Docstoc
EXCLUSIVE OFFER FOR DOCSTOC USERS
Try the all-new QuickBooks Online for FREE.  No credit card required.

Inleidingsles Homepage Universiteit Gent icterus

Document Sample
Inleidingsles Homepage Universiteit Gent icterus Powered By Docstoc
					 Praktische Oefeningen
MEDISCHE BIOCHEMIE
             Prof. Dr. J. Van Bocxlaer


                Apr. Ruben t’ Kindt
                Apr. Michael Storme
                 Apr. Julie De Smet

                  Mr. Wim Goeteyn

Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse
                 Overzicht

   Doel

   Algemene richtlijnen

   Technieken

   Uit te voeren proeven
                             Doel
       = bepaling van endogene componenten in een
                    biologische matrix...

Bloed                Urine          Punctievocht               Etc.
Serum / Plasma


Complicatie: vele andere, gelijkaardige componenten aanwezig
             dikwijls in veel  conc.
             nood aan       SELECTIVITEIT
                             SENSITIVITEIT

…om     pathologische toestanden           op te sporen en/of
                                           te bevestigen
                           Bloed
Afname zonder                                   Afname met
anticoagulans                                   anticoagulans
                                                    
STOLLING                                        GEEN STOLLING
                  uitzakking of centrifugatie


           SERUM: helder                              PLASMA
                      supernatans


         Prop: cellulair materiaal                   RBC, WBC
                stollingsEW
                             Anticoagulans
    = antistollingsmiddel
    wordt toegevoegd aan proefbuis voor bloedafname



    Voorbeelden:

    NaF              F- inhibeert de enzymatische activiteit

    NaCitraat
                     Complexatie Ca2+
    EDTA

    Heparine         Prothrombine             thrombine
                Bepaling van…

 een targetcomponent
               creatinine, bilirubine, ureum, cholesterol...



 een enzymactiviteit

               Alkalische fosfatase, LDH, …
     Bepaling van een targetcomponent

               Algemene strategie

 Monster: ontdooien
            mengen !

 Deproteïniseren: = hogere structuren van proteïnen
                   H2SO4, TCA, EtOH

 Centrifugeren
 Supernatans:           = bovenstaande vloeistof
                         moet steeds HELDER zijn!




Spectrofotometrie                          Fluorimetrie
- na chemische kleurreactie
   bilirubine, glucose colorimetrisch       Phenylalanine
- na enzymatische omzetting
    glucose enzymatisch
            Bepaling van een enzymactiviteit


    bepaling van targetcomponent
   uitvoering op speciale spectrofotometers
   rekening houden met chemische structuur
   Michaëlis-Menten !!!!
   meestal kinetische bepaling
     - overmaat substraat toevoegen
     - hoev. substraat afgebroken/ tijdseenheid
      of hoev. product gevormd/ tijdseenheid

               spectrofotometrisch            volgen
     - enzymactiviteit berekenen
    Reactie-
    snelheid

                              0de orde: overmaat substraat
                                        bepalen van enzymactiviteit




ste                                         Conc. Substraat
1     orde: overmaat enzyme
           bepalen van substraat
                       (targetcomponent)
              Algemene Richtlijnen
                              Stalen
!! steeds HOMOGENISEREN:                   omzwenken
                                           niet schudden
   1 plasmastaal ( 9 mL)
           gedurende volledig practicum bewaren
           onmiddellijk na gebruik in de ijskast
           niet in de zon laten staan
           zilverpapier rond staal: zelf meebrengen (bilirubine
            breekt af o.i.v. licht)
   1 bloedstaal  hematologie


STEEDS op de dag zelf ter beschikking gesteld


Opmerking: Handschoenen!
                     Materiaal
   Plastiek box
              materiaal
              lijst controleren bij begin practicum
   Chronometers
   Knikkers                Zelf meebrengen

   Zilverpapier
   Spectrofotometers
              steeds aangeduid toestel gebruiken
              ALLEEN plastieken cuvetten gebruiken
              cuvetten voorspoelen
   Centrifuges

                     
                                           = 
                                             = 


        STEEDS symmetrisch vullen

         Indien nodig: evenwicht door toevoegen van een buis water

        STEEDS centrifugeerbuizen merken!
                    Reagentia
   Standaarden:
        meestal 1 per groep
        correcte concentratie gebruiken in de berekening
        nooit voorspoelen met standaardoplossingen
        contaminatie vermijden!
        ijskast!

