Gebrauchsinformation Instructions for use mumps by mikeholy

VIEWS: 9 PAGES: 11

									návod k použití




BAG-Mumps-EIA


        Enzymatická imunoassay (ELISA) k průkazu
           IgG / IgM protilátek proti viru příušnic




in vitro diagnostikum




BAG-Mumps-EIA-G                                   kat.č.: 5227
BAG-Mumps-EIA-M                                   kat.č.: 5228

                             platné od:         prosinec 2003
použité symboly IVD

MTS                   mikrotitrační stripy
SPE │ DIL             ředící roztok
WASHBUF │ 25X         promývací roztok (25x koncentrovaný)
CONJ │ POD            koncentrovaný konjugát
SUBST │ TMB           roztok TMB substrátu
SOLN │ STOP           stop solution roztok k zastavení reakce
CONTROL │ +           pozitivní kontrola
CONTROL │ -           negativní kontrola
CUT OFF               cut-off-kontrola
LOT                   číslo šarže
IVD                   in vitro diagnostikum
REF                   katalogové číslo
RTU                   připraveno k použití
s 96                  počet testů
                      nahlédněte do návodu k použití
                      limity teploty skladování
                      trvanlivost




                                                                2
GB       ELISA ASSAY PROCEDURE                                               CZ     PRŮBĚH TESTU


                           Dilution of samples:                                                          Ředění vzorků:
                       Dilute patient samples 1:101                                              Nařeďte vzorky pacientů 1:101
                      10 µl sample + 1 ml SPE DIL .                                               10 µl vzorku + 1 ml SPE DIL.
                     Controls/ calibrators are RTU !                                                  kontroly jsou RTU !
Take required MTS out of the foil packet and place them in the holder. Do      Vyjměte odpovídající počet MTS z plastového sáčku a upevněte je do
not touch the wells. Unrequired MTS should be put in the plastic bag with    rámečku. Nedotýkejte se dna komůrek. Nepoužité MTS musí být uloženy
                      desiccant and closed carefully                                         v uzavřeném sáčku s vysoušecí látkou.

                                   ▼                                                                         ▼
            PIPETTE 100µL BLANK (A1), CONTROLS AND                             NAPIPETUJTE 100 µl BLANKU (A1), KONTROL A NAŘEDĚNÝCH
                       DILUTED SAMPLES                                                                VZORKŮ
                                   ▼                                                                         ▼
                     FIRST INCUBATION        30 MIN.                                             PRVNÍ INKUBACE      30 MIN.
                                   ▼                                                                         ▼
                          FIRST WASH STEP                                                            PRVNÍ PROMÝVÁNÍ
                                   ▼                                                                         ▼
     After incubation wash the wells 4 times with diluted WASHBUF                 PO INKUBACI PROMÝVEJTE 4X WASHBUF (NAŘEDĚNÝM)
                                   ▼                                                                         ▼
                  Pipette 100 µl CONJ POD each well                                      Pipetujte 100 µl CONJ POD do každé jamky
                                   ▼                                                                         ▼
                   SECOND INCUBATION          30 MIN.                                           DRUHÁ INKUBACE        30 MIN.
                                   ▼                                                                         ▼
                         SECOND WASH STEP                                                           DRUHÉ PROMÝVÁNÍ
                                   ▼                                                                         ▼
     After incubation wash the wells 4 times with diluted [WASHBUF]               PO INKUBACI PROMÝVEJTE 4X WASHBUF (NAŘEDĚNÝM)
                                   ▼                                                                         ▼
                  Pipette 100 µl SUBS TMB each well                                      Pipetujte 100 µl SUBS TMB do každé jamky
                                   ▼                                                                         ▼
                     THIRD INCUBATION       10 MIN.                                              TŘETÍ INKUBACE      10 MIN.
                                   ▼                                                                         ▼
             After exaktly 10 min stop reaction by adding                    PO PŘESNĚ 10 min. UKONČETE ENZYMATICKOU REAKCI PŘIDÁNÍM
   100 µl [SOLN|STOP] each well. Shake plate carefully until colour is                   100 µl SOLN STOP DO KAŽDÉ JAMKY.
                             homogenous.                                         PROMÍCHEJTE OPATRNĚ, AŽ JE ZBARVENÍ ROVNOMĚRNÉ
                                   ▼                                                                         ▼
                       PHOTOMETRIC READING                                                      FOTOMETRICKÉ ODEČTENÍ
                                   ▼                                                                         ▼
             Measure all Optical Density values (OD) within                       ZMĚŘTE OPTICKOU DENZITU (OD) NEJPOZDĚJI DO 10 min.
10 min. against the Blank, with a spectrophotometer at 450 nm / 630 or 620              PŘI 450 nm VLNOVÉ DÉLKY PROTI BLANKU.
                                    nm.                                                    Referenční vlnová délka je 630/620 nm.




