Microarray - PowerPoint by pengtt

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									The microarray data
           Ana Deckmann
            Carla Judice
           Jorge Lepikson
          Jorge Mondego
          Leandra Scarpari
    Marcelo Falsarella Carazzolle
          Michelle Servais
             Tais Herig
- Statistics   background
- Introduction to microarray
- Pre-processing microarray data
- Statistics analysis
- D-maps
             Statistics background
Error model
   - measurement = truth + error
   - error = bias + variance

Bias describe a systematic     Variance is often normally
tendency of the measurement.   distributed, ex :
Ex: dyes Cy3 and Cy5 don´t     instrumentation imperfection
have the same efficient        and biological variation

     Normalization             Experimental replicate
                               (techniques and biological)
                               and statistics
          Introduction to microarray
-Three different microarray technologies :
   - Spotted cDNA microarrays (500 to 2500 bp)
   - Spotted oligonucleotide microarrays (30 to 70 bp)
   - Affymetrix chips (25 bp)
- Can be used to :
   - Differential gene expression studies, gene co-regulation
   studies, gene function identification studies. time-course
   studies, dose-response studies, clinical diagnosis, …
Two color architecture
              Codelink architecture (one color)
Probes: 30-meros, 90% até 550 bases
downstream extremidade 3’             Targets: 10ug cRNA biotinilado
                                          green                  laser


                                                  overlay images

                                  
higher frequency,      lower frequency,
more energy                less energy
    1   2   3   4
                    Ludwig scanner
                                 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A                            a
B                            c
C                            f
D                            h
E                            k

                       Ludwig flags : (0) Int <= Back
                                       (1) Irregular spots
G                                      (3) Spot ok
                                       (4) Saturated
                         Scarpari, Leandra – 2006 – Tese Doutorado
                      Codelink scanner

Codelink flags :
(L) near background
(C) contaminated
(S) saturated
(M) masked
(G) good
    1   2   3   4   LGE scanner
                    Defined intensity :
B                   -Int Cy3 = Area Cy3 * (median(Int Cy3)-
C                   -Int Cy5 = Area Cy5 * (median(Int Cy5)-

E                   LGE defined flags :
                    (0) – Spot ok
F                   (1) – Spot Saturado
                    (2) – Int/Back <= 1.05
                    (3) – Area <= 110 or 50 (9x9 or 11x11)
               Cy3= 3329280; Cy5= 2251624                      r=0.67 (fold=-1.49)

(Target median - Bkgd median) * Area = integrated intensity

                 -                *                      =
   pixels in         pixels out       pixels in > pixels out
Cy3= 222824; Cy5= 15488         r=0.069 fold=-14.5 flag=0

    Cy3= 481536; Cy5= 676000        r=fold=1.40 flag=0

        Cy3= 293664; Cy5= 485368         r=1.65 flag=0

   Cy3= 6400; Cy5= -3584 NA (sinal:ruído<=1) flag=2

   Cy3= 8767720; Cy5= 1349296      r=0.15 fold=-6.7 flag=1
      Pre-processing microarray data
-Bioconductor repository (http://www.bioconductor.org/)
-Log intensities

                     R=G                           Log2R=Log2G

Most genes have low gene expression
levels. What happens here?
              M vs A plot
       up-regulated genes
                                  expressed genes
                                  are now along the
                                  horizontal line:

                                   log2R - log2G = 0
       down-regulated genes                

Transformed data {(M,A)i}:
M = log2(R) - log2(G) (minus)
A = ½·[log2(R) + log2(G)] (add)
     Density plot

log2R = red channel signal
log2G = green channel signal
Print-tip box plot

             Normalization within slides
Expectation: Most genes are non-differentially expressed, i.e. most
of the data points should be around M=0.
Median normalization : which sets the median of log intensity ratios to

                                                      Median value = 0

Lowess normalization : global lowess normalization
Print-tip normalization : print-tip group lowess normalization

