkan plantlet dalam
jumlah jauh lebih banyak dari teknik terdahulu (pembentukan tunas aksilar). Proses
pembentukan tunas adventif langsung dari jaringan eksplan seperti akar, pucuk dan
bunga disebut organogenesis. Terjadinya organogenesis dipacu oleh adanya
komponen-komponen seperti       medium, komponen endogen selama eksplan mulai
dikulturkan dan senyawa-senyawa yang terbawa selama inisiasi eskplan. Selain itu
organogenesis dipacu juga oleh keberadaan zat pengatur tumbuh eksogen di dalam
medium. Sebagai contoh rasio antara auxin yang tinggi: sitokinin akan menginduksi
eksplan kea rah pembentukan akar pada kalus tanaman tembakau tetapi sebaliknya jika
pemberian auxinrendah : sitokinin akan memacu kea rah tunas. Tunas dan akar
terbentuk pada beberapa lapis sel tipis pada eksplan beberapa spesies oleh adanya
perbedaan konsentrasi antara auxin dan sitokinin. Inisiasi akar dapat dipacu dengan
penambahan NAA dan zeatin dan pembentukan tunas dipacu dengan penambahan
sitokinin seperti Zeatin atau benzylaminopurine tanpa penambahan auxin. Pada
beberapa spesies organogenesis terbentuk pada lapisan epidermal selama kultur in
vitro, misalnya pada tanaman Begonia rex (Dodds dan Robert, 1983).
       Menurut Torrey (1966 dalam Dodds dan Roberts, 1983) membuat hipotesis
bahwa organogenesis dari kalus diinisiasi dengan pembentukan kluster sel-sel
meristem (meristemoid) mampu merespon pada factor-faktor dalam jaringan untuk
memproduksi primordium. Inisiasi pembentukan akar, tunas dan embrioid juga
dipengaruhi oleh factor-faktor internal alamiah.
       Beberapa factor yang berpengaruh terhadap rhizogenesis termasuk auxin,
karbohidrat, pencahayaan, fotoperiode. Pada beberapa kultur jartingan auxin memacu
pembentukan akar, sedangkan adanya auxin eksogen dapat menghambatnya dan
rhizogenesis dapat distimulasi oleh anti-auxin.
       Keberhasilan pembentukan tunas adventif secara langsung ini sangat
tergantung pada bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan serta sangat
dipengaruhi oleh spesies atau varietas tanaman asal eskpan tersebut. Pada tanaman
yang responsif, hampir semua bagian tanaman (daun, akar, batang, meristem, dll.)
dapat dirangsang membentuk organ adventif, namun pada tanaman lainnya tunas
adventif ini hanya dapat terbentuk pada bagian-bagian tanaman tertentu saja seperti
umbi lapis, embryo atau kecambah.
       Seperti halnya teknik mikropropagasi lainnya, tunas adventif secara langsung
ini terbentuk melalui serangkaian tahap mulai inisiasi (Tahap 1). Setelah eksplan
berada pada kondisi aseptis dan tunas mulai tumbuh, eksplan dapat langsung
disubkulturkan ke media perbanyakan (atau media yang sama dengan inisiasi:
tergantung varietas) untuk memperbanyak tunas-tunas adventif dari mata tunas
adventif yang telah terbentuk pada tahap sebelumnya. Tunas-tunas tersebut selanjutnya
dipisahkan, diakarkan dan diaklimatisasi untuk memproduksi tanaman lengkap dan
utuh yang dapat tumbuh dalam keadaan alamiah.
       Teknik ini telah banyak digunakan secara komersial untuk perbanyakan
tanaman-tanaman hortikultura khususnya tanaman-tanaman hias. Contoh tanaman hias
yang diperbanyak dengan teknik ini adalah tanaman-tanaman keluarga Gesneriaceae,
seperti Achimenes, Saitpaulia, Sinningia dan Streptocarpus. Pada tanaman-tanaman
tersebut, tunas langsung terbentuk dari eksplan daun tanpa pembentukan kalus terlebih
dahulu.


6. Somatic Embryogenesis Langsung.
          Embrio aseksual atau embrio somatik (somatic embryo) adalah embrio yang
terbentuk bukan dari penyatuan sel-sel gamet jantan dan betina atau dengan kata lain
embrio yang terbentuk dari jaringan vegetatif/somatik. Embrio ini dapat terbentuk dari
jaringan tanaman yang dikulturkan tanpa melalui proses yang dikenal dengan nama
“somatic embryogenesis”. Jika proses ini terbentuk langsung pada eksplan tanpa
melalui proses pembentukan kalus terlebih dahulu, maka prosesnya disebut “somatic
embryogenesis langsung (direct somatic embryogenesis)”.
          Beberapa jenis tanaman hortikultura (misalnya jeruk) dapat secara alamiah
membentuk embryo aseksual ini. Dalam kondisi alamiah, embrio aseksual ini dapat
terutama pada tanaman-tanaman yang bisa menghasilkan lebih dari satu embryo pada
bijinya misalnya pada jeruk, atau tanaman yang menghasilkan biji-biji vegetatif
(apomixis) misalnya pada manggis. Selain itu, embrio aseksual ini dapat juga
terbentyuk dari jaringan-jaringan tanaman seperti ovule, jaringan nukleus (nucellar
embryoni), jaringan integumun pada ovule (misalnya pada pepaya), jaringan
pembungkus biji/mesocaps pada wortel. Tanaman-tanaman tersebut dapat juga
membentuk embrio aseksual ini secara in-vitro.
          Dalam kondisis in-vitro, embrio aseksual ini dapat terbentuk secara langsung
dari eksplan-eskplan embrio (seksual/zygotic) dari golongan monokotil dan dikotil,
dari kecambah muda (hipocotyl dan cotyledon), dan bagian eksplan juvenil lainnya.
Embrio aseksual ini dapat digunakan sebagai salah satu cara perbanyakan tanaman
secara in-vitro. Embrio yang telah terbentuk dapat dimultiplikasi, selanjutnya melalui
beberapa proses perkembangan sampai masak dan dapat berkecambah membentuk
tanaman utuh. Tanaman ini selanjutnya diaklimatisasi dan ditanam pada kondisi
alamiahnya. Teknik ini digunakan untuk perbanyakan beberapa tanaman hortikultura
terutama anggrek dimana embrio aseksual (berupa protocorm like body, “plb”)
terbentuk dari dari meristem, daun, dll.



7. Pembentukan Organ Penyimpan cadangan makanan Mikro.
        Beberapa jenis tanaman dapat dikembangbiakkan secara vegetatif dengan
menggunakan organ penyimpanan seperti tuber, rhizome, bulbus, dll. Organ-organ
penyimpanan ini juga bisa dihasilkan pada tanaman-tanaman yang memang secara
alamiah memproduksi organ penyimpanan tersebut. Teknik untuk mendapatkan organ
penyimpanan ini sangat bervariasi tergantung pada jenis jaringan yang dikulturkan.
Organ penyimpanan mikro ini dapat digunakan sebagai bibit untuk penanaman
langsung di lapangan atau ditanam untuk produksi umbi-umbi bibit. Beberapa jenis
organ penyimpanan mikro yang telah dikembangkan adalah pembentukan umbi lapis
mikro (bulbil) pada amarylis dan lili paris, pembentukan corm mikro (cormlet) pada
gladiol, pembentukan protocorm pada anggrek dan pembentukan tuber mikro (tuberlet)
pada kentang.

1. Umbi Lapis Mikro (Bulbil) dan Corm Mikro (Cormlet).
       Umbi lapis mikro (bulbil/bulblet) dan kormus mikro (cormlet) dapat
dirangsang untuk terbentuk secara in-vitro pada spesies-spesies tanaman yang secara
alamiah dapat membentuk bulbus dan corm. Bulbil dapat terbentuk langsung pada
kuncup/tunas aksilar dan dapat pula terbentuk pada tunas adventif yang terbentuk dari
eksplan daun, ovary, inflorescence, dan diantara lapisan-lapisan daun bulbus.
       Dominasi tunas-tunas apikal seringkali menghambat terbentuknya tunas-tunas
adventif pada potongan eksplan bulbus. Sub-kultur potongan bulbus tersebut dapat
merangsang terbentuknya bulbil atau terbentuknya tunas-tunas adventif dimana bulbil
nantinya dapat terbentuk. Propagul yang dihasilkan dan diaklimatisasi dapat berupa
plantlet, plantlet yang mengandung bulbil atau dorman bulbil. Contoh tanaman yang
menghaslkan bulblet adalah lili, bawang-bawangan.
       Beberapa jenis tanaman monokotil lainnya dapat memproduksi organ
penyimpanan mikro pada dasar batangnya (corm), seperti pada gladiol. Cormlet pada
gladiol dapat terbentuk langsung pada jaringan eksplan, pada kalus, atau pada plantlet
yang telah berakar namun masih dalam botol kultur setelah daun-daunnya mengalami
senescence. Cormlet yang dihasilkan secara in-vitro ini dapat digunakan langsung
sebagai bibit di lapangan atau digunakan sebagai eksplan untuk kultur berikutnya.
 Gambar 32. Bulblet dan plantlet pada kultur in-vitro lili dari potongan umbi     Krek
             lili


2. Tuber Mikro (Tuberlet) Pada Kentang.
       Tanaman-tanaman yang secara alamiah dapat memproduksi tuber dapat juga
memproduksi tuber mikro (tuberlet) secara in-vitro dalam lingkungan kultur yang
sesuai. Dalam kultur in-vitro tuberlet ini dapat terbentuk langsung pada batang plantlet
dan tuber muncul pada tunas-tunas aksilar sepanjang tunasnya. Tuber ini biasanya
terbentuk pada batang plantlet yang ditanam dalam media yang mengandung sitokinin
pada konsentrasi tinggi. Tuber ini biasanya lebih mudah terbentuk pada kondisi gelap
dibandingkan dengan penanamannya dalam kondisi terang. Tuber mikro yang
dihasilkan secara in-vitro ini dapat langsung digunakan sebagai bibit di lapangan dan
dapat memproduksi tanaman kentang yang normal. Selain itu, tuberlet ini juga dapat
digunakan sebagai bahan tanam dasar untuk produksi umbi bibit kentang berkualitas.




Gambar 33: Pembentukan tuber kentang mikro yang diperoleh dari kultur pucuk
         umur 10 minggu setelah inisiasi , skala bar = 10 mm (Sumber: Trigiano &
         Gray, 2000)
1. Kultur Meristem Untuk Perbanyakan Klonal Anggrek.
       Selain pengecambahan biji anggrek, kultur jaringan juga digunakan untuk
perbanyakan vegetatif (perbanyakan klonal) anggrek. Dalam perbanyakan vegetatif ini
umumnya dihasilkan propagul yang identik dengan induk tanaman, sedangkan
perbanyakan dengan biji (perkecambahan) dapat menghasilkan propagul dengan sifat-
sifat yang beragam.
       Teknik pertama yang digunakan pada perbanyakan vegetatif anggrek adalah
kultur meristem. Morel (1960) menggunakan teknik kultur meristem ini untuk
memperoleh bibit bebas virus dari tanaman yang terinfeksi oleh virus. Teknik ini
kemudian dikembangkan untuk perbanyakan vegetatif anggrek yaitu dengan cara
mengkulturkan meristem, menumbuhkannya, membelahnya menjadi beberapa bagian,
msing-masing bagian dikulturkan, sub kultur ini dilakukan berulang-ulang. Dengan
teknik ini dapat diperoleh ratusan tanaman dari satu meristem. Kultur meristem ini
merupakan salah satu teknik komersial pertama untuk perbanyakan vegetatif anggrek.
       Bahan eksplan yang digunakan adalah batang anggrek (panjang 10 - 15 cm)
dengan daun-daun muda yang baru tumbuh. Batang anggrek ini dicuci dengan air
mengalir untuk mencuci tanah, kompos dan kotoran-kotoran lain yang melekat pada
batang anggrek. Daun-daun pada batang dikupas dengan hati-hati sampai tunas
sampingnya terlihat. Batang ini dicelupkan dalam alkohol 70% lalu disterilkan dalam
larutan sodium hypochlorite (10%) selama 10 - 15 menit dan dicuci dengan air steril
sebanyak 2 - 3 kali. Tunas-tunas sampingnya dipotong, meristem diisolasi dibawah
mikroskop binokuler dan dikulturkan dalam media steril yang telah disiapkan.
       Media yang digunakan dalam kultur meristem anggrek ini tidak jauh berbeda
dengan media lainnya. Beberapa media yang digunakan untuk perbanyakan anggrek
adalah Knudson 'C' (Knudson, 1946), Wimber (Wimber, 1963) atau Fonnesbech
(Fonnesbech, 1972) atau media MS (Murashige and Skoog, 1962).           Media yang
digunakan umumnya media padat, kecuali Cattleya yang dikulturkan dalam media
cair. Media ini dipadatkan dengan Bacto agar (8 - 10 %). Sebagai sumber karbon,
sukrose ditambahkan dalam media (20 gr/L), atau kombinasi glukose (10 %) dan
sukrose (10%).     Hormon pertumbuhan ditambahkan dalam media ini dalam
konsentrasi rendah. Auksin yang digunakan antara lain IAA, IBA, NAA atau 2,4-D
pada konsentrsi 1 mg/L karena diduga auksin dapat merangsang pertumbuhan akar.
Sitokinin yang digunakan umumnya adalah Kinetin dan BAP pada konsentrsi 0,5 mg/L
untuk merangsang pertumbuhan tunas. GA3 juga ditambahkan dalam media ini,
peranannya diduga untuk meningkatkan pertumbuhan plantlet dan menghambat
pembentukan protocorm. Media diatur keasamannya pada kisaran 5 dan 6. Botol-botol
kultur diinkubasikan dalam keadaan terang (12 sampai 18 jam) pada intensitas cahaya
150 M dan suhu rata-rata 22 - 28C.
       Meristem memperlihatkan responnya setelah dikulturkan selama 3 minggu.
Meristem membengkak, berwarna hijau lalu beberapa protocorm muncul. Sebelum
kuncup terminal terbentuk dan setelah ptotocorm berukuran 2-3 mm, protocorm
tersebut dikeluarkan, masing-masing protocorm dibelah menjadi 4 bagian dan ditanam
dalam media yang baru. Sub kultur dilakukan kembali setiap 6 minggu dengan
mengisolasi dan membelah protocorm yang terbentuk. Bila perbanyakan ini dianggap
cukup, protocorm dibiarkan dalam media media pertumbuhkan agar kuncup terminal
terbentuk yang kemudian berkembang menjadi plantlet. Plantlet dapat dipindahkan ke
kondisi in-vivo setelah 4 bulan dalam botol kultur. Dengan teknik ini, dapat diperoleh
250.000 plantlet dari 1 meristem dalam waktu 1 tahun.


2. Perbanyakan Pisang
       Salah satu tanaman buah-buahan yang diperbanyak secara komersial dengan
teknik kultur jaringan adalah pisang. Pisang biasanya diperbanyak secara vegetatif
menggunakan anakan atau bonggolnya. Ukuran anakan yang cukup besar menyulitkan
transportasi bibit dari satu tempat ke tempat penanamannya. Anakan yang diproduksi
oleh satu induk pisang ukuran dan umurnya beragam, sehingga sangat sulit untuk
memperoleh anakan berukuran seragam dalam jumlah memadai untuk perkebunan
pisang secara komersial. Perbanyakan klonal pisang dengan teknik kultur jaringan
dapat mengatasi kendala-kendala tersebut.
       Berbagai jenis bibit pisang lokal dan import telah diperbanyak dengan teknik
kultur jaringan ini, misalnya pisang barangan, mas, ambon hijau, ambon kuning dan
cavendish. Bibit pisang produksi kultur jaringan tersebut dewasa ini telah dijual secara
komersial dan dapat diperoleh dengan mudah.
       Metode dan tahapan perbanyakan yang digunakan untuk perbanyakan klonal
pisang ini serupa dengan metode perbanyakan lainnya. Teknik yang umum digunakan
adalah kultur meristem (meristem culture) atau kultur pucuk (shoot culture), selain itu
telah dicoba juga untuk mengkulturkan tangkai bunga inflorescence muda pisang.
       Meristem dan pucuk pisang diisolasi dari batang pisang pada bonggol pisang
yang tertutupi oleh pelepah-pelepah daun pisang. Eksplan yang digunakan untuk kultur
meristem umumnya adalah mata tunas pisang yang baru muncul pada bonggolnya.
Sedangkan untuk kultur pucuk, eksplan yang digunakan diperoleh dari anakan pisang
muda yang baru tumbuh dengan daun yang masih menggulung menyerupai pedang
(memiliki 2 - 3 daun) dengan panjang 20 - 40 cm. Anakan pisang yang sehat dan
tumbuh dengan subur dipisahkan dari induknya. Anakan tersebut dicuci sampai bersih
dengan air mengalir dan disabun untuk membuang sisa tanah dan kotoran-kotoran
yang melekat pada anakan pisang. Anakan pisang lalu disemprot dengan alkohol
(70%), pelepah daun-daun terluar (2 - 3 lapis) dikupas satu persatu sambil disemprot
dengan alkohol. Bagian bonggol, pucuk dipotong sampai diperoleh bahan eksplan
sepanjang  5 cm. Bagian ini dobawa ke laminar air flow lalu disterilkan dengan
sodium hypochlorite (2 %) selama 10 - 15 menit atau dibakar di atas lampu spiritus
selama 1 menit. Bahan eksplan dikupas secara aseptis, bagian yang mengandung
meristem lalu dibelah (2 sampai 4) dan dikulturkan dalam media yang telah
dipersiapkan. Kultur disimpan dalam rak-rak kultur dengan penyinaran 150 - 200 nm
per detik selama 10 - 14 jam dan suhu 20 - 25 C.
       Media yang digunakan untuk perbanyakan klonal pisang ini umumnya
adalah media MS (Murashige and Skoog, 1962) atau 1/2 MS. Media inisiasi kultur
pucuk umumnya adalah media semi padat. Media ini dipadatkan dengan Bacto agar (6
- 8 gram). Karbohidrat ditambahkan ke dalam media sebagai sumber karbon,
umumnya adalah sukrose (2 - 3 %). Untuk merangsang pertumbuhan tunas pada
eksplan, zat pengatur tumbuh umumnya ditambahkan ke dalam media kultur. Sitokinin
(BAP) umumnya digunakan pada kisaran konsentrasi 3 - 6 ppm tergantung varietas,
dengan atau tanpa kombinasi dengan auksin. Keasaman media umumnya adalah 5,5
sampai 6.