                                                                                                                                                    3
Návod k použití

BAG- Mumps -EIA

        Enzymatická imunoassay (ELISA) k průkazu
           IgG / IgM protilátek proti viru příušnic


in vitro diagnostikum



1.    Úvod
 Virus příušnic patřící do čeledi paramyxovirů se vyskytuje celosvětově. Infikováni
mohou být lidé všech věkových kategorií. Přibližně 35% veškerých infekcí probíhá
bezpříznakově. Infekce se vyskytují již u dvouletých, největší množství infekcí je ale ve
věkové skupině 4 - 6 let, takže ve skupině čtrnáctiletých má protilátky 80% jedinců.
Promořenost dospělých je 95%.

K přenosu viru spalniček dochází především v zimním období s epidemickým výskytem
jedenkrát za dva až sedm let. K přenosu dochází kapénkovou infekcí, blízkým
kontaktem a respiračním traktem. U symptomatických infekcí je inkubační doba 12 - 35
dní.
Po první virémii je virus lokalizován v příušních žlázách, slinivce, varlatech, vaječnících
a mozku, při druhé virémii probíhá reprodukce viru převážně v příušních žlázách. Pokud
jsou napadena varlata, může být následkem choroby sterilita. Infekce virem příušnic
v průběhu těhotenství může vést ve vzácných případech i k potratu.

Infekce virem příušnic působí celoživotní imunitu a vakcinace umožní 90% ochranu
proti nákaze.


2.    Princip testu
Purifikované, homogenní, inaktivní antigeny jsou navázány na dno jamek
mikrotitračních stripů MTS. Veškeré specifické protilátky přítomné v séru pacienta jsou
navázány v průběhu první inkubace. Po odstranění nenavázaných protilátek
promýváním, je přítomnost specifických protilátek detekována pomocí CONJ │POD IgG
IgM v průběhu druhé inkubace. Přebytečný konjugát je odstraněn a přidá se SUBS│TMB
jehož reakcí dojde ke zbarvení na modro. Enzymatická reakce je zastavena přidáním
SOLN │ STOP . Intenzita žlutého zbarvení je úměrná koncentraci protilátek ve vzorku.




                                                                                          4
3.    Reagencie
3.1   Obsah soupravy
                                          Mikrotitrační stripy, jednotlivé, každý s osmi
MTS                           12          mikrotitračními jamkami, barevně označené,
                                          potaženy purifikovaným, inaktivovaným
                                          antigenem
                               1          Držák mikrotitračních stripů
                               1          Plastikový sáček s vysoušecím
                                          prostředkem
WASHBUF │ 25X                80 ml        Promývací roztok (25x koncentrovaný)
SPE │DIL                    100 ml        Ředící roztok
                                          (s 0,05% mikrobiální konzervační látkou)
                                          RTU
CONJ │ POD                                koncentrovaný peroxidázový konjugát Anti-
IgG                          12 ml        human IgG / nebo IgM (ovčí),
IgM                                       (konzervační látka: 0,049% Thimerosal)
                                          RTU
CONTROL │ -                 1,2 ml        negativní kontrola, (lidská)
                                          (konz. látka: 0,095% azid sodný)       RTU
CUT OFF 50 U/ml             2,4 ml        Cut-off kontrola , (lidská)
                                          (konz. látka: 0,095% azid sodný)       RTU
CONTROL │ +                 1,2 ml        Pozitivní kontrola, (lidská)
U/ml viz etiketa                          (konz. látka: 0,095% azid sodný)       RTU
SUBST │ TMB                  13 ml        roztok TMB substrátu                       RTU

SOLN │STOP                   15 ml        roztok stop solution (0,95 N kyselina sírová)
                                          RTU
                               1          k dané šarži specifický informační list