Scaled print-tip : scaled print-tip group lowess normalization

            Normalization across slides


                                          Mean between
                                          8 slides
-LOWESS (applied in one color microarray)

Transformed data {(M,A)i}:
M = log2(Int1) - log2(Int2) ; A= ½·[log2(Int1) + log2(Int2)]
                  Statistics analysis
- T statistics test
  The T statistics down-weight the importance of the average if the
  deviation is large and vice versa;

         T = mean(x) / SE(x)

   where SE(x)=std.dev(x)/N (standard error of the mean)

                                                   The blue gene has
                                                   the lower T-value
                                                   than red gene.
                  Top table and volcanoplot
p.value    F.change                 GENE                 Fold change =
1.01E-07       -1.5     interleukin-18 binding protein
3.94E-06     -1.3234     Matrix metalloproteinase 3      ratio; if ratio >=1
0.000734    -1.93895   leukocyte integrin alpha chain
7.25E-05   1.960643       azurocidin 1 preproprotein     or
1.38E-09   2.317313    Macrophage-stimulating protein
6.82E-05     2.34858       alpha1-antichymotrypsin       -1/ratio; if ratio < 1
Cluster data analysis
Objetivo do Programa
        ●   Automatizar a análise dos dados

        ●   Diferentes formatos
                GeneTAC (LGE)
                ScanArray (Ludwig)
                CodeLink
                NimbleGen (Futuro)
Características do Programa

         ●   Possibilita a criação de diferentes projetos

         ●   Estruturado por etapas

         ●   Português e Inglês

         ●   Linguagens: cgi, R (análise estatística)

         ●   Banco de dados: MySql
Estrutura do Programa
                      Definição de um Projeto
           LGE e Ludwig

   Configuração da Lâmina

                 Submissão dos Arquivos da Lâmina

                                                  Seleção de Dados


                          Análises Estatísticas
Estrutura do Programa: Definição do Projeto
         ●   Criar / Selecionar um projeto

         ●   Definir o padrão
                 Número de Placas funcionais
Estrutura do Programa: Definição do Projeto
Estrutura do Programa: Arquivos da Lâmina
        ●   Submissão dos arquivos

        ●   Definição dos grupos

        ●   Definição dos canais
Estrutura do Programa: Arquivos da Lâmina
Estrutura do Programa: Seleção dos Dados
        ●   Exclusão de spots indesejados
                Diferentes formas de exibir os dados
                Diferentes filtros
                Imagens
Estrutura do Programa: Seleção dos Dados
Estrutura do Programa: Normalização
        ●   Métodos diferentes

        ●   Opções

        ●   Visualização
Estrutura do Programa: Normalização
Estrutura do Programa: Análises estatísticas
         ●   Fold Change

         ●   Pvalue
Estrutura do Programa: Análises estatísticas
Gráficos: Lâmina

                          (Fonte: Leandra Scarpari)
Gráficos: M vs A plot

M = log2(R/G)
A = ½ log2(RG)
                        (Fonte: Leandra Scarpari)
Gráficos: M vs A plot

                        (Fonte: Ana Deckmann)
Gráficos: Density

                    (Fonte: Leandra Scarpari)
Gráficos: VolcanoPlot

Fold Change: Escala de comparação entre as razões
               (Quanto maior o módulo, mais diferencialmente expresso)
Pvalue: Reprodução dos dados
        (Quanto menor, mais estão se reproduzindo os dados)
                                       (Fonte: Leandra Scarpari, Ana Deckmann)
Gráficos: Clustering

Busca de padrões

                       (Fonte: Ana Deckmann)
Box plot
Comparison of normalization methods for Codelink Bioarray data

                             Differences between pair of arrays
                                 in the technical replicates :
                             (1) Array 1 vs array 4
                             (2) Array4 vs array 5

                                  BMC Bioinfomatics 2005, 6:309
- Within slide normalization
                                           Print-tip normalization

                               Before                     After

       No norm                 Print tip                 Scaled print tip

                  Nucleic Acids Research, 2002, vol 30, No 4

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