3. Perbanyakan Kentang
       Kentang merupakan salah satu jenis tanaman yang telah lama diperbanyak
dengan teknik kultur jaringan secara komersial. Perbanyakan kentang selama ini
umumnya dilakukan dengan umbi bibit (tuber). Produksi umbi bibit dapat dilakukan
sendiri oleh petani atau oleh produsen umbi bibit kentang. Umbi bibit yang digunakan
oleh petani bervariasi kualitas, yaitu umbi bibit generasi F4 sampai F6. Kekurangan
produksi umbi bibit ini dilapangan adalah kemungkinan infeksi umbi oleh patogen dan
virus yang terbawa oleh organ vegetatif ini. Lahan pertanian kentang di Indonesia
umumnya terinfeksi oleh virus. Virus yang terbawa oleh bibit kentang dapat
menurunkan produkstivitas tanaman kentang sebesar 10 - 15 % per generasi.
       Perbanyakan kentang dengan kultur jaringan dilakukan untuk memproduksi
bibit kentang berkualitas, bebas penyakit dalam jumlah yang banyak dalam waktu
singkat. Teknik perbanyakan klonal yang digunakan ditujukan untuk memproduksi
plantlet kentang atau umbi mikro kentang yang dapat digunakan langsung sebagai bibit
dilapangan atau untuk memproduksi umbi bibit yang digunakan untuk penanaman
kentang.
       Metode yang umum digunakan untuk produksi plantlet dan umbi mikro
kentang adalah teknik kultur meristem atau kultur satu mata tunas (single-node
culture). Kultur meristem digunakan untuk produksi bibit kentang bebas virus. Eksplan
(pucuk muda kentang) disterilkan dengan sodium hypochlorite (10 - 15 %) selama 10 -
15 menit lalu dibilas dengan air steril beberapa kali. Meristem diisolasi dibawah
mikroskop binokuler dan dikulturkan dalam media yang telah dipersiapkan. Untuk
perbanyakan dengan teknik single-node culture, daun-daun muda pada pucuk kentang
dibuang, batang dipotong (satu buku per eksplan), eksplan ditanam dalam media yang
telah dipersipkan. Kondisi kultur umumnya adalah terang dengan penyinaran 10 - 14
jam dan intensitas cahaya rendah (100 - 150 m per detik) dan suhu 15 - 25C.
       Media yang umum digunakan untuk perbanyakan kentang adalah media MS
baik dalam konsentrasi penuh atau 1/2 konsentrasi garam-garamnya. Media yang
digunakan umumnya adalah media yang dipadatkan dengan bakto agar ( 6 - 8 gr/L).
Ke dalam media awal ini umumnya ditambahkan sitokinin (BAP/BA 3 - 5 ppm) untuk
merangsang pertumbuhan tunas pada eksplan. Keasaman media biasanya diatur pada
kisaran 5 sampai 6.
       Eksplan yang dikulturkan memperlihatkan respon pertumbuhan dalam waktu
singkat. Meristem membesar seminggu setelah ditanam. Plumula berkembang menjadi
daun dan batang memanjang setelah 2 bulan dikulturkan. Setelah 4 bulan, tunas dapat
diperbanyak dengan metode single-node culture setelah dilakukan pengujian bahwa
tunas yang dihasilkan bebas virus. Tunas baru keluar dari buku-buku batang seminggu
setelah dikulturkan. Tunas ini memanjang sampai memiliki 5 - 6 buku dalam waktu 4
minggu. Tunas yang cukup panjang kemudian diisolasi, dipotong-potong kembali
menjadi 1 buku dan ditanam dalam media baru untuk perbanyakan. Setelah 7 - 10 kali
sub kultur, tunas tersebut dibiarkan selama 2 minggu sampai cukup panjang, lalu
dipindahkan ke media pengakaran (NAA 3 ppm). Setelah 1 sampai 2 bulan plantlet ini
siap dipindahkan ke lapangan.
       Tunas-tunas yang dibiarkan setelah 2 bulan dapat memproduksi umbi-umbi
mikro (tuberlet) bila ditanam dalam media yang sesuai. Produksi umbi mikro
umumnya dilakukan pada media dengan konsentrasi sukrose tinggi (30 gr/L) dan
dalam kondisi gelap atau intensitas cahaya rendah. Untuk memperoleh tuber mikro
(tuberlet) dengan ukuran yang diinginkan ( 0,2 mm), kultur harus tetap ditanam
dalam media dengan konsentrasi gula tinggi. Umbi mikro ini dapat dipanen dua bulan
setelah diproduksi. Dewasa ini masih dilakukan optimasi terhadap produksi umbi
mikro yang dihasilkan. Upaya yang dilakukan umumnya ditujukan untuk
meningkatkan produksi umbi mikro dengan ukuran yang diinginkan. Salah satu aspek
yang sedang dioptimalkan adalah upaya mempertahankan agar gula tersedia bagi
pengisian umbi sebelum terhidrolisa menjadi glukose.




   1. Bhojwani, 1990. Plant Tissue Culture: Application & Limitations.

   2. Bhojwani & Razdan, 1983. Plant Tissue Culture: Theory and practise.

   3. Debergh & Zimmerman, 1990. Micropropagation: technology & application.

   4. Evan, Sharp, Amminoto & Yamada., 1983/1984. Handbook of Plant Cell
       Culture (Vols 1 – 4).

   5. Gleba & Sytnik, 1984. Protoplast Fusion : Genetic Engineering in Higher
       Plants.

   6. Green, Somers, Hacket & Biesboer, 1987. Plant Tissue and Organ Culture.

   7. Jalil, M., N. Khalid & RY. Othman, 2003. Plant regeneration from
       embryogenic suspension cultures of Musa acuminata cv. Mas (AA). Plant
       Cell, Tissue and Organ Culture 75: 209–214, 2003.

   8. Lee, S.W. 2003. Micropropagation of cavendish banana in Taiwan. FFTC,
       Pingtung.
   9. Morris, Scragg, Stafford & Fowler, 1986. Secondary Metabolism in Plant Cell
       Cultures

   10. Pierik, 1987. In vitro Culture of Higher Plants.

   11. Reinert & Yeoman, 1983. Plant Cell & Tissue Culture: A Laboratory Manual.

   12. Rodrigues, I., 2007. Low-cos tissue culture technology. Centre of Nuclear
       Energy for Agriculture (CENA). San Paulo.

   13. Stafford & Warren, 1990. Plant Cell & Tissue Culture.

   14. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshamanan, 2002. In vitro plant breeding. The
       Haworth Press, Inc. New York.

   15. Thorpe, 1981. Plant Tissue Culture: Methods & Applications in Agriculture.

   16. Torres, 1989. Tissue Culture techniques for Horticultural Crops.

   17. Trigiano, R.N. and D.J. Gray, 2000. Plant tissue culture concepts and
       laboratory exercises. 2nd edt. CRC Press. London.

   18. Vasil, 1984. Cell Culture and Somatic cell Genetics of Plants.

   19. Yeoman, 1986. Plant Cell Culture Technology.




Kultur Kalus
       Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan
yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan
terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada
jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auxin dan sitokinin endogen (Dodds &
Roberts, 1983). Secara in vivo, kalus pada umumnya terbentuk pada bekas-bekas luka
akibat serangan infeksi mikro organisme seperti Agrobacterium tumefaciens, gigitan
atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai akibat stress
(George & Sherrington, 1984). Kalus yang diakibatkan oleh hasil dari infeksi bakteri
Agrobacterium tumefaciens disebut tumor.

        Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi
dan    ditumbuhkan     dalam   lingkungan   terkendali.   Kalus   diharapkan   dapat
memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus.

        Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang
renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari
potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan
kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular,
parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan
provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk
berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk
plantlet.

        Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus
tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh
terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal
dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari
jenis sumber eksplan itu diambel, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau,
kuning kejingga-jingaan (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus
kortek umbi wortel).

        Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkim jarang
dijumpai kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany (1977 dalam Dodds
& Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan
eksplan jaringan yang mempunyai sel-sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus,
citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel
sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis
dari kultur kallus. Anaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid
atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal,
primordial akar atau embrioid.

        Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu
penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada
jaringan berbambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka
yang terbuka. Namun pada jkasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert,
1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu             dapat menghambat
pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan
ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang
digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang
digunakan, seperti: 1) auxin; 2) sitokinin; 3) auxin dan sitokinin dan 4) ekstrak
senyawa organik komplek alamiah.

        Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus,
jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok:

       Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-
        garam mineral untuk dapat membentuk kalus seperti: umbi artichoke.
       Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam
        mineral seperti: empulur tembakau.
       Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam
        mineral seperti: jaringan kambium.
       Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral
        seperti parenkim dan xylem akar turnip.
Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari:

    1. Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi.
    2. Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi.
    3. Bagian tanamn yang dipakai.
    4. Jenis tanaman.
Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda
menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang
menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, Gymnospermae, pakis
dan moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda
merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus.

        Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa
pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di
lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap
quiscent. Faktor-faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di
lapisan luar dari jaringan kalus, adalah:

        Ketersesediaan oksigen yang lebih tinggi.
        Keluarnya gas CO2.
        Kesediaan hara yang lebih banyak.
        Penghambat yang bersifat folatik lebih capat menguap.
        Cahaya.
Dalam mempelajari proses pembentukan kalus sebagai akibat perlakuan, empat lapisan
sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-lapisan sel
yang berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kurtur terdiri:
         Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah.
         Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman.
         Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis.
         Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak membelah.
Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NAD-
diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat.
Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam
jaringan ini juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Padfa kultur artichoke, enzim
fosfatase diditeksi pada permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa
Yeoman pada tahun 1970, asam fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini
adalah index autolysis sel. Pada sel yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer,
terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut mengeluarkan persenyawaan yang
dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.

        Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus yang heterogen dengan
berbagai macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatannya seragam histologinya
seperti pembuluh tembakau, ternyata menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai
DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi yang berbeda. Begitupun pada
kultur akar kalus yang dihasilkan dapat berupa campuran sel dengan tingkat ploidi
yang berbeda.

     Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan
yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang
mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi
kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan sel-sel yang paling cepat
membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya.
Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang
ditambahkan ke dalam media.

     Sel heterogen berasal dari materi asal yang heterogen pula, atau dapat terjadi
karena massa kultur yang panjang melalui sub kultur yang berkali-kali. Perubahana
yang terjadi dapat merupakan:

    Aberasi kromosom
    endo-reduplikasi yang menghasilkan poloploidi
    Amplifikasi gen: jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid
     bertambah.
    Hilangnya suatu gen (deletion)
    Mutasi gen.
    Transposisi urutan DNA (DNA sequences transposition).
Kecepatan perubahan-perubahan dalam kromosom ini, tergantung juga dari macam
media yang digunakan, serta jenis tanamannya. Ketidak-stabilan kromosom ini
menyulitkan aplikasi kultur kalus untuk perbanyakan maupun untuk produksi bahan-
bahan/   persenyawaan     sekunder.    Sebaliknya   ketidak-stabilan   tersebut   dapat
dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan in vitro, untuk memperoleh sifat-sifat baru
yang menguntungkan seperti resistensi terhadap penyakit, hilangnya morfologi yang
memang tidak diinginkan seperti duri atau warna pada bunga.

     Kalus yang tumbuh secara in vivo pada batang tanaman biasanya disebut dengan
tumor, ciri-ciri tumor adalah sebagai berikut:

    Terjadi penyakit yang infeksinya melalui luka (Crown gall disease).
    Jaringan tumor yang terjadi dapat tumbuh terus, walaupun penyebabnya yang
     berupa bakteri Agrobacterium tumefacien telah dihilangkan.
    Tumor ini bila ditumbuhkan pada media buatan tidak memerlukan auksin
     maupun sitokinin. Ketidak-tergantungan jaringan tanaman untuk tumbuh dan
     terus membelah disebut habituation.
Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama           dalam media yang tetap, akan
menyebabkan terjadinya kehabisan hara dan air. Kehabisan hara dan air dapat terjadi
karena selain terhisap untuk pertumbuhan juga karena media menguapkan air dari
masa ke masa. Kalus tersebut kecuali kehabisan unsur hara, kalus juga mengeluarkan
persenyawaan-persenyawaan hasil metabolisme yang menghambat pertumbuhan kalus
itu sendiri. Untuk menjaga kehidupan dan perbanyakan yang berkesinambungan, kalus
yang dihasilkan perlu disubkulturkan.
     Street (1969 dalam Dodds & Robert 1983) menyarankan massa sel yang
dipindahkan pada subkultur harus cukup banyak antara 5-10 mm atau seberat 20-100
mg, supaya ada pertumbuhan yang cepat dalam media baru. Subkultur sebaiknya
dilakukan 28 hari sekali (4-6 minggu sekali). Namun waktu yang tepat untuk
memindahkan kultur, tergantung dari kecepatan pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2
macam yaitu massa yang remah (friable) dan kompak. Bila massa kalus remah maka
pemindahan kalus cukup dilakukan dengan menyedok kalus dengan spatula atau
skapel lasung disubkultur ke media baru. Namun bila kalus kompak mesti dipindah ke
petridish steril untuk dipotong-potong dengan skapel baru disubkultur ke media baru.
Kalur yang sudah melai mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya tidak ikut
disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik.

                                        Kultur Suspensi

       Penggunaan medium cair mempunyai beberapa keunggulan dibandingkan
medium padat, antara lain pada medium padat kalus yang tumbuh akan mengalani
gradient difusi terhadap nutrient di dalam medium dan gas di dalam kalus akan
menyebabkan pertumbuhan dan metabolismenya mengalami perubahan. Agar itu
sendiri akan melepas senyawa kimia ke dalam medium kultur dan kalus akan
mensekresi sisa-sisa metabolisme         ke dalam medium yang dapat meracuni
pertumbuhan kalus itu sendiri. Pada medium cair keberadaan oxygen adalah terlarut
dalam cairan medium, untuk memperolehnya maka medium harus digoyang (agitatic).

       Kultur suspensi sel harus digerak-gerakkan (goyang) untuk memperoleh aerasi,
untuk menggerakkan diperlukan alat penggoyang yang disebut dengan platform
(orbital) shaker (shaker yang arah goyangannya horizontal). Kecepatan gerakan yang
diperlukan dalam kultur suspensi sel untuk ukuran Erlenmeyer 250 cm3 adalah 100-
120 rpm. Isi medium dalam botol kultur yang optimum adalah 20% dari volume botol
kultur (Dodds & Robert, 1983).

       Eksplan yang diperlukan dalam kultur suspensi sel biasanya berupa kalus
remah. yang belum terdiferensiasi. Pembelahan sel akan terjadi secara bertahap dan
sel anakannya akan bebas terlepas dari sel induknya karena adanya goyangan dari
medium kultur, sehingga dalam kultur akan ditemukan sel tunggal, agregat selular
(kluster sel) dalam berbagai ukuran, residu inokulum, sel-sel kultur yang mati. Kultur
suspensi sel yang baik kualitasnya bila di dalam kultur tersebut sebagian besar berisi
sel tunggal dan kluster sel yang berukuran kecil-kecil. Keadaan seperti ini dapat
dikatakan kalus di dalam kultur bersifat remah. Kalus yang remah pada beberapa jenis
eksplan dapat distimulasi dengan formula ZPT konsentrasi auxin yang lebih tinggi
dibandingkan sitokinin, tetapi untuk jenis eksplan yang lain dapat saja menghambat
terbentuknya kalus yang remah. Disini tidak ada prosedur standar yang baku untuk
memproduksi kalus remah, jadi harus dilakukan coba-coba untuk jenis eksplan yang
berbeda-beda (Dodds & Robert, 1983).

      Suspensi Sel Untuk Memproduksi Produksi Senyawa Metabolik Sekunder

       Kultur suspensi biasanya dimulai dari mesubkultur potongan kalus ke media
cair, kecuali itu kultur suspensi juga dapat menggunakan potongan organ (seperti
hiopokotil, kotiledon dan lain-lain) sebagai ekplan hanya saja teknik ini memerlukan
waktu yang lebih lama. Pembelahan sel secara bertahap akan terlepas dari sel induk
bebas bergerak di dalam inokulum karena adanya gerakan dari medium. Setelah bebera
saat kultur akan tersusun atas: sel tunggal , kumpulan sel (agregate cellular) dengan
ukuran yang bervariasi, sisa potongan eksplan dan sisa-sisa sel mati. Dalam kultur
kalus dan suspensi sel dikenal istilah friabel yang maksudnya adalah sel-sel terpisah
setelah mengalami pembelahan sel. Bentuk suspensi sel yang bagus adalah kultur yang
persentasi kandungan      sel tunggal dan kumpulan sel-sel kecilnya tinggi. Derajat
pemisahan sel pada kultur telah dicirikan adanya sifat friabilitas dari sel tersebut, sifat
tersebut dapat dimunculkan atau diinduksi dengan merubah komposisi unsur hara
media. Seperti pada penambahan auxin dari pada sitokinin pada beberapa masalah
dapat memacu produksi sel yang friabel. Namun sebaliknya ada beberapa kultur malah
menjadi terhambat proses friabilitasnya. Jadi tidak ada prosedur standar yang dapat
direkomendasikan untuk memulai kultur suspensi sel dari kalus, maka untuk memilih
kondisi yang sesuai harus melakukan coba-coba (trial and error) (Dodds & Robert,
1982).