3.2. Další potřeby neobsažené v soupravě
    pipety, automatické pipety                        automatická promývačka
    stopky                                             (vhodné), nebo opakovací pipetar
    odměrný válec                                     spektrofotometr na odečítání
    destilovaná voda                                   absorbance mikrotitračních desek
    zkumavky pro ředění vzorků                         (měřící λ=450nm / referenční
                                                        λ=620-630nm
4.    Charakterizace antigenů
Antigen: virus příušnic                                 Kmen: Enders
Purifikace: ultrasonikace, centrifugace                 Kultivace: Rita monkey kidney
                                                                    (opičí ledviny)

5.    Skladování
Veškeré reagencie skladujte při t +2...+8°C a chraňte před přímým světlem. Datum
exspirace pro každou reagencii je vyznačeno na nálepce a platí (vyjma výjimek viz níže)
také pro skladování po prvním otevření. Nepoužívejte reagencie po datu exspirace.
Po otevření musí být MTS skladovány při t +2...+8°C v plastovém sáčku s desikantem a
jsou stabilní až 4 týdny. Naředěný WASHBUF je stabilní při skladování při t +2...+8°C
také po dobu 4 týdnů.


                                                                                           5
6. Bezpečnostní opatření
ELISA test je určen pouze pro IVD – in vitro diagnostiku

   1. Nemíchejte reagencie jako jsou MTS , kontroly, CONJ │ POD z různých balení.
      SUBST │TMB nemusí pocházet ze stejné testovací soupravy, ale jejich šarže by
      měla souhlasit se šarží na nálepce testovací soupravy.
      SPEL │ DIL , WASHBUF │25X a SOLN │STOP mohou být používány s jakýmkoli
      BAG ELISA testem, libovolné platné šarže a typu.
   2. Uzavírejte veškeré lahvičky pečlivě, abyste zabránili bakteriální kontaminaci.
      Veškeré vzorky a reagencie je třeba považovat za potenciálně infekční. Kontroly
      byly testovány na antigeny proti hepatitidě B, HIV I a II , HCV a byly shledány
      negativními.
   3. MTS jsou potaženy inaktivovaným antigenem, přesto dodržujte běžná laboratorní
      bezpečnostní opatření pro práci s infekčním materiálem, nepipetujte ústy.
   4. Vyvarujte se kontaktu kůže nebo sliznic s reagenciemi, které obsahují
      konzervační látky (viz obsah soupravy). V případě kontaktu omyjte velkým
      množstvím vody, případně vyhledejte lékaře.
   5. Kontroly obsahují azid sodný, který může reagovat s olovem a mědí (např.
      v instalaci) za vzniku výbušných kyselin kovů. Splachujte proto velkým
      množstvím vody.
   6. SOLN │STOP : při kontaktu s kůží pečlivě opláchněte, při kontaktu s očima
      vypláchněte vodou a vyhledejte lékaře.
   7. Pro likvidaci odpadu postupujte podle zákona o odpadech.



Obecné poznámky:

   1. Práci s diagnostickou soupravou by měl provádět pouze kvalifikovaný a školený
      personál.
   2. Návod k použití popisuje správný a ověřený postup testu, pokud si upravíte
      testovací proceduru, je na vás, abyste ji validovali a tím za ni i zodpovídali.
   3. Vzorky lipemické, ikterické, vzorky po hemolýze nebo mikrobiálně
      kontaminované mohou způsobit chybné výsledky.
   4. Vhodným testovacím materiálem je sérum nebo plasma (heparinizovaná, EDTA)
      získaná standardními laboratorními technikami.
   5. Vzorky by neměly být inaktivovány teplem, neboť inaktivace může způsobit
      nespecifické výsledky. Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zamrazování.
   6. Z etických důvodů bylo použití vzorků mozkomíšního moku (CSF) validováno
      pouze testováním dvojic CSF a sérových vzorků distribuovaných “Institut für
      Standardisierung und Dokumentation” (INSTAND) v Německu a tedy používání
      CSF vzorků musí být ověřeno dostatečným množstvím vzorků.
   7. Vzorky z pacientů by měly být skladovány při t 2...8°C. Pro dlouhodobé
      skladování doporučujeme teploty t –20°C a méně.