   Producten aan weegschaal:
        droog houden: deksels op potten!!

   Vloeibare reagentia:
        flessen afsluiten met juiste stoppen 
     contaminatie!

   Kits: zuinig zijn!! (LDH en glucose enzymatisch
    slechts 1x uitvoeren)
                   Verslagen

   Geen papieren verslagen meer

   Resultaten in SI-units (zie omrekeningstabel, bijlage 2)

   Resultaten in computer ingeven, LOGIN en PASWOORD worden
    samen met staal geleverd.
    Algemeen - Milieu - Veiligheid


 Proper werken - ‘s Avonds opruimen (trekkasten,
  microscopen!)
 GEEN jassen, GEEN boekentassen
 LABOJAS verplicht
 VEILIGHEIDSBRIL
 NIET met de mond pipetteren (peer)
 MILIEU!!! GEEN reagentia in wasbakken (ook niet
  vanuit cuvetten), enkel in afvalvaten
              Voorbereiding:


 Dagelijks ondervraging mogelijk
 Zowel schriftelijk als mondeling
 Geen examenproef, dus GOED WERKEN


 Resultaat practicum telt voor 25% mee in het
  eindresultaat   van     het  opleidingsonderdeel
  Medische Biochemie !!!!
              Technieken

   Spectrofotometrie
                               Spectrofotometrie
Lichtstraal van bepaalde energie ( E 1/ ) die door een oplossing

wordt gestuurd zal met de moleculen van die oplossing interactie

vertonen.
      De buitenste electronen van de moleculen worden door de
       EMS naar een hogere energietoestand gebracht.
      Intensiteit lichtstraal daalt.

                                   dI
            Intensiteit




                          I0

                                           I

                                          Afstand
  - dI  I0            met I = oorspronkelijke intensiteit
                            0

        N*                N* = # absorberende deeltjes / cm2 doorsnede




via mathematische afleiding:    Wet van Lambert-Beer

                           I0
               E = log          = .M.l
                           I

               E       = extinctie
                      = molaire extinctiecoëfficiënt
               M       = molariteit v/d oplossing
               l       = weglengte
Spectrofotometer: schematisch

                    I0           I
                                        detector
        1     2            3                4


     - onderdelen     1. lichtbron (UV, of zichtbaar)
                      2. golflengteselector
                      3. cuvet (glas,plastiek of quartz)
                      4. intensiteitsmeter (fotogevoelige cel)

     - meestal 2 schaaluitdrukkingen: T en E

                      E = log 1 / T
Doel = Concentratiemetingen

  1. met 1 bekende en een onbekende: 1-puntscalibratie

           Ex  Cx                                              Ex . Cst
                                                   
                               Ex             Cx
                                     =                   Cx =
           Est  Cst           Est            Cst               Est

  2. met reeks bekenden en onbekende: ijklijn


          E4                                               y = ax + b
    Ex    E3
          E2
          E1

                     C1       C2         C3         C4
                                               Cx
                Proeven

   Medische achtergrond

   Praktische aspecten
                 HEMATOLOGIE

   RBC of erythrocyten:
     Aantal



   WBC of leucocyten:
     Aantal

     Leucocytaire formule
                         RBC

     Anemie                           Polycythemie


  # RBC en/of Hb                     # RBC en/of Hb 

Overmatig bloedverlies         Fysiologisch: bewoners
Hemolytische anemie            hooggebergte of hoogtestage
Defecte bloedaanmaak               O2-gebrek  EPO 
                               Pathologisch: t.g.v. beenmerg-
                               of niertumor
                                WBC

   Onmisbare rol in het afweermechanisme
   Pathologie:
                   Leucopenie             Leucocytose


                  # WBC < 4000           # WBC > 10000

 Differentiatie  leucocytaire formule
                   Vb. # granulocyten < 1000/ µL  infectiegevaar 
                         Praktisch

   VOLBLOED: de dag zelf ter beschikking
   Tellen RBC:
     Telkamer van Bürker: 2 kamers per draagglas

     Hayemopl.: bevat HgCl2 (GIFTIG)

   Leucocytaire formule:
     Geen dekglaasje, maar een dr. immersie-olie

   Microscopen:
     Lenzen ev. schoonmaken met xylol
     Voorwerpglaasje NIET raken met lens
                           UREUM

   Degradatie van ANZ  afsplitsing a-NH2-groep
                           trans- of de-aminatie-reactie
   Elk metaboliserend weefsel produceert NH4+  toxisch