         Untuk mengkultur kalus ke kultur suspensi, pertama kali dibutuhkan kalus
seberat 2-3 g per 100 cm3. Pertumbuhan jumlah sel akan mengikuti pertambahan
eksponensial dan linier dalan populasi sel. Lama-lama kecepatan pembelahan sel akan
melambat dan akhirnya akan mencapai fase diam atau stationary. Agar sel tetap bisa
tumbuh maka pada awal fase diam sel-sel harus disubkultur pada media yang baru.
Setiap jenis tanaman akan mempunyai panjang waktu fase pertumbuhan dan fase diam
yang berbeda-beda. Pada kebanyakan kultur suspensi kerapatan optimum akan tercapai
pada umur 18-25 hari setelah tanam dan fase sel paling aktif pada umur 6-9 hari
setelah tanam. Salah satu contoh dari kultur sel suspensi sel pada tanaman Acer
pseudoplantanus mempunyai kerapatan sel kritis pada konsentrasi 9-15 x 103 sel/cm3.

Tanaman merupakan sumber bahan makanan bagi manusia,juga merupakan sumber
berbagai macam bahan kimia seperti:

         Bahan obat-obatan ($ 8 milyar, 1989)
         Enzyme
         Minyak dan lemak
         Agrokimia (insektisida, herbisida)
         Karet
         Penyedap makanan (aroma, warna, rasa)
         Bahan kontrasepsi
         Pemanis alam, Zat pewarna
         Pengharum (minyak wangi)
         Sebagian besar bahan kimia di atas (kecuali enzym) adalah merupakan
senyawa metabolik sekunder yaitu senyawa yang diproduksi oleh tanaman tetapi tidak
memiliki fungsi vital bagi metabolisme tanaman tersebut. Tujuan produksi senyawa
metabolik sekunder ini bagi tanaman antara lain:

         Mengusir peredator
         Menyerang pollinator
        Melawan penyakit-penyakit infeksi
        Senyawa metabolik sekunder tersebut bermanfaat bagi manusia dan dapat
dimanfaatkan untuk tujuan konsumsi, pengobatan, industri obat tradisional dan
modern, industri agrokimia berupa pestisida dan insektisida, industri farmasi dan
kosmetika dan lain-lain. Ekstraksi senyawa metabolik sekunder sebelumnya hanya
dilakukan langsung dari bagian tanaman tersebut melalui budidaya maupun eksploitasi
organ tanaman dan tumbuhan liar yang menghasilkan senyawa metabolik sekunder
tersebut. Selain produksi dan ekstraksi langsung dari organ tanaman, senyawa
metabolik sekunder yang diproduksi oleh jaringan tanaman dapat juga diproduksi
secara in vitro dalam kondisi kultur yang mendukung (misalnya Verpoorte dkk. 1999,
Adnane dkk. 2001, Kazufumi dkk. 2001).        Tujuan produksi senyawa metabolik
sekunder dalam kultur jaringan adalah untuk mendapatkan sel, kalus atau embrio
somatik yang dapat memproduksi senyawa kimia tersebut dalam jumlah besar untuk
kemudian mengekstrak senyawa kimia penting tersebut. Produksi senyawa metabolik
sekunder secara in vitro menggunakan bioreaktor pada kultur sel secara besar-besaran
merupakan salah satu cara yang digunakan oleh beberapa perusahaan industri untuk
memproduksi beberapa senyawa kimia secara komersial (Verpoorate dkk. 1999)

        Produksi senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan ini memiliki
beberapa kelebihan dan kekurangan. Keuntungan produksinya melalui kultur jaringan
dibandingkan dengan ekstraksi dari organ tanaman dan penanamannya di lapangan
antara lain:

1. Produksinya tidak tergantung pada lingkungan terutama musim sehingga
    produksinya bisa dilakukan setiap saat yang dapat menjamin kontinuitas produksi,
    kuantitas dan kualitasnya
2. Produksi senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan tidak membutuhkan
    tempat yang luas. Untuk produksi skala besar dalam dilakukan dalam suatu
    laboratorium dengan menggunakan bioreaktor.
        Meskipun memiliki kelebihan di atas, teknik ini membutuhkan ketrampilan dan
alat khusus dalam melakukannya. Untuk itu perlu mengetahui terlebih dahulu
pengetahuan tentang:

  1. Perkembangan Produksi Senyawa Metabolik Sekunder Melalui Kultur Jaringan
  2. Prosedur Produksi Senyawa Metabolik Sekunder Melalui Kultur Jaringan
  3. Teknik Peningkatan Produksi Metabolik Sekunder Melalui Kultur Jaringan




Perkembangan Produksi Senyawa Metabolik Sekunder Melalui Kultur Jaringan




          Sampai saat ini masih sedikit senyawa metabolik sekunder yang telah
diproduksi melalui kultur jaringan secara komersial. Beberapa jenis senyawa
metabolik sekunder yang telah diproduksi secara komersial melalui kultur jaringan
adalah:
1. Produksi Shikonin yaitu suatu senyawa napthaquinon yang digunakan sebagai
    bahan perwarna dan bahan obat-obatan telah diproduksi dalam skala komersial
    oleh Mitsui Petrochemical Co. Shikonin ini tergolong mahal dengan harga
    mencapai $ 5.000 per kilogram . Shikonin ini diproduksi dari Lithospermum
    erythrorhizon.
2. Produksi pyrethin dari Chrysanthemum
3. Produksi nikotin dalam konsentrasi tinggi dari beberapa kalus Nicotiana
4. Produksi Anthocyanin dari Euphorbia
5. Produksi ajmalisin yaitu suatu indol alkaloid dari tapak dara (Chatarantus roseus).
    Ajmalisin murni memiliki harga yang cukup tinggi yaitu mencapai Rp. 30 sampai
    40 juta per gram, yang digunakan untuk pengobatan kanker.
6. Produksi berberin dari Coptis japonica. coumarin dari Cichorium intybus L. cv.
    Lucknow
    (Hendaryono dan Wijayani 1999 1999, Adnane dkk. 2001, Bais dkk. 2001,
Kazufumi 2001).
        Sedikitnya senyawa metabolik sekunder yang telah diproduksi secara
komersial antara lain disebabkan oleh masih rendahnya kuantitas produksi senyawa
tersebut dalam kultur jaringan. Oleh karena itu, tujuan produksinya melalui kultur
jaringan adalah untuk memproduksi sel, kalus atau embrio somatik yang dapat
memproduksi senyawa metabolik sekunder dalam kuantitas dan kualitas yang lebih
tinggi dibandingkan dengan produksinya pada tumbuhan sehingga teknik ini dapat
mendatangkan keuntungan secara ekonomi. Beberapa contoh perbandingan produksi
senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan dengan isolasinya di daun anata
lain:
1. Kultur sel Coleus dapat memproduksi 15% rosmaric acid dari berat basah sel
    padahal isolasi dari tanaman langsung hanya mampu memproduksi 3 % rosnaric
    acid.
2. Kultur kalus Lithospermum dapat memproduksi 27 % dari Ginsengoside dario
    berat basah kalus sedangkan isolasinya dari tanaman hanya mampu memproduksi 5
    % Lithospermum.
3. Kultur sel dari daun tembakau dapat memproduksi 3 – 4 % nikotin dibandingkan
    dengan isolasinya dari daun tanaman sebesar 2,5 %
4. Kultur kalus ginseng hanya mampu memproduksi 0,4 % ginsenisida padahal
   isolasi dari tanaman dapat menghasilkan 0,3 - 3 % ginsenisida
5. Kultur sel baru dapat memproduksi 0,5 % ubiquinone padahal isolasi dari daun
   dapat menghasilkan sampai 16 % ubiquinone.


      Berikut dikemukakan beberapa jenis senyawa matabolik sekunder yang
produksinya telah dicoba melalui kultur jaringan beserta asal tanaman dan
penggunaannya.


       Tabel 11. Kandungan senyawa kimia pada berbagai marga tanaman dan
                                   manfaatnya.
                                   N   SENYA       MARGA           PENGGUNAAN
                                   o   WA          (GENUS)
                                       KIMIA
                                   1   Digitoxin Digitalis         Penyakit jantung
                                   2   Quinine     Chichona        Anti malaria
                                   3   Taxol       Taxus           Anti tumor
                                   4   Morphin     Papaver         Penghilang rasa sakit
                                       e
                                   5   Saponin     Panax           Sirkulasi darah
                                   6   Pyrethin    Pyrethru        Insektisida
                                                   m
                                   7   vinblasti   Catharant       Obat Anti kanker
                                       ne          hus
                                   8   Minyak      Mentha          Parfum
                                       mint
                                   9   Minyak      Lavendul        Parfum
                                       Lavender    a


                                   1   Minyak                R     Parfum
                                   0   mawar       osa
                                   1   Vanillin    Vanilla         Flavour/penyedap
                                       1
                                       1   Caffeine   Coffee      Flavour/penyedap/sti
                                       2                          mulan
                                       1   Nicotine   Nicotiana   Stimulan
                                       3
                                       1   Cocaine    Erythoxie   Hallucinogen
                                       4              n




Prosedur Produksi Senyawa Metabolik Sekunder Melalui Kultur Jaringan




                                Seperti teknik kultur jaringan lainnya, produksi
senyawa metabolik sekunder secara in-vitro juga dilakukan melalui serangkaian
tahapan. Di depan telah dijelaskan bahwa tujuan dari kultur ini adalah untuk
mendapatkan kalus, sel atau embrio somatik dalam tahapan pertumbuhan tertentu
dimana pada saat tersebut diproduksi dan dapat diekstraksi senyawa metabolik
sekunder dalam kuantitas dan kualitas yang memadai. Oleh karena itu, 2 prosedur
dasar teknik ini diarahkan pada produksi kalus, sel atau somatik embrio kemudian
optimasi kondisi kultur kalus, sel atau somatik embrio untuk produksi senyawa
metabolik sekunder dalam kuantitas dan kualitas yang tinggi. Tahapan in-vitro ini
dibarengi dengan ekstraksi secara berkala terhadap senyawa metabolik sekunder yang
dihasilkan. Untuk dapat menghasilkan senyawa metabolik sekunder, prosedurnya
adalah sebagai berikut:

1. Pemilihan eksplan dan sterilisasi
       Pada umumnya semua jenis eksplan dapat digunakan untuk produksi senyawa
metabolik sekunder. Bohm (1980) menyatakan bahwa pada umumnya senyawa
metabolik sekunder yang diproduksi oleh organ tanaman yang berbeda umumnya sama
meskipun pada kondisi alamiah senyawa yang dihasilkan oleh masing-masing organ
tersebut berbeda. Meskipun demikian, produksi yang optimal sangat tergantung pada
jenis eksplan yang digunakan. Optimasi jenis dan kondisi eksplan merupakan tahapan
awal dalam produksi senyawa metabolik sekunder. Optimasi ini dibarengi dengan
optimasi teknik sterilisasi eksplan. Sterilisasi eksplan dari organ atau jaringan tanaman
yang diambil dari tanaman di lapangan dapat dilakukan secara kimia misalnya dengan
sodium hypochorite pada konsentrasi 1 – 2 % (v/v). Pada beberapa jenis eksplan,
sterilisasi dapat dilakukan dengan cara pembakaran (misalnya untuk eksplan berupa
endosperm atau embrio). Salah satu eksplan yang termasuk sulit disterilisasi adalah
eksplan dari akar atau bagian tanaman lain yang diambil dari dalam tanah (misalnya
tuber). Sterilisasi untuk eksplan ini dapat dilakukan dengan menggunakan Mercuri
chloride, akan tetapi karena senyawa ini berbahaya bagi manusia maka akar umumnya
diisolasi dari akar steril yang ditumbuhkan secara in-vitro dengan teknik kultur embrio
atau kultur akar.

2. Inisiasi dan proliferasi kalus
       Inisisasi kalus dilakukan pada berbagai jenis media. Kalus umumnya diinisiasi
pada media padat. Umumnya ke dalam media ditambahkan hormon tanaman (Plant
Hormon) yang sesuai untuk pertumbuhan dan proliferasi kalus. Hormon tersebut
umumnya adalah 2,4-D atau campuran auksin dan sitokinin dalam proporsi yang
seimbang. Untuk inisiasi dari daun mahkota dewa, misalnya digunakan 2,4-D pada
konsentrasi 5 mg/l sedangkan inisiasi kalus dari akar tapak dara dilakukan pada media
padat dengan penambahan 2 mg/l IAA dan 2 mg/l BAP. Proliferasi kalus dapat
dilakukan pada media dengan konsentrasi hormon yang sama. Proliferasi ini ditujukan
untuk memperoleh kalus dalam jumlah yang memadai.

        Seleksi lini kalus yang berproduksi tinggi

       Umumnya kalus dapat memproduksi senyawa metabolik sekunder setelah
beberapa lama dalam kultur. Meskipun demikian, produktivitas dari kalus tersebut
sangat tergantung pada tahapan pertumbuhannya. Saat produksi dan jumlah senyawa
metabolik sekunder yang dihasilkan oleh masing-masing kalus tersebut berbeda
tergantung dari tingkat pertumbuhan kalus dan kondisi kulturnya. Umumnya produksi
senyawa metabolik sekunder yang tinggi terjadi pada saat kalus sedang dalam
pertumbuhan maksimal yang diperoleh saat pertumbuhan linier. Oleh karena itu dalam
proses produksi senyawa metabolik sekunder dari kalus, sangat penting untuk
mengetahui tahapan peryumbuhan kalus ini. Hal ini dapat dilakukan dengan
pengamatan terhadap pertumbuhannya kemudian membuat grafik pertumbuhan kalus.
Lini kalus yang berproduksi tinggi tersebut kemudian diseleksi untuk kemudian
dikulturkan dalam bentuk kultur agregat sel, kultur sel atau diregenerasikan menjadi
embrio.




3. Inisiasi kultur sel, agregat sel atau embrio somatik dan produksi senyawa
   metabolik sekunder.
       Senyawa metabolik sekunder umumnya diekstraksi dari kultur agregat sel,
kultur sel dan sel suspensi atau kultur embrio somatik. Lini kalus yang terpilih
kemudian di-subkultur-kan ke media untuk produksi senyawa metabolik sekunder.
Pada media ini, konsentrasi hormon tanaman yang ditambahkan umumnya sama atau
lebih rendah dengan kondisi untuk proliferasi kalus.

       Produksi senyawa metabolik sekunder dapat dilakukan pada media padat atau
media cair. Senyawa metabolik sekunder dapat diekstraksi langsung dari kalus atau
dari media. Hal ini menyebabkan produksinya pada media padat kurang optimal
karena pada media padat eksudat tersebut sering kali terkumpul pada media di sekitar
eksplan sehingga meracuni kalus. Untuk mengatasi hal ini dilakukan produksi pada
media cair. Lini kalus terpilih di subkulturkan ke media cair. Kumpulan kalus dalam
kultur cair ini disebut sebagai kultur agregat sel, selaian dalam bentuk kelompok, kalus
ini dapat digunakan untuk produksi kultur sel yang kemudian dicairkan membentuk
kultur sel suspensi. Kultur ini umumnya diletakkan di atas alat penggojok (shaker)
untuk menjamin suplai oksigen ke eksplan. Senyawa yang diproduksi oleh kultur cair
ini ada yang harus diekstrak dari sel dan sebagian disekresikan ke media. Apabila hasil
sekresi ini terakumulasi di dalam media, senyawa metabolik bisa beracun bagi
pertumbuhan sel selanjutnya dan dapat menyebabkan kultur mati atau tumbuh
suboptimal. Oleh karena perlu dilakukan subkultur atau ekstraksi senyawa metabolik
sekunder secara berkala.
       Selain ekstrasksi dari kultur kalus, kultur sel dan suspensi, beberapa jenis
senyawa metabolik sekunder diproduksi secara optimum dari kalus atau sel yang telah
berdiferensiasi menjadi embryo, baik dalam kultur dalam kultur padat maupun cair
(suspensi). Contohnya adalah produksi flavour dari wortel dan minyak jojoba dari
daun mangkokan.

       Pada produksi skala besar telah dikembangkan bioreaktor. Bioreaktor memiliki
volume besar, lebih dari 1 liter media dengan lebih dari 60.000 embryo/kelompok sel.
Bioreaktor yang ditempatkan secara pararel memungkinkan perkembangan sel menjadi
embrio dalam satu unit atau beberapa reaktor. Umumnya sel ditanam dlm media cair
dg pengadukan. Pengadukan bisa dilakukan secara mekanis (misalnya dengan
penggojokan, penggunaan alat pengaduk) atau dengan memasukkan udara steril
(gerakan udara) ke dalam bioreaktor.




4. Ekstraksi dan pemurnian senyawa metabolik sekunder
         Ekstraksi dapat dilakukan dari kalus, sel atau embrio somatik serta dari
media. Ekstraksi dari media umumnya dilakukan secara berkala dengan interval waktu
2 hari sekali. Media yang mengandung senyawa metabolik sekunder diambil secara
aseptis dari kultur bersamaan dengan penambahan media baru ke dalam kultur. Pada
saat produksi senyawa metabolik sekunder dari kalus, sel dan embrio somatik ini mulai
menurun, kalus, sel dan embrio somatik ini dikeluarkan dari kultur atau bioreaktor dan
diganti dengan kalus, sel dan embrio baru. Senyawa metabolik sekunder dari kalus, sel
dan embrio baru diekstraksi dengan menggunakan bahan pengekstrak, seperti alkohol
(misalnya methanol) atau DCM. Ekstraksi dari kalus dilakukan setelah kalus
dikeringkan.