      POZNÁMKA: již naředěné vzorky musí být použity tentýž den!!!




                                                                                    6
7. Příprava reagencií a vzorků
!!!Soupravu a všechny reagencie před použitím vytemperujte na pokojovou teplotu.*!!!

     Promývací pufr WASHBUF │25X
        Zřeďte koncentrovaný promývací pufr v poměru 1:25 destilovanou vodou,
    např. přidejte 40 ml koncentrovaného promývacího pufru WASHBUF │25X
    k 960 ml destilované vody a dobře promíchejte.


     Ředění vzorků
    Zřeďte vzorek pacientova séra v poměru 1:101 v ředícím                     pufru
    SPE │DIL , (tj. např. 10 μl séra + 1 ml pufru). Dokonale promíchejte.
    Kontroly jsou RTU.


    POZNÁMKA: Pro zahrnutí času nutného k pipetování doporučujeme, aby byly
    CUT OFF opakovány po každých čtyřech MTS a byla pro následující pacienty
    vypočítána nová hodnota cut-off. V případě semikvantitativního testování by
    také CONTROL │+ měly být opakovány po každých 4 MTS .

*!!! pokojová teplota: t maximálně 25°C !!!

8. Pracovní postup
Vyjměte potřebný počet stripů MTS z obalů a upevněte je do rámečku. Nedotýkejte se
jamek! Nepoužité stripy MTS by měly být uloženy v plastikovém sáčku s desikantem a
pečlivě uzavřeny.
       První inkubace: 100μl po dobu 30min při pokojové teplotě *
Napipetujte 100μl naředěných vzorků stejně jako RTU kontrol do odpovídajících
jamek. Do první jamky (A1) napipetujte blank (100μl SPE │DIL ). Chraňte před
přímým světlem.
       první promývací krok
Po první inkubaci promyjte jamky 4krát WASHBUF   (naředěným!!!).
Automatické promývání: postupujte podle návodu k vašemu přístroji. Všechny jamky by
měly být naplněny dostatečně a rovnoměrně stejným objemem WASHBUF. Vyhněte se
napěnění a nepoškrábejte jamky v průběhu promývání.
Ruční promývání: Po kompletním odstranění vzorku a CONJ │POD naplňte jamky 200μl
promývacího roztoku. Odsajte roztok. Poté pipetujte nejméně 300μl promývacího roztoku
do každé jamky a odsajte po cca 30 sekundách. Po ukončení promývání vyklepejte jamky
pečlivě na savý papír, aby byly odstraněny zbytky roztoků.

   Druhá inkubace 100 µl CONJ │POD 30 min. při pokojové teplotě t *
    Přidejte 100µl RTU CONJ│POD (červená barva) do každé jamky a chraňte před přímým
    světlem.




                                                                                        7
         Druhé promývání:
      Po inkubaci 4x promývejte naředěným WASHBUF (viz první promývání).
             Třetí inkubace:100μl SUBS │ TMB po dobu 10 min při pokojové teplotě *
                                           (v temnu)
      Přidejte 100μl RTU SUBST│TMB substrátu do každé jamky. Ihned umístěte destičku do
      temna a inkubujte.
         stop reakce 100μl SOLN │STOP
      Po přesně 10ti minutách zastavte reakci přidáním 100μl SOLN │STOP . Opatrně
      pohybujte destičkou až dosáhnete rovnoměrného zbarvení.
         Fotometrické odečtení výsledků
      Pokud je to nezbytné, osušte a očistěte dno jamek savým papírem. Změřte optickou
      denzitu ve všech jamkách (OD) proti blanku během 10ti minut na spektrofotometru při
      λ=450nm (referenční délka λ=630 nebo 620 nm).
POZOR: Absorbance (OD) blanku musí být vždy odečtena od hodnot OD CONTROL │ - ,
kontrol/kalibrátorů i vzorků.

*pokojová teplota: maximálně 25°C.


9.        Vyhodnocení testu
9.1       Kvalitativní test

                       OD CONTROL │-
                     + OD CUT OFF
                     = Cut-off hodnota (50 U/ml)

          Rozmezí cut-off = vypočítaná hodnota cut-off ± 10 %

          Vzorek je pozitivní, je-li jeho OD > hodnota cut-off + 10 %.