                             Ureum- of ornithinecyclus

                     Omzetting NH4+-ionen tot ureum in lever
                     Minder toxisch
                     Gemakkelijke eliminatie langs nier

   N-bevattende eindprodukten  urine

   Uremie  nierfunctie testen
                          Praktisch


   Proefbuizen afsluiten met knikker  bediende

   TIMING!!!
                       BILIRUBINE

   Hb (MW: 64450):
     Tetrameer = 4 HEEM groepen + 4 GLOBINE ketens

     Drager van O2



   Biodegradatie Hb (lever):
     Splitsing in heem en globine

     Proteïnedeel  proteïne-catabolisme

     Heem  bilirubine  glucuronidatie (gal)  darm: faeces
                                                urine
                         Geelzucht of icterus


            Hyperbilirubinemie: opstapeling bilirubine t.g.v.
                                   levercelbeschadiging
                                   obstructie van de galafvoer



                             Praktisch
   Bilirubine: lichtgevoelig  zilverpapier
   Enkel totaal bilirubine wordt bepaald
   Diazo II en diazoreagens: zelf maken
   Ijklijn: zie p. 37
                        CREATININE
   Creatine:    glycine + arginine + methionine
                 belangrijke spierconstituent
   Fosfocreatine:       ° spieren in rust
                         ogenblikkelijke E-leverancier voor
                         spiercontracties
                         cycliseert spontaan tot creatinine
   Creatinine: nutteloos afvalprodukt
                 uitscheiding door nier
   Creatininemie  o.a. nierinsufficiëntie
                           Praktisch

   Creatinine stockstandaard :    frigo
                                   nog verdunnen
   MIN. 1u incuberen
   Alk. picraatreagens vlak voor gebruik bereiden
   Natriumtungstaat = natriumwolframaat
                   ELEKTROFORESE
   %-samenstelling van de EW
      Albumine

      Diverse globulines (o.a.  -globulines  immunologische reflex)

          afwijking: indicatie pathologie
   Scheiding: gebaseerd op differentiële migratie van geladen EW in
    een elektrisch veld (zie ook item in Webcourse)


                           Praktisch
   Let op:   elektroforesekamer in werking  220V
              reagens om strips op te lossen is sterk zuur  peer
                            GLUCOSE
   De onmiddellijke E-bron bij uitstek voor de cellen
            bij overmaat: start glucose consumptie
                  glycogenese, glycolyse, lipogenese
            bij tekort: start glucose productie
                   gycogenolyse, gluconeogenese, interconversie
            dirigenten: insuline + glucagon


   Diabetes Mellitus of suikerziekte:
            basisdefect:  insuline
            biochemisch: hyperglycemie
                            glycosurie
                            ketogenese en acidose
             klinische symptomen
                               Bepalingen
   Hexokinasemethode: meest specifieke methode
                       glucose enzymatisch

                       hexokinase
       glucose                            glucose-6-P

                 ATP                ADP

                          G-6-fofaat-DH
    glucose-6-P + NADP+                   6-fosfogluconaat + NADPH + H+


                                          NADPH  spectrofotometrisch van NADP+

    * Slechts 1 X per student
    * TIMING
    * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans
   Colorimetrische methode: Somogyi-Nelson
                             glucose colorimetrisch



             van eiwitten
            kleurvorming gebaseerd op reducerende eigenschappen




    * arsenomolybdaat-reagens: giftig, gebruik dispenser
    * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans
         ENZYMACTIVITEITSBEPALINGEN

   Frequent uitgevoerd in het klinisch labo

   Soorten plasma-enzymen:

        Plasma-specifieke        conc plasma > conc cellen
                                  specifieke functie
                                  aanmaak in lever
                                  conc plasma  bij leverdeficiëntie

        Niet-specifieke = enzymen van cellulair metabolisme
                                  specifieke voor weefsel of orgaan
                                  conc plasma  bij celbeschadeging
                                  vb. ADH in levercellen
             Alkalische fosfatase (ALP)

   Opsporing van o.a. lever- en botafwijkingen
   p-nitrophenylfosfaat            p-nitrophenol
   Absorbtie van p-nitrophenol bij 405 nm


                           Praktisch
   WWB 30°C
   Opletten: bij 37° C denatureert ALP!




                                                    Niet te lang!

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:151
posted:1/26/2011
language:Dutch
pages:41