                  Teknik Peningkatan Produksi Metabolik Sekunder Melalui Kultur
                                            Jaringan




                 Berbagai macam faktor mempengaruhi keberhasilan produksi
                 senyawa metabolik sekunder yang dihasilkan. Selain itu, beberapa
                 faktor juga menentukan kuantitas dan kualitas senyawa metabolik
                 sekunder yang dihasilkan.
   Pada prinsipnya setiap sel memiliki kemampuan untuk memproduksi senyawa
metabolik sekunder yang diproduksi oleh tanaman. Oleh karena itu, berbagai macam
eksplan baik berupa organ dan jaringan dari daun, batang, akar, bunga dan buah dapat
digunakan sebagai eksplan. Akan tetapi, pada setiap jenis tanaman terdapat bagian
organ tertentu yang dapat memproduksi senyawa metabolik sekunder yang diinginkan
dalam kuantitas dan kualitas yang memadai. Pada mahkota dewa (Phaleria
macrocarpa L. atau P. papuana L), produksi alkaloid dan flavonoid yang lebih tinggi
dijumpai dari eksplan daun dan endosperm (Nikmatullah dkk., 2003) dan produksi
diterpane glycosida yang optimal diperoleh dari kultur daun Nicotiana attenuata
(Keinanen dkk. 2001), sedangkan pada kultur tapak dara (Chataranthus roseous L.)
produksi ajmalisin yang tinggi diperoleh dari eksplan akar tapak dara yang diambil
dari kultur steril secara in-vitro (Muspiah, 2001) dan produksi shikonin juga diperoleh
dari kultur akar Lithospermum erythrorhizon (Kazufumi 2001).
   Selain jenis eksplan, perbedaan kondisi kultur juga mempengaruhi kualitas dan
kuantitas senyawa metabolik sekunder yang dihasilkan Bohm (1980), Verpoorte et.al.
(1999), Adnane et.al., (2001), Kazufumi et.al. (2001) Bohm (1977) dalam Bohm
(1980), menyatakan bahwa cahaya dan auksin merupakan dua faktor yang sangat
mempengaruhi produksi falvonoid dan pigmen lainnya dalam kultur. Kultur sel dan sel
suspensi yang ditanam dalam kondisi terang (dengan pencahayaan) memproduksi
enzym yang berperan dalam biosintesis flavonoid, sehingga produksi flavonoid pada
sel tersebut meningkat. Pada kultur kultur sel persley misalnya, aktivitas enzym
phenylalanine amonia-lyase (PAL), cinnamic acid-4-hydroxylase dan p-coumarate:
CoA ligase meningkat setelah sel parsley diinkubasikan di bawah penyinaran sehingga
flavonoid diproduksi oleh sel tersebut (Bohm, 1980). Akan tetapi tidak semua senyawa
metabolik sekunder dapat meningkat produksinya pada suasana kultur terang. Pada
makuto dewo, golongan saponin dan alkaloid diproduksi dalam suasana gelap dan
terang. Beberapa jenis alkaloid sebelumnya ada yang hanya dapat diisolasi dari kultur
dalam suasana terang saja atau gelap saja atau dalam suasana gelap dan terang.
Misalnya, arborinine hanya dapat diisolasi dari kultur Ruta graveolens yang
dikulturkan dalam suasana terang (Szendrei et.al., 1976) sedangkan ajlamicine (19-epi-
ajmalicine) dapat diproduksi oleh sel Catharanthus roseus dalam suasana gelap
(Vaportee et.al., 1991).
       Selain hal tersebut di atas, komposisi (unsur hara dan hormon pertumbuhan)
serta kondisi fisik media juga ikut menentukan kuantitas dan kualitas senyawa
metabolik sekunder yang dihasilkan seperti telah disampaikan sebelumnya.
       Degan memahami faktor-faktor yang mempengaruhi kuantitas dan kualitas
metabolik sekunder yang diproduksi tersebut, optimasi produksi metabolik sekunder
dapat dilakukan, anatara lain dengan:
1. Immobilisasi Sel
       Pertumbuhan agregat kalus, sel, dan embrio meningkat pada kultur cair,
   demikian juga produksi senyawa metabolik sekunder. Pada kultur cair, sintesa dan
   ekstraksi   metabolik   sekunder     dapat   dilakukan   secara   maksimum   tanpa
   mengganggu perttumbuhan sel atau embrio. Hal ini dapat dilakukan dengan
   meletakkan sel pada gel, busa polyurethin, jaring nylon dan serat sehingga pada
   saat diekstrak, sel melekat pada gel, busa polyurethin, jaring nylon dan serat
   tersebut dan tidak ikut keluar bersama medianya.
2. Biotransformasi.
       Transformasi sel dapat dilakukan secara biologi sehingga dapat dihasilkan
   senyawa metabolik sekunder yang diharapkan. Salah satu contohnya adalah
   penggunaan enzym untuk yang terdapat dalam sel tanaman untuk menghasilkan
   struktur kimia dari senyawa kimia lain yang diletakkan dalam media kultur.
   Contohnya adalah penambahan enzym dalam media untuk merubah digitoxin
   menjadi digoxin oleh sel Digitalis lantana. Digoxin ini digunakan untuk mengobati
   penyakit hepatitis.
3. Pengguaaan Elicitor
       Ragi dapat digunakan sebagai elicitor yang meningkatkan produksi senyawa
   metabolik sekunder dalam kultur jaringan. Ragi berupa Sacharomycetes yang
   ditambahkan pada kultur agregat sel Catharantus rosesous L. dapat meningkatkan
   produksi ajmalisin dari kultur tersebut. Diduga adanya ragi yang melekat pada
   kalus, sel atau embrio akan merangsang kalus, sel atau embrio tersebut
   mengeluarkan metabolik sekunder.
1. Adnane H, Huguette S, Chantal B, 2001. Effects of plant growth regulators on
   the growth and pyrethrin production by cell cultures of Chrysanthemum
   cinerariaefolium. Australian-Journal-of-Botany. 49 (1): 81-88.

2. Bais HP, Sudha G, George J and Ravishankar GA, 2001. Influence of
   exogenous hormones on growth and secondary metabolite production in hairy
   root cultures of Cichorium intybus L. cv. Lucknow Local. In Vitro Cellular and
   Developmental Biology Plant 37 (2): 293-299.

3. Bohm H., 1980. The formation of secondary metabolites in plant tissue and cell
   cultures. In: Vasil I.K. (Ed): International Review of Cytology : Perspectives in
   Plant Cell and Tissue Culture. Academic Press Inc., Yew Yok. pp. 183 – 208.

4. Chawla, H.S. 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd Edt. Science
   Publishers, Inc. New Hampshire.

5. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture.
   Cambridge University Press. London. 178 p.
6. George E.F. and P.D. Sherington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture:
   Handbook and Directory for Commercial Laboratories. Exegetics, England.
   709 p.

7. George E.F., 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: The Technology.
   Exegetics, England. 574 p.

8. Kazufumi Y, 2001. Root-specific production of secondary metabolites:
   Regulation of shikonin biosynthesis by light in Lithospermum erythrorhizon.
   Natural Medicines 55 (2): 49-54.

9. Keinanen M, Oldham NJ, Baldwin IT, 2001. Rapid HPLC screening of
   jasmonate-induced increases in tobacco alkaloids, phenolics, and diterpene
   glycosides in Nicotiana attenuata. Journal of Agricultural and Food Chemistry
   49 (8): 3553-3558.
10. Kyong KH, Ryang OS, Kyu LH dan Hoon H, 2001. Benzothiadiazole enhances
   the elicitation of rosmarinic acid production in a suspension culture of
   Agastache rugosa O. Kuntze. Biotechnology Letters. 23 (1): 55-60.

11. Majada JP, Sierra MI dan Sanchez TR, 2000. One step more towards taxane
   production through enhanced Taxus propagation. Plant Cell Reports 19 (8):
   825-830.

12. Nikmatullah A., Karwati Z. dan IGMA Parwata, 2003. Studi Produksi
   Senyawa Metabolik Sekunder Secara In-vitro Pada Kalus Makuto Dewo
   (Phelearia papuana L.).1 Laporan Penelitian, Universitas Mataram. 30 h.
13. Roman K, Marketa S dan Jan V (2001). Gas-chromatographic determination of
   S-methylcysteine sulfoxide in cruciferous vegetables.European Food Research
   and Technology 213 (4-5): 386-388.

14. Roman K, Marketa S, Jan V, 1999. Gas chromatographic determination of S-
   alk(en)ylcysteine sulfoxides. Journal of Chromatography 862 (1): 85-94.

15. Verpoorte R, Heijden VR, Hoopen HJG, Memelink J, 1999.             Metabolic
   engineering of plant secondary metabolite pathways for the production of fine
   chemicals. Biotechnology Letters 21 (6): 467-479.

16. Verpoorte R, Heijden VR, Memelink J, 2000. Engineering the plant cell factory
   for secondary metabolite production. Transgenic Research 9 (4-5): 323-343.

17. Wagner H., S. Baht, E.M. Zgainski, 1983. Plant Drug Analysis. Springer-
   Verlag, Berlin, New York.
       Tanaman haploid adalah tanaman yang mempunyai jumlah kromosom sama
dengan gametofitik dalam sporofitik (Bajaj, 1983). Frekuensi terjadinya haploid
spontan di alam masih sangat rendah , yakni sekitar 0,001-0,01%. Produksi haploid
yang spontan biasanya terjadi melalui proses partenokarpi dari telur yang tidak
dibuahi atau apomiksis.
Dalam percobaan-percobaan terdahulu (sebelum tahun), haploid diperoleh melalui:
   1. Hibridisasi jenis tanaman yang berada (distant hybridization).
   2. Polinasi tertunda (delayed pollination).
   3. Penggunaan polen yang sudah di-radiasi.
   4. Perlakuan hormon.
   5. Shock dengan temperatur tinggi.
       Revolusi dalam produksi tanaman haploid terjadi pada tahun 1064-1966,
semenjak dihasilkannya tanaman haploid dari Datura innoxia oleh Guha dan
Maheswari. Tanaman dihasilkan melalui kultur anther dengan proses androgenesis.
Haploid pada tanaman dapat digolongkan menjadi 2 golongan yaitu:

 1.Monoploid : jumlah khromosom setengah dari kromosom spesies yang diploid.
 2.Polihaploid: jumlah kromosom setengah dari kromosom spesies yang poliploid.



                  Kegunaan haploid dalam pemuliaan tanaman:

1. Tanaman haploid dapat digunakan untuk mandeteksi mutasi dan rekombian yang
   unik.. Mutasi yang resesif tidak muncul dalam keadaan diploid. Contohnya pollen
   dari hibrida antara MC-160 dan Coker-139 yang ditumbuhkan dihasilkan lini-lini
   tanaman baru yang menunjukkan resistensi terhadap penyakit layu bakteri dan
   Black Shank yang lebih tinggi. Lini baru ini tidak kehilangan sifat unggul MC-
   1610 (Gunawan, 1988).
2. Penggandaan jumlah kromosom akan diperoleh tanaman homozigot. Tanaman
   homozigot sangat penting untuk menghasilkan hibrida terkendali, seperti tanaman
   Asparagus. Tanaman Asparagus officinale merupakan tanaman dioeceous yang
   menghasilkan bungan betinan dan bunga jantan pada tanaman yang berlainan.
   Tnaman jantan lebih disukai konsumen karena produksi eebungnya lebih tinggi
   dan kualitasnya lebih baik. Usaha penyilangan ditujukan untuk menghasilkan biji
   yang menjadi tanaman jantan (XY). Hibrida XY diperoleh dengan menyilangkan
   tanaman jantan XY dengan betina XX dengan hasil XY: 50%. Melalui kultur
   anther, diperoleh tanaman XY, yang disebut super male. Penyilangan super male
   YY dengan betina XX, akan menghasilkan progeni yang 100%.


                Teknik mendapatkan tanaman haploid secara in vitro



1. Kutur anther
   Keuntungan: teknik isolasinya lebih mudah, dapat menghasilkan tanaman dengan
               jumlah kromosom yang bervariasi (n, 2n dan 3n).
   Kerugian     :   Tanaman yang diperoleh bermacam-macam karena kemungkinan
                    tanaman tersebut berasal dari jaringan lain seperti jaringan tapetum
                    (3n), atau jaringan penyambung (conective tissue), sehingga masih
                    perlu tahapan seleksi.

2. Kultur Polen
   Keuntungan: *Kepastian haploid yang lebih tinggi.

                    *Perkembangan androgenesis dapat diikuti.

                    *Studi tranformasi dan mutagenesis, baik kimia maupun fisik,
                    mudah dilakukan karena polen terdiri dari sel tunggal.

   Kerugian     :   Keberhasilan masih rendah.

3. Kultur Ovule
   .




Kultur Anther


       Keberhasilan kultur anther telah diujudkan pada tanaman seperti Datura innoxia,
nicotiana tabacum, karet, poplar, anggur, tanaman Gramineae serta pada tanaman
angrek. Teknik kultur anther relatif sederhana dan efisien yang paling pentingadalah
kritis dalam penentuan tingkat perkembangan pollen (androgenesis) yang tepat pada
anther yang akan dijadikan eksplan.
       Secara praktis tingkat perkembangan pollen dapat ditentukan berdasarkan
pengambilan contoh beberapa tingkat perkembangan kuncup bunga. Tingkat
perkembangan androgenesis pollen uninucleat paling sesuai bila digunakan sebagai
eksplan.

       Media dasar yang digunakan untuk tanaman dikotil, umumnya adalah media MS,
media White dan media Nitsch &Nitsch, dengan berbagai modifikasi dengan
penambahan sukrosa sekitar 20-40 gram/liter. Zat Pengatur Tumbuh diberikan dalam
konsentrasi serendah mungkin untuk menghindari terbentuknya kalus dari jaringan-
jaringan diploid yang tidak diinginkan. Untuk mendapatkan double haploid
dipergunakan larutan colchicine: 0,5% dengan waktu perendaman 24-28 jam.

       Tanaman monokotil terutama tanaman Gramineae seperti padi, media MS juga
dapat digunakan. Tetapi selain MS, dikembangkan juga beberapa media lain misalnya
media N6. Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH4+ dan NO3_ yang jauh
perbedaannya. Ammonium yang diberikan dalam bentuk (NH4)2SO4 hanya sebanyak
363 mg/l, sedangkan KNO3 : 2830 mg/l. Khusus untuk padi, ada beberapa media lain
yang dikembangkan di Cina, sesuai dengan kultivar padinya, misalnya media SK3,
He5 dan LB.

       Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan produksi haploid melaui kultur
in vitro adalah:

1. Tingkat Perkembangan Pollen
   Pada tanaman padi, frekuensi pembentukan kalus yang tertinggi diperoleh pada
   kultur anther dengan pollen yang nukleusnya terletak di pinggir sel (mid-
   uninucleate microspore stage). Pembentukan terbentuknya kalus pada berbagai
   stage adalah sebagai berikut:

       5.6% kultur membentuk kalus pada early-uninucleate stage, yaitu sesudah
        tetrad terbentuk.
       35,7% kultur membentuk kalus pada mid-uninucleate stage.
       10.5% pada saat late-uninucleate stage.
       6.7% pada saat mitosis pertama dari pollen.
       0% pada saat polen mencapai bi-nucleat stage.
2. Perlakuan fisik sebelum inokulasi
   Perlakuan temperatur rendah sebelum inokulasi, meningkatkan keberhasilan kultur
   anther dalam: Nicotiana tabacum, Datura innoxia, Hyosciamus niger, Hordeum
   vulgare dan Oryza sativa. Pada umumnya, temperatur antara 3-10oC. Bila
   dipergunakan temperatur rendah 3-5oC, maka waktu perlakuan dapat dipersingkat,
   sedangkan pada terperatur rendah 10-15 oC,          waktu perlakuan lebih panjang.
   Percobaan Wang dan grupnya (Chen, 1986) dalam kultur padi hsien menunjukkan:

       Bila temperatur 3-5 oC, dibutuhkan 10 hari.
       Bila temperatur 6-8 oC, dibutuhkan 15 hari.
       Bila temperatur 9-10 oC, dibutuhkan 20 hari.
3. Perlakuan kimia sebelum inokulasi
   Anther yang dikultur dalam media cair yang ditambah dengan 50-250 mg/l
   colchisine selama 4 hari, meningkatkan frekuensi pembentukkan kalus dan
   diferensiasi. Colchicine dapat meningkatkan tanaman double haploid hingga 79%,
   sedangkan anher tanpa perlakuan pendahuluan, hanya menghasilkan 53,8%
   tanaman. Jika konsentrasi colchicine ditingkatkan hingga 500 mg/l akan
   mengakibatkan frekuesi tanaman anakan yang abnormal seperti albino akan
   meningkat. Selain senyawa tersebut senyawa ethrel juga sering digunakan untuk
   praperlakuan pada media cair + 5 g/l ethrel (Gunawan, 1988).
4. Media tumbuh
       a. Komposisi media dasar tidak begitu kritis, namun dalam kultur anther, NH4+
          yang tinggi (35mM) akan menghambat pembentukan kalus.
       b. Sukrosa yang diberikan, berkisar 2-12%. Pada serealia digunakan 6-9%,
          sedangkan pada tanaman diploid 2-4%.
       c. Zat Pengatur Tumbuh pada kultur anther Solanaceae tidak diperlukan cukup
          media dasar N6. ZPT yang biasa digunakan untuk memacu pertumbuhan
          embriogenesis pada kultur anther adalah senyawa TIBA (Tri iodobenzoic
          acid). Disamping itu penambahan 2 mg/l 2,4D pada media dasar digunakan
          untuk kultur anther padi, dan kombinasi ZPT: 4 mg/l NAA + 1 mg/l 2,4D dan
          1-3 mg/l kinetin sering ditambahkan pada media dasar untuk kultur anther.
       d. Penambahan bahan-bahan organik seperti: ekstrak pisang, air kelapa,
          ensdosperm serealia, ekstrak ragi, alanin, folic acid dan Co-enzym A, dapat
          memacu pertumbuhan pada kultur anther.
       e. Penambahan 2% arangaktif dapat memperbaiki androgenesis.
5. Genotipe tanaman donor
   Tidak semua kultuvar dari setiap tanaman organ anthernya dapat menghasilkan
   tanaman haploid, seperti kultivar dari Lycopersicon esculentum dari 43 kultivar
   hanya 3 kultivar saja yang anthernya dapat ditumbuhkan. Triticum aestivum hanya
   10 kukltivar saja yang anthernya dapat ditumbuhkan menjadi tanaman haploid dari
   21 kultivar yang ada.

6. Kondisi Tanaman Donor
           a. Umur     fisiologi   tananam    donor   ternyata   dapat   mempengaruhi
              pertumbuhan tanaman enther. Bunga dari tanaman muda pada saat
              permulaan pembungaan, ternyata lebih baik dari pada bunga yang
              keluar kemudian.
           b. Kondisi nutrisi tanaman donor: tembakau yang diberikan perlakuan
              larutan Hoagland selama 2 minggu, mempunyai bunga dengan vigor
              yang lebih baik.
           c. Temperatur waktu menumbuhkan tanaman donor. Contohnya pada
              tanaman Datura, tanaman donor yang ditumbuhkan pada suhu 24oC
              frekuensi terjadinya androgenesis sebesar 45% dan bila tanaman donor
              ditumbuhkan pada temperatur 17 oC, frekuensi tumbuhnya turun
              menjadi 8%.
           d. Cahaya selama pertumbuhan tanaman donor. Triticum aestivum yang
              ditumbuhkan di lapangan dengan cahaya yang penuh, menghasilkan
              kultur anther yang lebih baik dari tanaman yang ditumbuhkan di rumah
              kaca pada musim dingin dengan penyinaran yang kurang.