          Vzorek je negativní, je-li jeho OD < hodnota cut-off – 10 %.


9.2       Kvantitativní test

Vyneste jednotky pro cut-off (50U/ml) a pro CONTROL │+ (viz etiketa na lahvičce)
na osu x a vypočtené hodnoty absorbance cut-off (tj.CONTROL│- +OD CUTOFF )
a naměřenou hodnotu CONTROL │+ na osu y na semilogaritmickém grafu.
Nakreslete přímku spojující průsečíky hodnot absorbancí a jednotek CUT-OFF a
CONTROL │+. Z grafu odečtěte jednotky pacientova séra na základě naměřených
hodnot absorbancí.
Graf je lineární až do hodnoty U/ml pozitivní kontroly CONTROL│+ . Séra s vyššími
hodnotami absorbance je nutno dále ředit. Při výpočtu jednotek je nutno vzít v úvahu
stupeň ředění.

          Příklad:      Sérum předředěné v poměru 1:101 se dále ředí 1 : 4 (1+3).
                        Správná hodnota se poté zjistí tak, že se vypočítané jednotky
                        vynásobí číslem 4.


                                                                                            8
9.3     Kontroly
Podmínkou správného provedení ELISA testu je teplota v laboratoři v rozmezí
t 23°C ± 2°C. Hodnota absorbance negativní kontroly CONTROL│ - by měla
být < 0,100.
Další hodnoty specifické pro danou šarži najdete na přiloženém informačním listě.

Pokud se hodnoty kontrol signifikantně liší od hodnot uvedených v informačním listu
příslušné soupravy, není test v pořádku a je nutné ho zopakovat.


10.    Interpretace výsledků

Protilátky IgM proti viru příušnic jsou tvořeny 2 - 3 dny po projevu prvních klinických
příznaků (a přetrvávají 2 - 3 měsíce) následovány protilátkami IgG, které přetrvávají
celý život. Po vakcinaci živou vakcínou dochází k sérokonverzi v 90% případů,
avšak titr protilátek je o něco nižší, než u přirozené infekce.
K tvorbě protilátek dochází u symptomatických i bezpříznakových infekcí. Reinfekce
je možná a může se projevovat všemi nebo jen některými příznaky. K infekci virem
příušnic může také dojít při špatné vakcinaci.
Sérologické nálezy při infekci virem příušnic jsou silně závislé na stádiu infekce a
době trvání klinických symptomů. Při vytváření konečné diagnózy je proto třeba brát
v potaz nejen výsledky sérologických testů, ale i celkový klinický obraz (současný i
minulý) pacienta.

 IgG     IgM        Interpretace                         Doporučení
               nelze prokázat žádné         v případě podezření na akutní infekci
   -       -   specifické protilátky        doporučujeme provést kontrolní testy
                                            monitorujte IgG protilátky (odběr vzorků
               možná předchozí infekce,
   +       -                                během 14 dnů), sledujte změny titrů
               vakcinace nebo reinfekce
                                            protilátek
                                            monitorujte IgG a IgM protilátky,
               pravděpodobná primární
   -      +                                 sledujte sérokonverzi,
               infekce, možná vakcinace
                                            konfirmační testy jako např. IFA, CF, HI
               pravděpodobná nedávná        monitorujte protilátky IgG a IgM, sledujte
   +      +    infekce, reinfekce nebo      nárůst IgG protilátek,
               vakcinace                    konfirmační testy jako např. IFA, CF, HI

Testy s nerozhodnými výsledky by měly být zopakovány. Následné konfirmační testy
by měly vyloučit nespecifické a zkřížené reakce a tím i sporné výsledky. Po konfirmaci
se ještě doporučuje sledování protilátek pacienta.




                                                                                          9
11.   Výkonnost testu
Citlivost a specificita

Citlivost a specificita EIA testu je založena na výsledcích srovnávacích metod.

      Specificita: IgG      100%        Citlivost:    IgG     94,6 %
      Specificita: IgM      95,7%       Citlivost:    IgM     80 %



Zkřížená reaktivita

   Z důvodů blízké příbuznosti mezi virem příušnic a viry parainfluenzy (zvláště typu 1),
je mezi těmito viry možná zkřížená reaktivita. V případě pozitivních nebo sporných
výsledků doporučujeme vyloučit tyto viry odpovídajícími testy.