                           Kultur serbuk sari (Pollen Culture)




     Pollen (mikrospora) merupakan sel tunggal dan haploid dari sel kelamin jantan.
Pollen ini baik bila digunakan untuk diinduksi mutasi dan manipulasi genetik lain.

     Kultur pollen pertama kali yang berhasi pada tanaman Datura innoxia dan
Nicotiana tabacum. Disausul kemudian pada tanaman Solanaceae. Pada tahun 1974,
Nitsch mengembangkan kutur terapung (Floating culture) menggunakan media cair.
Setelah itu pollen diletakkan di permukaan media cair selama 2-3 hari. Setelah itu
pollen ditekan keluar dan media disaring dengan filter berukuran 25-100 m
tergantung dari jenis. Suspensi kemudian dicentrifuge dan dicuci dengan larutan
media. Setelah dicuci disuspensikan kembali ke dalam media baru. Suspensi dipipet
dan dipindahkan ke media padat dalam petri-dish.

     Dalam metode ini kuncup bungan yang sudah diberi praperlakuan suhu rendah,
diisolasi anthernya . Anther kemudian diapungkan dimedia cair. Beberapa hari
kemudian, anther terbuka (dehiscent) dan melepaskan pollen ke dalam media.

     Pada kultur anther padi setelah 10 hari setelah inokulasi pada media cair, massa
sel mendesak keluar dari dinding pollen. Setelah beberapa hari kalus putih mulai
terlihat. Regenerasi kalus pada mulanya lebih rendah dari yang di media padat, tetapi
setelah medianya diperbaiki dengan penambahan asam amino dan 20% ekstrak
kentang, kemampuan regenerasi meningkat.

   1.   Media
   Media dasar yang digunakan untuk kultur pollen Solanaceae adalah media Nitsch
   dengan penambahan Sukrosa 20 gram, 5 gram Myo-inosital , Glutamin 500 gram
   dan serin 30 mg, pH 5,8.

   2. Bahan Tanam
     a. Pollen diambil dari kuncup bunga yang masih muda, diperiksa tingkat
         perkembangan androgenesi.
     b. Tingkat perkembangan pollen dari kuncup bunga diperiksa terlebih dahulu.
     c. Kuncup bunga disterilisasi seperti pada kultur anther.
     d. Bunga yang telah disterilisasi diberi praperlakuan suhu antara 5-10oC selama
         10- hari.
     e. Bunga dicuci dengan aquadest steril sebelum digunakan.
     f. Kelopak bunga dan mahkota bunga, dibuka dengan hati-hati diisdolasi.



III. Penanaman
     a. Anther dimasukkan ke dalam media cair dan dibiarkan terapung selama 4
         hari pada temperatur 27 oC.
     b. Setelah 4 hari, anther ditekan ke dinding botol kultur menggunakan batang
         gelas steril.
     c. Saring media dan polen dengan filter 20 m untuk tomat dan 40 m untuk
         tembakau.
     d. Centrifuge dengan 500-800 rpm selama 5 menit, pelet yang diperoleh, dicuci
         menggunakan media baru.
     e. Ulangi     pekerjaan tersebut sekali lagi, pelet disuspensikan ke dalam media
         baru dengan ukuran volume tertentu.
     f. Suspensi kultur pollen diambil setetes diperiksa kepekatan selnya dengan
         menggunakan haemacytometer.
              Jumlah pollen yang berada di dalam 64 bidang dari haehacytometer
               dihitung jumlah pollen rata-rata / 0,25x0,25 mm bidang.
              Konversikan ke jumlah pollen/ml. Tiap bidang 0,25x0,25 mm. Volume
               6.25x10-6 ml.
              Suspensi diencerkan hingga kerapatan pollen 103-104 /ml.
              Suspensi pollen diambil menggunakan pipet sebanyak 5-10 ml
               dipindahkan pada petri-dish diameter 9 cm yang telah berisi media
               isolasi pollen.
              Kultur pollen diletakkan pada rak inkubator yang diberi cahaya lemah
               500 lux dengan temperatur 25oC.



Teknik di atas dimodifikasi oleh Nitsch menjadi:
 a. Anther dikultur terus di dalam media cair sampai dehiscent.
 b. Polen yang ditaburkan di atas media akan tumbuh, tergantung pada media dan
     jenis pertumbuhannya, melalui kalus atau embrio.
 c. Pada kultur serealia, kalus terbentuk seteleh dipindah ke media diferensiasi.
 d. Media yang digunakan untuk menanam pollen padi adalah 1500 mg/l KNO3, 100
     mg/l Ca(NO3)2.4H2O, ekstrak kentang 20 % dan untuk media diferensiasi
     adalah media MS + 2 mg/l kinetin + 1 mg/l IAA + 3 % Sukrosa dan 0,57% agar.
Kultur bakal buah (Ovule culture)



      Pada tahun 1920 telah ditemukan terjadinya partenokarpi spontan di dalam sel
telur. Penemuan ini memacu para peneliti untuk mengembangkan kultur ovul pada
tahun 1950-1960, akan tetapi hasilnya belum memuaskan.
      Pada tahun 1970-an, beberapa hasil penelitian tentanbg kultur ovul muda yang
belum dibuahi, dipublikasikan, antara lain:

a. Kultur ovul Solanum melongena (Uchimiya et al, 1971 dalam Yang et al, 1986).
b. Zea mays (Uchimiya et al, 1971 dalam Yang et al,1986).
c. Gossypium hirsutum (Jenson et al, 1977).
Pada dekade berikutnya tahun 1980-an, terdapat beberapa penelitian lagi:
a. Gerbera jamesomii (Sitpon, 1980; 1981).
b. Nicotiana tabacum (Ran, 1980 dalam Yang et al, 1986).
c. Helianthus annus (Yang et al, 1986).
      Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur ovul. Sebagian faktor-
faktor    yang ditemukan, merupakan faktor-faktor          yang juga mempengaruhi
keberhasilan kultur polen; tetapi ada juga yang tidak serupa. Faktor-faktor tersebut
adalah:

 a.       Genotipe Tanaman Donor.
          Dari 19 varietas padi, terdiri dari 15 varietas japonica dan 4 varietas dari
          Indica. Dari kelompok japonica, frekuensi gynogenesis berkisar antara 1,1-
          2,8%. Frekuensi keberhasilan japonika dan Indica dalam gynogenesis ini
          menunjukkan kecenderungan yang sama dengan kemampuan androgenesis dari
          kelompok varietas tersebut.

 b.       Tingkat Perkembangan Kantong Embrio.
          Tingkat perkembangan embrio yang optimal adalah pada saat akhir uninukleat
          sampai awal tetranukleat. Keadaan ini sukar siamati, tetapi dapat disejajarkan
          dengan tingkat akhir uninukleat dan awal binukleat dalam pollen.

 c.       Perlakuan Temperatur Rendah
     Perlakuan suhu 12-13oC selama 6 hari sesudah ovari/ovul ditanam,
     meningkatkan frekuensi gynogenesis. Akan tetapi perlakuan temperatur rendah
     bukan merupakan faktor kritis.

d.   Bagian-bagian Bunga.
     Bagian-bagian bunga berperan dalam mengirimkan bahan-bahan nutrisi dan
     bahan aktif lain ke bagian ovul. Hal ini terbukti bahwa bagian-bagian bunga
     seperti pedicle, calyx atau glume memegang peranan penting. Inokulasi bunga
     utuh (dengan pistil, stamen, receptacle) menunjukkan hasil terbaik, bila stamen
     dibuang juga masih menunjukkan hasil yang baik, sedangkan bila hanya bagian
     pilstil saja yang ditanam maka tidak ada respon yang diperoleh.

e.   Bentuk Fisik Media
     Media cair lebih mendukung gynogenesis dalam kultur ovul dibandingkan
     dengan media padat. Hasil ini serupa dengan hasil yang diperoleh dalam kultur
     anther.

f.   Zat Pengatur Tumbuh
     Untuk kultur ovul padi media induksi :Media dasar + 0,125-0,5 mg/l MCPA
     (2-methyl-4-chlorophenoxy acetid acid + 0,125-0,5 mg/l Picloram (4-amino-
     3,5,6-tricloropicolinic acid + 3-6% sukrosa.

     Media diferensiasi:

     Media dasar + 2 mg/l kinetin + 0,5 mg/l IAA atau + 0,25 mg/l NAA + 3-6%.

     Media perakaran:

     Media dasar + 0,5 mg/l IAA + 1,5% sukrosa + 0,1% arang aktif.
1. Chawla, H.S. 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd Edt. Science
   Publishers, Inc. New Hampshire.
2. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
   England. 236 p.
3. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
   Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
4. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge
   University Press. London. 178 p.
5. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
   principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
   Industries. Brisbane. 31 p.
6. George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture.
   Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd., Basingstoke,
   England. 546 p.
7. Green, E.F. D.A. Somers, W.p. Hackett & D.P. Biesboer, 1987. Plant tissue and
   cell culture. Alan R. Liss, Inc. New York. 509 p.
8. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
   Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.
   Bogor. 304 h.
9. Peirek, R.L.M., 1989. In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff
   Publishers. Netherlands. 344 p.
10. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. In vitro plant Breeding. The
   Haworth Press, Inc. New York.
11. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
   procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
Perkembangan Gametofit Betina

        Dalam tumbuhan Angiosperm, gametofit betina di dalam kantong embrio
memproduksi inti-inti dalam jumlah terbatas. Jumlah inti dalam gametofit dewasa
berjumlah antara 4-16 buah inti, tetapi 80% dari tumbuhan berbunga mempunyai 8
inti. Beberapa tipe gametofit betina yang dikenal, antara lain:
   1. Jumlah spora yang berperan dalam pertumbuhan.
   2. Jumlah pembelahan mitosis setelah pembelahan meiosis dua kali.
   3. Jumlah total nuklei pada pembelahan sempurna.
   4. Organisasi seluler dari gametofit masak.



Kebanyakan tipe umum gametofit betina adalah delapan nukleat (tipe poligonum):

   1. Sel telur bagian terpenting dan menonjol mempunyai struktur yang relatif
       seragam. Ini ini berada dalam ujung mikrofil dan diapit oleh dua inti synergid.
   2. Sinergid tampak berperan aktif dalam pembuatan nutrisi bagi kantong embrio,
       menarik tabung pollen dan sebagai buffer osmotik untuk melepas isi tabung
       pollen.
   3. Sel kutub (sel pusat binukleat) atau sel pusat garam organik berperan sebagai
       sel induk endosperm setelah fertilisasi.
   4. Sel antipoda berjumlah tiga bertugas sebagai tempat melakukan metabolisme
       dan berperan dalam menyuplai nutrisi.


Penyerbukan (Polinasi)
       Penyerbukan didefinisikan sebabkan peristiwa pemindahan atau jatuhnya
pollen dari anther pada kepala putik (stigma) baik pada bunga yang sama atau bunga
lain yang masih dalam satu spesies. Jika pollen sesuai (compatible), pollen akan
berkecambah pada kepala putik dan membentuk sebuah tabung pollen yang akan
membawa gamet jantan pada gametofit betina. Suatu senyawa protein tertentu pada
awal pembentukan pollen yang disebut Lectin, terdapat di dalan exine dan intine.
Lectin berperan penting dalam mekanisme mengenali antara putik-pollen. Namun bila
pollen tidak sesui (incompatible), perkecambahan pollen akan terhambat atau
pertumbuhan tabung pollen akan tertahan dalam jaringan pemindah. Ketidaksesuaian
dapat diwujudkan dalam jaringan baik kepala putik maupun stylus pada berbagai fase
sebelum pembuahan (fertilisasi). Karena adanya ketidaksesuaian antara pollen dan
stigma maka pekerjaan pemuliaan tanaman adalah mengatasinya agar tetap bisa
berlangsung fertilisasi, dengan mengembangkan beberapa metode, antara lain:

                 Polinasi kuncup
                 Polinasi tertunda
                 Polinasi in vitro
               Polinasi intra ovari



        Pemanjangan tabung pollen adalah tetap untuk setiap spesies. Ketika butir
pollen siap dipencarkan, pollen ini dalam keadaan dormansi dengan kadar air antara
10-15% hampir mirip dengan biji. Pada Gramineae mempunyai umur pollen yang
relatif pendek, misalnya pollen Paspalpum akan kehilangan viabilitasnya setelah 30
menit. Kebanyakan pada tanaman berbunga pollen akan mengalami penurunan secara
drastis setelah 12 jam mengalami dehiscence. Namun viabilitas pollen dapat
diperpanjang dalam keadaan artifisial yaitu bila disimpan pada temperatur dan
kelembaban yang rendah. Pollen akan segera berkecambah setelah beberapa menit
dilepas oleh anther, bila ketersediaan dari air, garam anorganik tertentu, termasuk
boron dan sumber energi seperti sukrose cukup. Tabung pollen akan masuk ke dalam
stigma melalui diantara sel-sel jaringan pemindah di dalam stylus dan akhirnya
mencapai ovule. Waktu yang diperlukan pollen untuk mencapai ovule antara 12-24
jam. Waktu yang digunakan untuk proses tersebut setiap spesies tidak sama, seperti
pada Taraxacum diperlukan 15 menit sedangkan pada pohon Quercus memerlikan
waktu 14 bulan.




Pembuahan (Fertilization)
        Pada tumbuhan Angiospermae, dua gamet jantan dibawa oleh tabung pollen
untuk terjadinya proses fertilisasi. Satu gamet akan melebur dengan inti telur
membentuk embrio dan yang lain melebur dengan dua inti kutub membentuk
endosperm. Proses ini dikenal sebagai pembuahan ganda. Persilangan sexual sangat
suatu cara yang potensial untuk memproduksi tanaman yang superior dengan
mengkombinasikan sifat-sifat dalam individu yang berbeda atau spesies atau bahkan
genera yang berbeda. Persilangan antar spesies atau takson di atasnya dapat dilakukan
dengan salah satu teknik seperti artifisial polinasi dari induk betina dengan pollen dari
induk jantan terseleksi.

        Tujuan utama program pemuliaan tanaman sampai saat ini adalah untuk
meningkatkan hasil (produktivitas) tanaman melalui perbaikan karakter-
karakter tanaman dalam kondisi lingkungan pertanaman yang normal maupun
cekaman lingkungan. Untuk mencapai tujuan di atas, pemulia menempuh
langkah-langkah seleksi populasi, penggabungan karakter yang diinginkan
melalui persilangan, perluasan variasi genetik melalui mutasi (bila karakter yang
diinginkan tidak ada di alam), atau penyisipan gen untuk memproduksi tanaman
transgenik. Langkah-langkah         pemuliaan tersebut dapat ditempuh melalui
persilangan konvensional maupun modern.
     Pemuliaan tanaman secara konvensional telah menghasilkan banyak sekali
varietas-varietas unggul, namun juga menghadapi berbagai kendala seperti waktu
produksi yang panjang, adanya inkompatibilitas yang sering menyebabkan kegagalan
persilangan serta adanya mekanisme dari tanaman sendiri (umumnya pada
Angiospermae) untuk mencegah terjadinya self-pollination.



Kendala yang sering dihadapai dalam persialangan dalam pemindahan pollen
viable dari satu induk ke stigma lain penerima tidak selalu dapat membentuk
biji, antara lain disebabkan:
1. Sebelum pembuahan atau sebelum pembentukan zigot (Prefertilization atau
prezygotic)

               Incompatibility antara serbuk sari dengan putik sehingga menghambat
               terjadinya pembuahan, yaitu:
               Terhambatnya perkecambahan pollen atau tabung pollen gagal
               mencapai ovule yang disebabkan stylus terlalu panjang atau
               pertumbuhan tabung pollen yang terlalu pelan sehingga tabung pollen
               baru mencapai dasar stylus sebelum benbkak (abcises)
               Tabung pollen pecah di dalam stylus..
               Biochemical incompatibility, yaitu tangkai putik mengeluarkan
               senyawa kimia tertentu sehingga pollen yang telah berkecambah tadi
               tidak bisa menembus tangkai putik (stylus) sehingga perkembangan
               tabung pollen terhenti sampai stylus
               Pertumbuhan tabung serbuk sari hanya mencapai microphyl.
2. Setelah terjadi pembuahan (Postfertilization)

               Terjadi fusi pada inti-inti gametnya sehingga mencegah pembuahan.
               Pembuahan terjadi tetapi embrio hibrid gagal berkembang hingga
               masak disebabkan adanya ketidaksesuaian antara embrio-endosperm
               atau pertumbuhan endosperm sangat miskin.
               Setelah terjadi pembuahan, perkembangan embryo terhambat
               Tidak terbentuk endosperm yang memadai
               Biji yang terbentuk terganggu proses penuaannya
               Biji       yang   dihasilkan   viabilitasnya   rendah   (menghambat
               perkecambahan)

       Kendala-kendala di atas seringkali menyebabkan kegagalan produksi
hibrida. Kendala yang terjadi setelah pembuahan dapat diatasi dengan
perkecambahan embrio (embryo culture dan embryo rescue) sedangkan kendala
sebelum pembuahan dapat diatasi dengan salah satu teknik kultur jaringan yaitu “
In-vitro pollination atau pembuahan secara in-vitro”.



Prosedur Umum Pembuahan In-vitro


       Prosedur pembuahan in-vitro pada Pisum sativum dan Nicotiana tabaccum
adalah sebagai berikut:

1. Pengumpulan pollen
2. Pengujian viabilitas pollen
3. Pembuahan in-vito, ada dua teknik yaitu:
   Stigma fertilization
   Placenta fertilization


1. Pengumpulan/koleksi pollen (serbuk sari)
   Tahapan pertumbuhan pollen sangat menentukan keberhasilan pembuahan, oleh
karena itu harus dipilih benang sari yang telah berkembang penuh dan siap membuka
(sesaat sebelum pollen disebarkan oleh benang sari). Benang sari ini diterilkan lalu
didalam laminar air flow pollen tersebut dikumpulkan ke atas gelas mikroskop.