Přesnost a reprodukovatelnost:

    Reprodukovatelnost v rámci jednoho testu byla definována pomocí testování dvou
vzorků s rozdílnými hladinami aktivity protilátek nejméně 22x v jednom testu. Koeficient
variace (CV) reaktivního vzorku IgG byl 5,3%, CV nerozhodného vzorku IgG 6,3 %.
Pro IgM test byl CV vysoce reaktivního vzorku 6,3 %, CV nerozhodného vzorku IgM
6,0 %.
Reprodukovatelnost mezi testy byla určena pomocí testování dvou rozdílných vzorků
s rozdílnými hodnotami aktivity protilátek v deseti opakováních testů. CV nerozhodného
vzorku IgG byl 8,6 %, CV reaktivního vzorku IgG 7,2 %. Pro IgM test byl CV vysoce
reaktivního vzorku 11,8 %, CV slabě reaktivního vzorku IgM 11,5 %.


Vnitřní kontrola kvality:

Veškeré kontroly by měly být prováděny s každou skupinou testů. Odpovídající
hodnoty kontrol CONTROL│- CUT OFF CONTROL │+ dané šarže lze nalézt na
přiloženém informačním listu s popisem specificit ke konkrétní šarži. Hodnota
blanku by neměla přesáhnout 0,100 OD.
Pokud neodpovídají hodnoty kontrol, je třeba považovat veškeré výsledky testů za
neplatné a testy opakovat.


Doporučení: Pro každou novou šarži doporučujeme provést vnitřní kontrolu kvality
otestováním jednoho nebo více interních kontrolních jednoznačně specifikovaných
vzorků.




                                                                                       10
12. Řešení problémů

           Chyba                                         Možná příčina
                                      nebyl napipetován CONJ │POD ,
žádná barevná reakce po přidání       kontaminace konjugátu CONJ │POD (pravděpodobně
substrátu                             kontrolním sérem při pipetování) může způsobit jeho
                                      inaktivaci
                                      nesprávný konjugát CONJ │POD (např. z jiného balení),
obecně příliš vysoké                  příliš dlouhá inkubace, příliš vysoká teplota inkubace,
výsledky                              nedostatečná kvalita vody pro promývací pufr WASHBUF
                                      (nízká hladina deionizace)
                                      nesprávný konjugát CONJ │POD (např. z jiného
obecně příliš nízké výsledky          balení), příliš krátká inkubace, příliš nízká teplota
                                      inkubace
                                      nesprávně napipetován ředící roztok SPE│DIL
                                      kontaminované reagencie nebo reagencie s prošlou
hodnota blanku příliš vysoká          exspirační lhůtou, kontaminace vnější strany dna
                                      jamek, překročení času a teplot inkubace
                                      špinavé dno stripů- MTS - opatrně očistěte
falešně pozitivní / falešně           špatně naředěné vzorky, lipemické, hemolytické nebo
negativní výsledky                    ikterické vzorky
nevysvětlitelné, velmi odlišné        kontaminace pipet, špiček nebo skladovacích kontejnerů
výsledky některých testů              kovy (železo, měď atd.), nedostatečné promývání
                                      reagencie a/nebo stripy-MTS nebyly vytemperovány na
vysoká variace (v rámci série)
                                      pokojovou teplotu, promývačka nepracuje správně
                                      podmínky inkubace nejsou konstantní (čas, teplota),
                                      pokojová teplota silně kolísá, špatné pipetování,
vysoká variace (od série
                                      stripy po promývání vyschly, lidský faktor,
k sérii)
                                      kontroly a vzorky nejsou zpracovávány shodně
                                      (nereprodukovatelné výsledky)



13.   Literatura
- Gerike, E.; Tischer, A. in: T. Postmann, Diagnostische Bibliothek Vol.18            ,
  Blackwell Wissenschaftsverlag
- Selb, B.: Medizinische Virusdiagnostik, Umschau Verlag, Frankfurt




                                     BAG Health Care GmbH
                           Na Hlínách 17, 182 00 Praha 8 – Kobylisy
                                 Tel: 286 840 508, fax: 286 840 510
                                     info@bag-healthcare.cz
                                      www.bag-healthcare.cz




                                                                                                11

								
To top