2. Test viabilitas pollen
    Viabilitas pollen dapat diukur dengan cara menguji sebagian kecil pollen yang
telah dikumpulkan. Caranya adalah mengkulturkan/mengecambahkan pollen tadi ke
dalam media yang mengandung sucrose (10%), boric acid (0,01 %), CaCl 2.2H2O dan
agar (0,75 %). Obseervasi dilakukan dibawah mikroskop terhadap perkecambahan
pollen.




3. Penyerbukan in vitro
Secara terminologi penyerbukan in vitro dibedakan menjadi 3 metode peyerbukan in-
vitro:




1. Penyerbukan Kepala Putik (StigmaPollination)




                                                     Yaitu teknik penyerbukan

                                                  dengan cara menaburkan serbuk sari

                                                  langsung ke atas tangkai putik

                                                  (stylus) dengan cara terlebih dahulu

                                                  memotong kepala putiknya (stigma).

    Putik yang tidak memiliki stigma ini terlebih dahulu dikulturkan dalam botol

    kultur dengan media yang sesuai sebagaimana diperlihatkan pada gambar 17.



Gambar 39: Stigma fertilisation: kepala putik dipotong, pollen dimasukkan melalui
    celah stylus



2. Penyerbukan Plasenta (Placental Pollination)
                                                          Yaitu teknik penyerbukan

                                                       dengan cara menaburkan serbuk

                                                       sari (pollen) langsung ke atas

                                                       placenta (tali pusat) yang

                                                       terdapat dalam badan buah

                                                       (ovule) dengan cara terlebih

dahulu memotong badan buah pada pistil sampai ovule sehingga placentanya terlihat,

bagian ini dikulturkan dalam botol kultur baru kemudian dilakukan penyerbukan

dengan meletakkan pollen langsung di atas placenta sebagaiman diperlihatkan pada

gambar 18.




Gambar 40: Fertilisasi plasenta; Bakal buah dipotong melintang selanjutnya pollen
ditaburkan pada ovule

3. Penyerbukan bakal biji (Ovular Pollination)

       Yaitu penyerbukan secara artifisial dengan cara menaburkan pollen pada
langsung pada bakal biji (ovule) dengan cara mengeluarkan mengeluarkan ovule dari
ovarium (bakal buah) terlebih dahulu.



Keberhasilan dari teknik polinasi in vitro sangat tergantung pada:

             1. Eksplan butir pollen dan ovule pada fase perkembangan yang tepat
             2. Pemilihan media yang tepat yang dapat memacu perkecambahan tabung
                pollen dan perkembangan embrio.


Beberapa aspek biologi pembungaan harus dikuasai, seperti:

       Anthesis
       Dehiscence anther
       Polinasi
        Perkecambahan pollen
        Pertumbuhan tabung pollen
        Penetrasi ovule
        Fertilisasi
        Perkembangan embrio dan endosperm.


Aplikasi fertilisasi in vitro

Teknik ini mempunyai manfaat untuk pemuliaan tanaman, antara lain seperti:

   1. Produksi hibrid dari hasil silangan antar spesies, antar genera, antar familia,
      ordo, classis ataupun divisio.
   2. Indusi tanaman haploid yang dapat dihasilkan dengan cara: polinasi tertunda,
      hibridisasi berjarak (hibrid antar spesies yang berbeda), polinasi dengan pollen
      abortif atau pollen yang telah diradiasi dan induksi haploid pada ovary dengan
      perlakuan fisik atau kimiawi.
   3. Mengatasi ketidaksesuaian sexual self.
   4. Untuk mempelajari fisiologi pollen dan Fertilisasi.




Hal-hal yang mendukung keberhasilan fertilisasi in vitro untuk menghasilkan biji
yang viable, antara lain adalah:

   1.   Umur eksplan terutama ovule.
   2.   Perkecambahan pollen cukup
   3.   Tabung pollen dan gametogenesis pada pertumbuhan yang tepat.
   4.   Tabung pollen dapat masuk ke dalam ovule
   5.   Derajat fertilisasi
   6.   Penambahan casein hydrolysate 500 mg/l pada beberapa kasus dapat memacu
        pembentikan biji yang viable.




   1. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
        England. 236 p.
   2. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
       Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
   3. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture.
       Cambridge University Press. London. 178 p.
   4. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture
       general principles and commercial applications. Queensland Department of
       Primary Industries. Brisbane. 31 p.
   5. George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture.
       Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd.,
       Basingstoke, England. 546 p.
   6. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
       Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.
       Bogor. 304 h.
   7. Peirek, R.L.M., 1989. In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff
       Publishers. Netherlands. 344 p.
   8. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshamanan, 2002. In vitro plant breeding. The
       Haworth Press, Inc. New York
   9. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I.
       Laboratory procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.




     Pada program pemuliaan tanaman, biasanya dilakukan persilangan buatan antara
tanaman induk (P) untuk menghasilkan hibrid baru. Persilangan buatan lebih mudah
berhasil bila dilakukan antar tanaman dengan hubungan kekerabatan yang dekat.
Untuk memperoleh sifat-sifat yang diinginkan, seringkali penyilangan dilakukan
dengan tanaman liar atau bahkan persilangan dengan varietas yang berbeda bila sifat-
sifat tersebut tidak terdapat pada kerabat dekatnya.
         Penyerbukan dan pembuahan dapat berhasil namun setelah persilangan buatan
seringkali dijumpai permasalahan antara lain buah yang terbentuk gugur saat embrio
belum matang, terbentuk buah dengan endosperm yang kecil atau terbentuk buah
dengan embrio yang kecil dan lemah. Kondisi tersebut dapat menghambat program
pemuliaan tanaman karena embrio muda, embrio dengan endosperm kecil atau embrio
kecil dan lemah seringkali tidak dapat berkecambah secara normal dalam kondisi
biasa.

         Untuk mengatasi hal tersebut di atas maka embrio tersebut dapat diselamatkan
dan ditanam secara aseptis dalam media buatan sehingga dapat berkecambah dan
menghasilkan tanaman utuh. Teknik untuk menanam embrio muda ini dikenal dengan
sebutan penyelamatan embrio (embryo rescue).

         Selain teknik penyelamatan embrio ini dikenal juga teknik kultur embrio
(embryo culture), yaitu penanaman embrio dewasa pada media buatan secara aseptis.
Aplikasi kultur embrio ini antara lain perbanyakan tanaman, pematahan dormansi
untuk mempercepat program pemuliaan serta perbanyakan tanaman yang sulit
berkecambah secara alami, misalnya anggrek.

         Embryo Culture atau kultur embrio adalah isolasi steril dari embrio muda
(immature embryo) atau embrio dewasa/tua (mature embryo) secara in-vitro dengan
tujuan untuk memperoleh tanaman yang lengkap. Embrio culture adalah salah satu
teknik kultur jaringan yang pertama kali berhasil, sejarahnya:

        Tahun 1904, seorang ilmuan bernama Hanning berhasil memperoleh tanaman
         sempurna dari embryo Cruciferae yang diisolaso secara in-vitro
        Tahun 1924 adalah saat pertama kali dilakukan penelitian untuk
         memcahkan masalah dormansi biji secara in-vitro pada embrio Linum
        Tahun 1933: Tuckey berhasil memperoleh tanaman dari immature embryo buah
         batu.



                            Penggolongan Kultur Embrio
       Berdasarkan tujuan dan jenis embrio yang dikulurkan, kultur embrio
digolongkan menjadi:

1. Kultur Embrio Muda (Immature Embryo Culture).

       Tujuan mengkulturkan embrio muda ini adalah menanam embrio yang terdapat
pada buah muda sebelum buah tersebut gugur (mencegah kerusakan embrio akibat
buah gugur) sehingga teknik ini disebut sebagai Embryo Rescue (Penyelamatan
Embrio). Kondisi seperti ini biasanya sering dijumpai pada buah hasil persilangan,
dimana absisi buah kerap kali dijumpai setelah penyerbukan dan pembuahan.
Contohnya adalah pada persilangan anggrek Vanda spathulata dimana absisi atau
gugur buah pada saat buah masih muda yaitu setelah berumur 3 bulan setelah
persilangan padahal buah anggrek Vanda spp. Akan mengalami masak penuh setelah
berumur 6 bulan. Apabila buah ini tidak diselamatkan atau dipetik dan kemudian
dikecambahkan maka tidak akan diperoleh buah hasil persilangan. Perkecambahan biji
yang masih muda di lapangan sangat sulit bahkan pada beberapa kasus hampir tidak
mungkin bisa terjadi. Oleh karena itu, buah yang belum tua (2 – 4 bulan) pada anggrek
Vanda tersebut kemudian dipanen dan dikecambahkan secara in-vitro.

       Budidaya embrio muda ini lebih sulit dibandingkan dengan budidaya embrio

yang telah dewasa. Embrio yang terdapat dalam biji belum sepenuhnya berkembang

dan belum membentuk radicula dan plumula yang sempurna. Selain itu, biji velum

memiliki endosperm atau cadangan makanan yang memadai dalam mendukung

perkembangan dan perkecambahan embrio. Oleh karena itu, perlu disediakan media

kultur yang memadai bagi perkembangan embrio muda ini. Pada beberapa kasus

kadangkala dijumpai embrio masih dorman sehingga perlu ditambahkan hormon

tanaman yang bisa memecahkan dormansi biji ini, misalnya Giberellin.

2. Kultur Embryo Dewasa (Mature Embryo Culture)

      Kultur embrio dewasa dilakukan dengan membudidayakan embrio yang telah
dewasa. Embrio ini diambil dari buah yang telah masak penuh dengan tujuan
merangsang perkecambahan dan menumbuhkan embrio tersebut secara in-vitro.
Teknik kultur ini umumnya dikenal dengan sebutan Kultur Embrio (Embryo
Culture). Kultur embrio lebih mudah dilakukan dibandingkan dengan penyelamatan
embrio. Hal ini disebabkan karena embrio yang ditanam adalah embrio yang telah
berkembang sempurna sehingga media tanaman yang digunakan juga sangat
sederhana.

2. Kultur Embrio Nonzigotik
       Embrio nonzigotik dihasilkan dari kultur organ yang melalui fase pertumbuhan
kalus. Dimulai dari pertumbuhan sel, sel-sel kemudian membentuk kalus dari kalus
akan membentuk globular dan globular ini akan membentuk bangunan seperti torpedo
dan akhirnya terbentuklah embrio nonzigotik. Embrio nonzigotik tumbuh dari sel
tunggal, namun pembentukan tunasnya berasal dari massa sel.     Perbedaan penting
mengenai efisiensi    teknologi genetik selama modifikasi sel embriogenik tunggal
dapat secara nyata memodifikasi sifat tanaman dibandingkan yang harus melalui
modifikasi genetik terlebih dahulu dari sebuah sel di dalam tunas, hal ini akan
mengakibatkan terbentuknya tanaman chimera (Trigiano & Gray, 2004).




Gambar 45. Embrio nonzigotik dihasilkan dari kultur pollen atau protoplasma yang
             nyata berkembang dari sel tunggal (sumber: Taji, Kumar & Lakshmanan,
             2002).

                                 Aplikasi Praktis
     Kedua teknik ini (embryo culture dan embryo rescue) dewasa ini dilakukan untuk
berbagai tujuan, antara lain:

1. Mematahkan dormansi.
       Beberapa spesies tanaman memiliki masa dormansi yang panjang, misalnya
   cherry, hazel nut, dll. Selain itu ada juga beberapa jenis tanaman yang bisa
   menghasilkan biji namun tidak dapat dikecambahkan secara normal di alam
   misalnya Musa balbislana. Untuk memecahkan masalah tersebut, maka biji
   tanaman ini dapat

   dikecambahkan secara in-vitro. Dormansi fisik dapat dipatahkan dengan cara
   mengisolasi embrio dari biji lalu mengecambahkannya, sedangkan dormansi
   fisiologis dapat dipecahkan dengan perlakuan kimia seperti penambahan giberellin
   (GA3) ke dalam media kultur.




   Gambar 47. Kultur embrio pada Musa balbislana. Buah pisang (Musa balbislana)
   dengan biji (kiri), embrio Musa balbislana berkalus pada media dengan 2,4-D
   (tengah)

     dan plantlet pisang dari embrio setelah berkecambah selama 2 bulan (kanan)



2. Perkecambahan dari tanaman yang memerlukan bantuan parasit.

       Tanaman anggrek merupakan salah satu contoh tanaman yang bijinya sangat
   sulit berkecambah di alam. Biji anggrek sangat kecil dan memiliki endosperm yang
   sangat miskin sehingga tidak bisa mendukung perkecambahan bijinya. Di alam,
   proses perkecambahan anggrek teresterrial (tanah) diawali dengan simbiosis antara
   biji anggrek dengan jamur (mycorrizha) dimana hifa jamur akan menembus kulit
   biji dan mensuplai makanan bagi biji anggrek. Tanpa simbiosa ini, biji anggrek
   tidak memperoleh cukup bahan makanan untuk perkecambahannya disebabkan
   karena endospermennya yang sangat kecil. Meskipun angrrek epiphyt tidak
   memerlukan simbiosa ini, namun biji anggrek epiphyt juga memiliki endosperm
   yang amat sangat kecil sehingga sulit berkecambah secara alamiah. Dengan teknik
   kultur jaringan (embryo culture), biji anggrek dikecambahkan secara in-vitro
   sehingga dewasa ini bisa diperoleh bibit anggrek dengan mudah. Produksi bibit
   anggrek dewasa ini merupakan industri yang berkembang sangat pesat dan
   menguntungkan. Teknik ini biasanya didahului dengan persilangan untuk
   memperoleh silangan-silangan. Dalam setahun, ribuan silangan baru anggrek bisa
   diperoleh. Masing-masing nursery biasanya memiliki pohon induk dengan
   keunggulan yang berbeda sehingga dihasilkan beragam varietas baru dengan
   bentuk dan warna bunga yang beragam.




3. Memperpendek siklus pemuliaan tanaman

       Dormansi biji dapat mengambat program pemuliaan tanaman. Pemecahan

   dormansi dengan kultur embrio (embryo culture) merupakan salah satu upaya

   untuk mempercepat perkecambahan biji hasil pemuliaan tanaman sehingga bisa

   mempercepat proses pemuliaan tanaman.

4. Produksi tanaman haploid lewat penyelamatan embrio hasil persilangan antar
   jenis tertentu.

      Salah satu cara yang dilakukan untuk memperoleh tanaman haploid adalah
   silangan antar spesies tertentu. Contohnya adalah persilangan antara Hordeum
   vulgare dengan H. bulbosum. Setelah penyilangan yang kemudian diikuti oleh
   pembuahan, kromosom H. bulbosum tereliminasi sehingga hanya kromosom H.
   bulbosum yang terekspresi, sehingga dapat dihasilkan biji haploid dari silangan ini.
   Sayangnya persilangan ini mengakibatkan embrio gugur (buah gugur) sebelum
   buah tersebut dewasa. Hasil silangan ini (buah haploid) tidak akan dapat diperoleh
   apabila buah muda tersebut tidak diselamatkan dengan cara memanennya sebelum
   gugur lalu mengecambahkan embrio muda (teknik embryo rescue) ini secara in-
   vitro.

5. Mencegah gugurnya buah (embrio) pada buah

         Gugurnya buah sebelum buah tersebut dewasa sangat umum ditemukan pada
   persilangan. Berbegai macam faktor dapat menyebabkan buah tersebut gugur
   sebelum masak. Pada persilangan buah-buah batu, transportasi air dan hasil
   fotosintesa dari daun dan batang ke buah terhambat sehingga mengakibatkan
   terbentuknya lapisan absisi pada tangkai buah. Akibatnya buah tidak memperoleh
   nutrisi yang dibutuhkan untuk perkembangannya sehingga buah dengan embrio
   yang terbentuk gugur sebelum dewasa. Teknik embrio rescue umumnya dilakukan
   untuk menyelamatkan hasil silangan ini dengan cara memanen buah muda hasil
   persilangan sebelum buah gugur kemudian mengecambahkannya secara in-vitro.

6. Mencegah kehilangan biji setelah persilangan (interspesific)

         Persilangan antar varietas tanaman dalam satu spesies seringkali menghasilkan

   buah dengan endosperm yang miskin atau embrio lemah dan berukuran kecil. Biji-

   biji dengan kondisi demikian seringkali sulit sekali atau tidak bisa dikecambahkan

   dalam kondisi normal. Teknik kultur embrio dapat digunakan untuk membantu

   perkecambahannya. Hal ini telah dilakukan pada tomat, padi, barley, kapas,

   phaseolus.

7. Perbanyakan vegetatif

   Embrio dapat digunakan sebagai bahan dasar perbanyakan vegetatif seperti
   misalnya pada Poaceae dan paku-pakuan (menggunakan spora)




                                     Teknik Dasar


         Teknik embryo culture dan embryo rescue pada dasarnya melibatkan 3 tahapan,
yaitu:
1. Sterilisasi Eksplan.
Embrio pada prinsipnya berada dalam keadaan steril. Hal ini disebabkan karena

embrio berada di dalam buah (di dalam biji) terlindung oleh jaringan-jaringan buah

dan biji yang berada di luar embrio, antara lain oleh kulit buah, daging buah dan

kulit biji. Keadaan ini menyebabkan sterilisasi embrio tidak perlu dilakukan.

Sterilisasi permukaan perlu dilakukan pada buah ataupun biji untuk mensterilkan

permukaan buah/biji sehingga pada waktu isolasi embrio tidak terdapat sumber

kontaminan. Karena embrio berada di dalam, sterilisasi dapat dilakukan dengan

pembakaran buah/biji atau dengan sterilan kimia seperti sodium hypochlorite

dengan konsentrasi cukup tinggi (>2 %).




2. Isolasi dan Penanaman Embrio
Seringkali masalah timbul saat isolasi embrio terutama untuk embrio berukuran

kecil sehingga isolasinya harus dilakukan di bawah mikroskop. Untuk embrio

berukuran besar, isolasi embrio tidak menjadi masalah. Isoalasi harus dilakukan

secara hati-hati agar embrio tidak rusak dan kehilangan salah satu atau lebih

bagian-bagiannya (radicula, plumula, hypocotil, coleoptyl, dll). Selain itu harus

tetap dijaga juga agar isolasi dilakukan dalam kondisi tetap aseptis. Embrio yang

telah diisolasi selanjutnya ditanam pada media yang telah dipersiapkan.
                                                          biji muda           Kultur   Pembesar
                                                                              embrio   planlet




 Gambar 48. Skema isolasi dan kultur embrio (sumber: Taji, Kumar & Lakshmanan,

                                      2002)

   Media untuk pengecambahan embrio cukup sederhana. Kebutuhan nutrsisi di
dalam media untuk pengecambahan embrio juga lebih sederhana dibandingkan dengan
media untuk tujuan teknik kultur yang lain. Pada prinsipnya media diperlukan untuk
menggantikan peranan endosperm dalam mendukung perkecambahan embrio dan
perkembangan bibit muda mengingat embrio yang ditanam umumnya telah memiliki
radicula dan plumula. Media yang umum digunakan untuk pengecamahan embrio
adalah media Knudson dan Vacin & Went (untuk anggrek), Media MS dalam ½
konsentrasi garam-garamnya. Dalam pengecambahan embrio dewasa umumnya
vitamin tidak ditambahkan dalam media, namun sumber karbon tetap diperlukan
meskipun dalam konsentrasi yang lebih rendah (umumnya 20 g/l). Akan tetapi, dalam
pengecambahan emrio muda diperlukan media yang lebih kompleks. Perkembangan
embrio muda perlu didukung pada awalnya sehingga radicula dan plumula dapat
berkembang sempurna sebelum embrio ini berkecambah. Untuk itu, nutrisi yang lebih
lengkap berserta vitamin seperti nicotinic acid, biotin, vitamin C, vitamin B perlu
ditambahkan pada media kultur embrio muda ini.Hormon tanaman umumnya tidak
ditambahkan dalam media kultur embrio karena penambahan hormon tanaman
kemungkinan dapat merangsang terbentuknya kalus pada embrio (Lihat gambar 1).
Kalus umumnya tidak diinginan pada kultur embrio mengingat tujuan kulturnya adalah
untuk merangsang perkecambahan embrio. Pada beberapa kasus, terutama untuk
embrio muda atau embrio yang mengalami dormansi, penambahan Giberellin dalam
media kultur dapat dilakukan. Untuk pengecambahan embrio umumnya digunakan
media padat sehingga agar pada konsentrasi 0,8 sampai 1,6 % ditambahkan ke dalam
media. Media cair kadangkala diperlukan untuk pengecambahan, misalnya pada
embrio     kelapa. Kondisi    pengecambahan ini      memodifikasi    kondisi   alamiah
perkecambahan buah kelapa dimana nutrisi tersedia dari endosperm yang cair yaitu
berupa air kelapa. Apabila media cair digunakan untuk pengecambahan, umumnya
kultur ditempatkan di atas shaker (alat penggojok) untuk menghindari kekurangan
oksigen pada eksplan yang dpat menyebabkan eksplan mati.




   3. Aklimatisasi
   Aklimatisasi dilakukan setelah embrio berkecambah dan diperoleh plantlet yang
siap untuk dipindahkan ke lapangan. Teknik aklimatisasi untuk plantlet hasil
regenerasi kultur embrio pada prinsipnya sama dengan aklimatisasi plantlet hasil
regenerasi dari teknik kultur jaringan lainnya. Hal ini telah dibahas pada bab
sebelumnya (Mikropropagasi).




                      Contoh Aplikasi Komersial Kultur Embrio

Pengecambahan biji anggrek

         Salah satu karakteristik khas dari biji anggrek adalah ukuran biji yang sangat
kecil, terdiri atas sel-sel yang belum terdiferensiasi,dan memiliki endosperm yang
sangat kecil sehingga tidak mampu untuk menyediakan nutrisi bagi perkecambahan
bijinya. Di alam, biji anggrek bersimbiose dengan jamur untuk memperoleh nutrisi.
Hypa jamur menembus dinding sel pada kulit biji dan menyediakan nutrisi bagi embrio
anggrek untuk berkecambah. Salah satu jenis jamur penting yang bersimbiose dengan
anggrek adalah jamur dari genus Rhizoctonia. Simbiose ini dijumpai pada anggrek
teresterial bukan pada anggrek epiphyt.

         Untuk mengatasi kesulitan tersebut, biji anggrek dikecambahkan secara in-
vitro. Biji-biji anggrek epiphyt umumnya dapat berkecambah dengan pada media
perkecambahan. Namun biji-biji anggrek teresterial tidak dapat berkecambah pada
media sederhana tersebut. Biji-biji tersebut baru dapat berkecambah pada media yang
ditambahkan jamur untuk simbiosanya.

       Media yang digunakan untuk pengecambahan biji anggrek ini cukup sederhana,
media tersebut telah diformulasikan dan dijual secara komersial. Media yang paling
banyak digunakan adalah media Knudson "C" (1946), Vacin and Went (1949) dan
Burgeff's-N3F (Thomale, 1957) (Tabel 2). Ke dalam media perkecambahan ini harus
selalu ditambahkan karbohidrat ( 2 %) sebagai sumber energi bagi perkecambahan
biji ini. Media dapat diperkaya dengan biotin, nicotinic acid, vitamin C. vitamin B,
panthothenic acid atau pyridoxine. Selain itu, beberapa peneliti menambahkan
campuran senyawa-senyawa organik kompleks seperti jus pisang, santan kelapa dan
casein hydrolysate sebagai sumber vitamin dan juga zat pengatur tumbuh. Umumnya
zat pengatur tumbuh tidak ditambahkan ke dalam media, karena penambahan zat
pengatur tumbuh ini seringkali menghasilkan pertumbuhan yang tidak diinginkan
misalnya terbentuknya kalus dan tunas-tunas adventif. Media ini umumnya dipadatkan
dengan agar pada konsentrasi 7 gr/L, dan pH pada kisaran 5.6 - 5,8. Media yang telah
dipersipkan dituang ke dalam botol-botol kultur dengn posisi miring untuk
memberikan ruangan yang lebih luas bagi pengecambahan biji.




         Tabel 12. Formula media standar bagi perkecambahan biji anggrek



                   Komponen         Media Perkecambahan Biji (g/L)

                                    Knudson     Vacin & Burgeff's
                                    'C'         Went    N3f

                   Kalsium nitrat      1,00        -          1,00

                   Kalsium              -         0,20         -
                   fosfat

                   Kalium fosfat       0,25       0,25        0,25

                   Kalium nitrat        -         0,53         -

                   Kalium               -          -          0,25
                   klorida
                   Magnesium          0,25       0,25       0,25
                   Sulfat

                   Amonium            0,50       0,50       0,25
                   Sulfat

                   Ferri Sulfat       0,03         -        0,02

                   Ferric tartrate     -         0,03         -

                   Mangan             0,01       0,01         -
                   Sulfat

                   Asam sitrat         -           -        0,09

                   Sucrose           20,00      20,00         -

                   Glukose             -           -        10,00

                   Fruktose            -           -        10,00

                   Agar              15,00      16,00       12,00




       Prosedur pengecambahan biji anggrek ini tidak berbeda dengan teknik kultur
jaringan secara umum. Eksplan yang digunakan adalah buah anggrek yang telah cukup
tua tapi kulit buahnya belum pecah. Buah anggrek disterilkan dengan sodium
hypochlorite 3 % atau dibakar sebentar. Buah anggrek ini sulit sekali basah, karena
struktur permukaan kulit buahnya. Untuk mengatasinya biasanya sterilisasi dilakukan
sambil menggoyang-goyangkan botol yang digunakan dan dalam larutan sterilan
biasanya ditambahkan beberapa tetes pelekat (misalnya tween-20). Buah steril ini
dibelah secara aseptis, di bagian dalam tampak biji-biji anggrek yang sangat kecil,
berwarna putih seperti serbuk. Biji ini dikecambahkan dalam media secara aseptis.
Pada anggrek teresterial, dalam media perkecambahan terlebih dahulu telah
dikulturkan jamur simbiotiknya. Isolasi dan pengkulturan jamur ini harus dilakukan
secara hati-hati dan dari kultur murni jamur simbiotik untuk menghindari kontaminasi
dengan jamur lain dan bakteri. Biji yang telah dikecambahkan disimpan dalam ruang
kultur. Kondisi terbaik untuk pengecambahan biji anggrek ini adalah penyinaran
selama 12 -1 6 jam per hari dengan intensitas cahaya rendah (20 - 100 m m-2 s-1) dan
suhu 20 - 25C.

       Biji anggrek mulai membesar setelah dua minggu dikulturkan. Setelah 3
sampai 6 minggu, chlorophyl mulai terbentuk diikuti dengan perkecambahan biji.
Kecambah berkembang menjadi plantlet muda dengan akar, batang dan daun setelah 6
bulan dikulturkan. Bibit muda ini menyerap nutrisi dan karbohidrat dalam media
dengan sangat cepat. Selain itu, media menjadi asam karena akumulasi senyawa-
senyawa fenolik dalam ruang kultur. Untuk mengatasinya, ditambahkan media baru
dengan cara memasukkan media baru dengan jarum steril melalui botol kultur. Jika
semua biji telah berkecambah dan bibit ini mulai membesar, botol menjadi terlalu
penuh dan sesak sehingga ruang yang tersedia untuk pembesaran bibit terbatas. Untuk
mengatasinya dilakukan penjarangan dengan mensubkulturkan bibit ke media dan
botol-botol kultur lainnya. Plantlet membesar dan dapat dipindahkan ke lapangan
setelah berumur 12 bulan .




BAHAN BACAAN X
14. Bhojwani & Razdan, 1983. Plant Tissue Culture: Theory and Practise.
15. Debergh & Zimmerman, 1990. Micropropagation: Technology & Application.
16. Evan, Sharp, Amminoto & Yamada., 1983/1984. Handbook of Plant Cell Culture
    (Vols 1 – 4).
17. George, 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: Part 1 The Technology,
    Exegetics, London.
18. Green, Somers, Hacket & Biesboer, 1987. Plant Tissue and Organ Culture.
19. Kantharajah, A.S., 1995. Plant tissue culture and crop improvement laboratory
    manual. Indonesia Australia Eastern Universities Project. Universitas Mataram.
    Mataram.
20. Pierik, 1987. In vitro Culture of Higher Plants.
21. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. In vitro plant Breeding. The
   Haworth Press, Inc. New York.
22. Thorpe, 1981. Plant Tissue Culture: Methods & Applications in Agriculture.
23. Torres, 1989. Tissue Culture techniques for Horticultural Crops.
11. Trigiano, R.N. & D.J. Gray, 2000. Plant Tissue culture concepts and laboratory
exercises. 2nd Adt. CRC Press. New York
Kultur Protoplasma
    Istilah protoplasma pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun 1880,
yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah dikupas bagian
diding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel. Isolasi
protoplasma dapat dilakukan dengan dua cara:
       1. Metode mekanikal.
          Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali oleh
   Klercker pada tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan cara mengupas
   dinding sel menggunakan alat bedah mikro. Metode ini telah berhasil mengisolasi
   protoplasma dari daun Saintpaulia ionantha dan dikulturkan hingga tumbuh kalus.
   Kelebihan dari metode ini adalah bila sel yang digunakan mempunyai vakuola sel
   yang relatif besar sedangkan kelemahannya adalah: 1) Keberhasilannya rendah; 2)
   Pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan; 3) Viabilitas
   protoplasma rendah, karena seng terjadi kerusakan protoplasma selama proses
   pengupasan dinding sel.
      2. Metode enzimatik
          Isolasi protoplasma menggunakan bantuan enzim. Orang pertama yang
   melakukan metode ini adalah Cocking pada tahun 1960, ia mengisolasi
   protoplasma menggunakan enzim selulase. Enzim selulase diisolasi dari jamur
   Myrothecium verrucaria. Namun        orang pertama    yang menggunakan enzim
   komersial untuk mengisolasi protoplasma dan berhasil meregenerasikan adalah
   Takabe dan kawan-kawan pada tahun 1968.
      Organ sebagai sumber protoplas
          Protoplasma yang telah berhasil diisilasi berasal dari organ-organ seperti:
   daun, tangkai daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora. Diantara
   organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi protoplasmanya
   adalah berasal dari jaringan mesofil daun, karena:
      1. Bentuk selnya relatif seragam.
      2. Tdak perlu membunuh tanamannya.
      3. Dinding sel mudah terkelupas oleh enzim.
          Sumber protoplasma selain diperoleh dari organ tersebut di atas tetapi juga
   berasal dari kalus dan sel suspensi. Untuk sumber yang berasal kalus, paling baik
   berasal dari kalus yang remah (friable) dengan kandungan karbohidrat rendah
   sedangkan yang berasal sel suspensi, paling baik diambil pada fase pertumbuhan
   exponensial.


    Salah satu teknik kultur jaringan yang dewasa ini berkembang pesat adalah teknik
kultur protoplasma. Bagian-bagaian sel tumbuhan, termasuk protoplasma, secara
umum dijelaskan pada Gambar 49. Protoplasma ini dapat diisolasi dari sel dan
kemudian dikulturkan secara in-vitro. .
     Kultur protoplasma dapat digunakan untuk berbagai macam tujuan seperti
                                                    perbanyakan           dan      untuk
                                                    memperoleh varietas baru. Teknik
                                                    yang         digunakan         untuk
                                                    memperoleh hibrida ini antara
                                                    lain      perlakuan      protoplasma
                                                    dengan mutagen dan manipulasi
                                                    genetik ditingkat sel melalui fusi
                                                    (penggabungan) dua protoplasma
                                                    dari varietas atau spesies yang
                                                    berbeda       serta      penggunaan
                                                    protoplasma      dalam       rekayasa
                                                    genetika     ditingkat      molekuler
dengan teknik elektroporasi, mikro injeksi atau partikel bombardment.
     Jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan untuk kultur protoplasma ini
bermacam-macam termasuk jaringan yang masih memiliki sel-sel parenchyma
(dindingnya belum berlignin).
     Biasanya jaringan tanaman diiris halus lalu diplasmolisis (sedikit) dalam larutan
manitol untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) sitoplasma dg dinding selnya.
Setelah dimodifikasi, di dalam kultur protoplasma akan membentuk dinding sel
kemudian membelah membentuk koloni sel seperti kalus (callus-like cells).
Protoplasma memerlukan media tanam yang lebih kompleks untuk dapat bertahan
hidup dan beregenerasi. Biasanya ditambahkan suatu osmotikum (misalnya sorbitol,
manitol) ke dalam media awal sebelum dinding selnya terbentuk untuk mencegah
plasmolisis.
Gambar 49. Sel mesofil daun.


                           Prosedur Kultur Protoplasma


       Kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari persiapan
eksplan dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi protoplasma dapat
dilakukan dengan menambahkan senaywa mutagen ke dalam media tanam atau dengan
memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen tersebut. Silangan somatik
dilakukan dengan cara penggabungan dua buah protoplama segera setelah isolasi
kemudian ditumbuhkan. Prosedur kultur protoplasma secaraa umum adalah sebagai
berikut:


1. Persipan eksplan.
       Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam,
   umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai
   umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet),
   pucuk adventif hasil pangkasan. Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah
   diisolasi protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri
   dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel parenchyma
   (dindingnya belum berlignin). Selain itu, ada juga yang menggunakan jaringan
   yang telah dewasa, namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih
   kompleks karena dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer
   dan dinding sel sekunder.


2. Sterilsasi eksplan.
       Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci
   kemudian disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 – 2 % selama
   10 – 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut
   selanjutnya dicuci dengan air steril (3 – 4 kali) untuk mencuci sisa sodium
   hipoklorit pada eksplan.


3. Isolasi Protoplasma.
     Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat
mengahancurkan dinding sel. Enzym           yang digunakan bervariasi jenis dan
konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang erat
kaitannya dengan komposisi dinding selnya. Berikut dikemukanan perbandingan
antara dinding sel primer dan sekunder pada sel tumbuhan.


     Tabel 13. Perbandingan komposisi dinding sel primer dan sekunder
    Komponen                     Dinding sel primer   Dinding sel sekunder
    Polisakarida                          90 %               60 - 85 %
    cellulose                    30 %                 50 - 80 %
    hemicellulose                         30 %               5 - 30 %
    pectin                                30 %               -
    Protein                               10 %               -
    Lignin                                       -           15 - 35 %
    ______________________________________________________


    Enzym yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan
umumnya ada 3 yaitu:
      a. Cellulase untuk menghancurkan sellulose
      b. Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose
      c. Pectinase untuk menghancurkan pektin.


      Alat-alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur ptotoplasma adalah
   sebagai berikut:
            Laminar air flow cabinet
            Centrifuge
            Inverted microscope
            Gyratory shaker
            Magnetic stirrer + hot plate
            pH meter
            Saringan stainless stell (lubang 60 - 70 m)
            Bacterial filter
            Nalgene filter unit 0,22 m
            Millex filter unit 0,45 m
            Spet dan jarum
            Piset dg ujung runcing + pisau kultur
            Pipet 5 ml berujung lebar
            Pipet pastur 2 ml
          Petri dish
          Gelas beker
          Parafilm/plastic wrapp


       Bahan- bahan yang digunakan untuk isolasi protoplasma adalah sebagai
   berikut:
          Eksplan dapat berupa: jaringan mesophyll daun, callus atau sell suspensi,
           akar, tuber, bintil akar, petal, pollen, endosperm, aleurone, coleoptil,
           radicula
          Ethanol 70 %
          Larutan isolasi protoplasma


4. Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma (lihat Gambar 51, 52 dan 53)
       1. Jaringan tanaman seperti daun tembakau          disterilkan terlebih dahulu
           dengan cara merendamnya dalam alkohol 70% selama 30 detikm
           selanjutnya di rendam kedalam larutan pemutih (misalnya bayklin) 20%
           yang ditambah beberapa tetes Tween selama 15 menit. Selanjutnya daun
           tembakau tersebut dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak tiga kali.
       2. Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan
           urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih
           memudahkan isolasi protoplasmanya.
           Contoh campuran dan konsentrasi enzym yang digunakan untuk isolasi
       protoplasma beragam dan tergantung dari jenis jaringan yang digunakan
       sebagai eksplan, seperti:
           1. Medium enzim untuk jaringan Akar
           o     2 % rhozyme
           o     2 % meicellase
           o     0,03 % macerozyme R10
           2. Medium enzim untuk daun Serealia
           o     2 % cellulysin
           o     0,2 % macerozyme R10
           o     0,5 % hemicellullase
           o     11 % mannitol
   3. Medium enzim untuk Daun Tembakau:
   o     0,5 % Onozuka R10 cellulase
   o     0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10
   o     13,0 Mannitol
   o     pH 5,8


3. Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma dengan
   dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditamhkan senyawa osmoticum.
   Senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain:
       Mannitol
       Sorbitol
       Glukosa
       Fruktosa
       Galaktosa
       Sukrosa
4. Setelah dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml
   larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam. Medium preplasmolisis untuk
   setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau medium preplasmolisis
   tersusun atas medium isolasi protoplasma ditambah 13% mannitol.
   Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut:
   o CaCl2.H2O           1480,0 mg/l
   o KH2PO4                27,2 mgl
   o KNO3                101,0 mg/l
   o MgSO4.7H2O          246,0 mg/l
   o CuSO4.5H2O             0,025 mg/l
   o KI                     0,16 mg/l
   o pH 5,8
5. Eksplan dipindah larutam medium enzim (komposisi media ini juga
   berbeda-beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan) untuk daun
   tembakau komponennya dapat dilihat di atas. Eksplan dipindah ke tabung
   steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung ditutup
   dengan aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan parafilm atau
           plastik wrap. Tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan
           kecepatan 40 rpm selama semalam atau 4-16 jam.


5. Pemurnian protoplasma
       1. Protoplasma dalam poin 5 disaring dengang filter steril, mess 63 µm,
           masukkan ke dalam gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet pastuer.
       2. Medium pencuci (MIP ditambah + 10 %) sebanyak 3 ml ditambahkan ke
           dalam cawan petri yang berisi debris dari daun, digoyang perlahan dan
           kombinasikandengan protoplas/ campuran enzim dalam gelas piala vol.
           250 ml.
       3. Protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring.
           Protoplas yang masih tercampur dengan larutan enzim disentrifuge dengan
           kecepatan 50 x g selama 10 menit.
       4. Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (medium flotasi) 10 ml
           ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma akan
           melayang-layang diantara medium flotasi (MIP + 20%) dan medium
           pencuci.
       5. Protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung
           ditambah 10 ml medium pencuci, selanjutnya disentrifuge maka
           protoplasma akan mengendap sebagai pelet.
       6. Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar
           lagi.
       7. Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml.
       8. Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies
           tanaman berbeda-beda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya
           50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml untuk protoplasma petunia, protoplasma
           tersebut dikulturkan dalam cawan petri steril..


6. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma.
   Uuntuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan haemocitometer:
   jumlah sel / grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma dilakukan dengan
   menggunakan senyawa flourescent seperti fluresein diacetate (FDA). Medium
   kultur diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1 tetes larutan pewarna FDA dan 1
                tetes protoplasma suspensi tersebut agar protoplas tercat dengan baik, selanjutnya
                dilihat di bawah mikroskop. Protoplasma yang mati berwarna merah dan yang
                viable tercat hijau.


            7. Kultur protoplasma
                       Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi protoplas
                viable 100 – 200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah disediakan dan
                dikulturkan dan disimpan tempat gelap pada temperatur 28 oC selama semalam.
                Kultur proplasma dipindahkan pada cahaya rendah (10 – 20 µmol.detik-1m-2)
                dengan cahaya lampu putih yang dingin dan fotoperiode 16 jam, selama 2 hari.
                Kultur dipindahkan pada intensitas cahaya yang lebih tinggi (50 – 75 µmol.detik-
                1
                    m-2).
                       Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media media
                cair yang diletakkan dalam cawan petri         kecil atau media padat media padat
                (dengan pemadat agarose). Media yang digunakan untuk kultur protoplasma jauh
                lebih kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik kultur lainnya, karena
                protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam pada media awal
                yang diperkaya dengan osmotikum (misalnya sorbitol atau mannitol) untuk:
                menghindari plasmolisis. Salah satu contoh media kultur protoplasma tembakau
                (tabel 14).
                                 Tabel 14. Formula media kultur protoplasma tembakau
Formula                          mg/l        Formula                     mg/l          Formula
Ca(H2PO4).H2)               100,000          H2BO3                       3,00          Mannitol         100.0
CCl2.2H2O                    50,000          KI                          0,75          Inositol            1
KNO3                        500,000          MnSO4.4H2O                 13,20          Nicotinic acid
MgSO4.7H2O                   50,000          Na2MoO4.2H2O                0,25          Pyridoxine-HCl
NaH2PO4.2H2O                170,000          ZnSO4.7H2O                  2,00          Thiamine-HCl
(NH4)SO4                    134,000          Sequestrene 330            28,00          2,4-D
CoCl2.6H2O                    0,025          sucrose                10.000,00          NAA
CuSO4.5H2O                    0,025          Glukose                18.000,00          BA
                               Catatan: pH: 5,8
         Penanaman protoplama ke dalam media dilakukan dengan cara mencampur
   protoplama dengan larutan agarose. Campuran disedot dengan pipet pasteur steril
   kemudian diteteskan pada cawan petri steril (5 – 10 tetes per petri). Cawan petri
   ditutup dengan parafilm selanjutnya kultur diletakkan pada ruang kultur dengan
   suhu 25C dan diberikan 16 jam penyinaran. Setiap 2 minggu ditambahkan media
   baru ke bagian tetesan protoplasma tersebut.
8. Teknik Kultur Protoplasma
         Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan            dalam
medium agar semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam media
liquid untuk meregenerasi dinding sel terlebih dahulu, sebelum dikulturkan ke media
agar. Media semisolid agar, agar yang digunakan untuk kultur protoplasma adalah
khusus: yaitu gel agar lunak, salah satunya agarose
         Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karenas:
                    Mudah larut dan diserap.
                    Beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat membelah dalam
                    media agar.
                    Tekanan osmotik media direduksi secara efektif.
                    Kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari dikulturkan.
           Kelemahan dari teknik ini tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal
yang berasal dari sel induk satu. Teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua
metode
                1. Metode liquid tetes
          Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 µl, suspensi protoplasma dalam
          media diteteskan pada cawan petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7 tetes.
          Cawan petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap
          selanjutnya diinkubasikan. Setiap 5-7 hari tambahkan medium segar baru
          dengan cara meneteskan langsung pada tetesan suspensi protoplasma yang
          telah mengalami pertumbuhan. Metode ini biasanya baik untuk keperluan
          pengamatan dengan mikroskop. Kelemahan dari metode ini adalah tetesan-
          tetesan suspensi menyatu menjadi satu tetesan di pusat.
                2. Metode tetes menggantung
          Dengan menggunakan pipiet volume 40-100 µl, suspensi protoplasma
          diteteskan di dalam tutup cawan petri, selanjutnya cawan petri,
           ditutupdengan menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma,
           sehingga tetesan suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup cawan
           petri tersebut.


9. Pembentukan Dinding Sel
       Perkembangan protoplama diawali dengan regenerasi atau terbentuknya
   dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus. Pada beberapa
   spesies, protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi melalui organogenesis
   atau embryogenesis.


10. Regenerasi Protoplama
       Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman lebih sulit
   dibandingkan sengan teknik kultur jaringan jaringan lain. Salah satu teknik yang
   digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan sel-sel lain
   (sebagai perawat) sehingga tekniknya disebut dengan teknik “Nurse Culture”.
   Untuk kultur satu protoplasma, “nurse cells” diletakkan berdekatan dengan kultur
   protoplasmanya untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma.
   Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Muir dkk.
       Tanaman yg dihasilkan dari kultur protoplasma bisa seragam atau bervariasi,
   disebut “protoclonal variation”. Apabila dalam penanaman protoplasma
   ditambahkan mutagen ke dalam media, maka hasil regenerasi akan berupa generasi
   baru.
       Produksi tunas dapat dilakukan pada media cair, umumnya ke dalam media
   ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin (misalnya 0,5 M BAP). Setelah
   tunas terbentuk cukup besar, tunas selanjutnya dalat diakarkan. Salah satu contoh
   media pengakatran protoplasma adalah 1/2 MS + 3-aminopyridine (untuk
   tembakau) atau picloran (untuk tebu). Plantlet yang cukup besar selanjutnya
   diaklimatisai kemudian ditanam di lapangan.


                                    Silangan Somatik


    Secara alamiah persilangan terjadi hanya persilangan sexual antar kerabat dekat
dalam satu jenis (species). Persilangan sexual telah dipergunakan bertahun-tahun untuk
perbaikan tanaman budidaya. Sayangnya persilangan sexual hanya terbatas pada
kultivar-kultivar dalam satu spesies atau yang terbaik pada beberapa spesies liar yang
mempunyai hubungan kekerabatan terdekat dengan tanaman budidaya. Adanya
pembatas antar spesies tanaman maka persilangan seksual kurang berfungsi.
     Peleburan sel (fusi sel) somatik dapat mengarah ke pembentukan sel hibrid viable
yang dapat digunakan sebagai cara/ metode untuk menghilankan pembatas antar
spesies yang terjadi pada persilangan seksual. Protoplasma tanaman merupakan ladang
dari genetik sel somatik untuk perbaikan tanaman. Teknik produksi hibrid melalui fusi
protoplasma yang telah diisolasi dari sel somatik (tubuh) secara in vitro dan
berkembang menjadi heterokarion yang menjadi satu persilangan tanaman, dikenal
sebagai Hybridisasi somatik. Prosedur ini termasik mengabaikan unsur sel dalam
hibridisasi. Dalam persilangan somatik, inti dan sitoplasma dari kedua induk menyatu
dalam sel silangan. Kadang-kadang genom inti dari berasal hanyadari satu induk yang
melebur, tetapi kadang juga terjadi gen sitoplasmik (plastome) berasal dari kedua
induk yang ada dalam proses peleburan, hal ini dikenal dengan cybrid (cytoplasmic
hybrid).
     Jadi teknik peleburan protoplasma dapat digunakan untuk menghilangkan
pembatas dari incompatibilitas dan sebagai manipulasi genetik dari sel tanaman.
Persilangan somatik bermanfaat untuk persilangan antar spesies yang berbeda takson
dari tingkat marga sampai tingkat divisi, untuk menciptakan sel-sel dengan genetik
baru, inti yang sebagus pada sitoplasmik yang tidak mungkin didapatkan dengan
metode persilangan seksual..
Kegiatan persilangan somatik meliputi:
       Peleburan protoplasma (fusi protoplasma)
       Seleksi sel silangan
       Identifikasi tanaman silangan.


Fusi Protoplasma (lihat gambar 52 dan 53)
     Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik secara
spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan.
Metode peleburan spontan
     Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran
protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang dapat
mengakibatkan peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada protoplasma yang
diisolasi dari kalus. Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada
protoplasma yang mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk
perbaikan tanaman.


Metode pemacuan peleburan
     Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk
memacu terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen) yang berbeda
jenis tanamannya. Larutan fusagen contohnya:
     Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan 10% sukrose
dan kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 35o C selama 5 menit selanjutnya
disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit. Subernatan dibuang dan pelet
disimpan dalam water bath bersuhu 35o C selama 30 menit. Pada beberapa saat
protoplasma akan terjadi peleburan. Agregat ditiangkan secara hati-hati pada medium
kultur yang telah ditambah 0,1% NaNO3. Teknik ini akan dihasilkan dengan frekuensi
rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun (Power dkk. (1970 dalam Chawla
2002).
     Perlakuan ion calsium padas pH tinggi . Teknik ini telah digunakan pada
protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah diisolasi ditambahkan larutan
fusagen berupa 0,5 M mannitol yang berisi 0,05 M CaCl2.2H2O pada pH 10,5
selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 50 g selama 3 menit. Selanjutnya tabung
sentrifuge disimpan dalam water bath bersuhu 37o C selama 40-50 menit hingga
protoplasma melebur (Keller dan Melchers (1973 dalam Chawla 2002).
     Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode peleburan
protoplasma, metode ini yang yang berhasil dengan baik untuk melebur protoplasma.
Suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan PEG: 1 ml suspensi protoplasmadalam
medium kultur dicampur dengan 1 ml 28-56% PEG (1500-6000 MW). Tabung
digoyang selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit. Selanjutnya suspensi
protoplasma tersebut dipindahkan dari larutan PEG dengan cara mencucinya
menggunakan medium kultur sebanyak 2 kali. Hasil peleburan protoplasma ini berupa
pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi, sedangkan kebanyakan tipe
sel sitoplasmik dengan pembentukan hetekarion binukleat rendah (Kao dan Michayluk
(1974 dalam Chawla 2002).
      Perlakuan peleburan elektro (elektrofusion). Protoplasma diletakkan di dalam sel
kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda potensialnya, protoplasma
diletakkan diantara barisan elektrode-elektrode. Selanjutnya protoplasma diberi shok
gelombang pendek elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma.
Dalam metode ini ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan penggunaan AC dari
intensitas rendah untuk suspensi protoplasma. Kolektor dielektroforetik diatur 1,5 V
dan 1 MHz dan konduktivitas elektirk dari medium suspensi kurang dari 10-5 detik/cm
efek sebuah elektroforesis dijalankan akan membuat masing-masing sel berbenturan
sepanjang alur barisan elektrode (lihat gambar 5). Tahap kedua injeksi aliran listrik DC
dengan intensitas tinggi (750-1000V/cm) dengan waktu yang sangat singkat yaitu 20-
50 µdetik menyebabkan membran protoplasma robek dan akan menghasilkan
peleburan yang selanjutnya membran akan mengalami reorganisasi. Teknik fusielektro
sangat sederhana, cepat dan efisien. Sel-sel yang telah di fusikan secara eletronik tidak
menunjukkan respon yang sitotoxit. Namun metode ini jarang digunakan.
      Contoh-contoh hasil peleburan protoplasma dapat dilihat pada tabel di bawah ini.


      Tabel 15. Jumlah kromosom dalam beberapa persilangan interspesifik dan
             intergenerik yang diproduksi melalui peleburan protoplasma.
                               No     Jenis tanaman dengan           Jumlah kromosom
                                      jumlah kromosomnya              hasil persilangan
                               INTERSPESIFIK
                               1      Brassica oleracea (2n =          Variasi luas
                                      18)                   + B.
                                      campestris (2n = 18)
                               2      Nicotiana tabacum (2n =          50-58
                                      48)               + N.
                                      glutinosa (2n = 24)
                               3      Nicotiana tabacum (2n =          96
                                      48)               + N.
                                      nesophila (2n = 48)
                               4      Lycopersicon esculentum          72
                                      (2n = 24)        + L.
                                      peruviarum (2n = 24)
                    5     Solanum tuberosum (2n =           60
                          24, 48)          + S.
                          chacoense (2n = 14)
                    INTERGENERIK
                    No    Jenis tanaman dengan              Marga (Genus)
                          jumlah kromosomnya           baru
                    6     Raphanus sativus (2n = 18)        Raphanobrassic
                          + B. oleracea (2n = 18)      a
                    7     Solanum tuberosum (2n =           Solanopersicon
                          24)              + L.
                          esculentum (2n = 24)
                          Nicotiana tabacum (2n =           Nicotiopersicon
                          24)              + L.
                          esculentum (2n = 24)


Tabel 16. Pemindahan sifat genetik melalui peleburan protoplasma.
                    No          Persilangan somatik          Sifat (resistan)
                     1   Nicotiana        + N.             Tobacco mosaic
                         tabacum          nesophila        virus
                     2   Solanum          + S.             Potato leaf roll
                         tuberosum        brevidens        virus
                     3   Brassica         + B. napus       Black rot
                         oleracea                          (Xanthomonas
                                                           campestris
                     4   Citrullus        + Cucumis        Club rot
                         lanatus          melo             resistance
                     5   Hordeum          + Daucus         Toleran terhadap
                         vulgare          carota           pembekuan dan
                                                           garam
                    Meningkatkan kualitas Sifat
                     6   N. rustica       + N.             Kandungan
                                          tabacum          nikotin tinggi
                                   7   B. napus     + Eruca         Erucic acid
                                                    sativa          rendah
                               Sifat Agronomik (dipindah melalui pembentukan
                               cybrid)
                                   8   N. tabacum   + N.            Resisten terhadap
                                                    sylvestris      Streptomycin
                                   9   B. nigra     + B. napus      Resisten terhadap
                                                                    Hygromycim
                               10      S. nigrum    + S.            Resisten terhadap
                                                    tuberosum       Triazine




1.   Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
     England. 236 p.
2.   Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
     Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
3.   Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
     principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
     Industries. Brisbane. 31 p.
4.   Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
     Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.
     Bogor. 304 h.
5.   Han, H. (ed.), 1981. Plant tissue culture. Proceedings of syposium on plant tissue
     culture. Pitman Publishing Pty Ltd., Melbourne. 531 p.
6.   Sharp, R.R., D.A. Evans, P.V. Ammirato & Y. Yamada, 1985. Handbook of
     plant cell culture. Vol. 2. Crop species. Collier Macmillan Publisher. London.
7.   Street, H.E., 1974. Tissue culture and plant science. Academic Press. London.
     502 p.
8.   Trigiano, R.N. & D.J. Gray, 2000. Plant Tissue culture concepts and laboratory
     exercises. 2nd Adt. CRC Press. New York
9.   Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
     procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
10. Winkelmann, T., 1993. Use of a Protoplast Regeneration System for African
     Violet Improvement African Violet Vol. 46(6), Pp. 50-52 (1993). Diakses dari
     http://aggie-horticulture.tamu.edu/tisscult/proto/wink/wink.html, 5-2-2007.

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Stats:
views:6271
posted:5/31/2011
language:Indonesian
pages:168