Clonage et vecteur de clonage

Eucaryotes Procaryotes (bactéries) ADN ARN exon transcription ADN transcription ARNm traduction protéine ARNm protéine traduction ADN: double brin (A, T, G, C) ARN: simple brin (A, U, G, C) Protéines: acides aminés Principes ORGANISME DONNEUR VECTEUR Ou transporteur d’ADN. C’est un fragment d’ADN capable de réplication autonome. Clonage et vecteur de clonage ou Technologie de l’ADN recombinant Cours de Sophie Chauvet Extraction et coupure de l’ADN en fragment contenant de un à plusieurs fragments d’intérêt. insertion individuelle de chaque fragment d’ADN dans une molécule de vecteur. Obtention de l’ADN recombinant Nouvelle combinaison de l’ADN d’un génome donneur (qui peut être de n’importe quel organisme) avec l’ADN d’un vecteur qui peut être d’origine complètement différente. Obtention de l’ADN recombinant Le clonage permet l’insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur permettant ainsi d’en obtenir plusieurs copies An Introduction to Genetic Analysis Procédure complète Questions? •Comment obtenir l’ADN de l’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage? Molecular Cell Biology Obtention de l’ADN de l’organisme donneur A partir de l’ADN génomique (chromosomique): L ’ADN génomique est obtenu à partir de lignées cellulaires, de tissus ou d’organismes entiers en fonction de la taille de l’organisme. Pour un organisme donné on part de n’importe quel lot de cellules, l’ADN génomique sera le même. Ordre d’idée de la taille des génomes Homme/Souris 3000 Mb Nematode 97 Mb Drosophile 160 Mb S. cerevisiae (levure) 12 Mb E. coli (bactérie) 4,7 Mb Nombre de gènes 30 000 20 000 14 000 6 200 4 000 Obtention de l’ADN de l’organisme donneur A partir de l’ARN: Principe de la "reverse transcription": ? Comme pour l’ADN génomique, l’ARN est obtenu à partir de lignées cellulaires, de tissus ou d’organismes entiers. Mais chaque type cellulaire exprime un lot donné de gènes donc pour un organisme donné on part d’un lot judicieux de cellules; l’ARN est différent pour chaque type cellulaire. An Introduction to Genetic Analysis Dans ce cas là, quel matériel de départ prendriez-vous? Toutes les cellules expriment-elles le même gène? Informations portées par l’ADN donneur Sur l’ADN génomique: région codante et non codante (régions promotrices, régulatrices) Sur l’ADN complémentaire: région codante, mais il y a aussi les régions (5’et 3’ non traduites) Questions? •Comment obtenir l’ADN de l’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage? Les enzymes de restrictions Définition: sont des enzymes bactériennes qui reconnaissent des séquences spécifiques sur l’ADN de 4 à 8 paires de bases, et qui clivent l’ADN sur les deux brins au niveau de ces sites. Elles coupent l’ADN au niveau des ponts phosphodiesters. Visualisation des fragments de restriction (électrophorèse) OH OH An Introduction to Genetic Analysis Les enzymes de restriction Caractéristiques: • la plupart des sites sont des séquences inversées répétées (palindromes) cas de EcoRI: 5 ’ GAATTC 3 ’ 3 ’ CTTAAG 5 ’ • Coupure avec formation de bouts collants ou à bouts francs: 5 ’rentrant 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5 ’sortant 3’ 5’ 5’ 3’ bout franc 3’ 5’ EcoRI An Introduction to Genetic Analysis PstI SmaI Enzyme Organism from which derived Target sequence (cut at *) 5' -->3' C* C/T C G A/G G G* G A T C C A* G A T C T G* A A T T C * C C A/T G G GG*CC GCG*C A* A G C T T GTT*AAC GGTAC*C *G A T C CTGCA*G CCC*GGG GAGCT*C G*TCGAC T*CGA C*CCGGG Ava I Bam HI Bgl II Eco RI Eco RII Hae III Hha I Hind III Hpa I Kpn I Mbo I Pst I Sma I Sst I Sal I Taq I Xma I Anabaena variabilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus globigii Escherichia coli RY 13 Escherichia coli R245 Haemophilus aegyptius Haemophilus haemolyticus Haemophilus inflenzae Rd Haemophilus parainflenzae Klebsiella pneumoniae Moraxella bovis Providencia stuartii Serratia marcescens Streptomyces stanford Streptomyces albus G Thermophilus aquaticus Xanthamonas malvacearum Questions? •Comment obtenir l’ADN de l ’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? Comment sélectionner le fragment d’ADN voulu? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage? Propriétés des vecteurs de clonage •capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée (origine de réplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique) Molecular Cell Biology •possède un polylinker ou site multiple de clonage Molecular Cell Biology •supporte l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand Différents vecteurs de clonage Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur Les plasmides comme vecteurs de clonage (1) Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne Molécule d’ADN circulaire Peut être considérée comme un minichromosome capable de réplication autonome Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques Type de vecteur Plasmide Phage lambda Cosmide Phage P1 BAC(bacterial artificial chromosome) YAC (yeast artificial chromosome) ADN cloné en kb 20 25 45 100 300 1000 Molecular Cell Biology Les plasmides comme vecteur de clonage (2) Les phages comme vecteurs de clonage *Phage = virus de bactéries Quelles molécules sont capables de se répliquer? Molecular Cell Biology Les cosmides comme vecteurs de clonage Les YACs comme vecteurs de clonage (levure) Molecular Cell Biology Questions? •Comment obtenir l’ADN de l’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? Comment sélectionner le fragment d’ADN voulu? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage? La ligation (ligature...) Une enzyme, la ligase, est capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN en une. Molecular Cell Biology Questions? •Comment obtenir l’ADN de l’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? Comment sélectionner le fragment d’ADN voulu? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage? Les cellules hôtes Quelles types de cellules connaissez vous? Questions? •Comment obtenir l’ADN de l’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? Comment sélectionner le fragment d’ADN voulu? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage? Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes De type procaryotique (bactéries): Cas d’un vecteur plasmidique: l’ADN est introduit dans les bactéries traitées spécialement le plus souvent par choc thermique ou par choc électrique. électroporateur Identification des clones intéressants Dans ce cas les bactéries transformées avec le vecteur ne possédant pas ou possédant l’insert sont sélectionnées --> un criblage est nécessaire Criblage -screening- des clones intéressants (1) Cartographie de restriction Molecular Cell Biology An Introduction to Genetic Analysis Criblage -screening- des clones intéressants (2) Test blanc-bleu (a-complémentation) pBR322 Criblage des clones intéressants (3) AmpR TetR AmpR TetS Clone intéressant An Introduction to Genetic Analysis Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes Questions? •Comment obtenir l’ADN de l’organisme donneur ? Quelles informations porte cet ADN? Comment sélectionner le fragment d’ADN voulu? •Qu’est ce qu’une enzyme de restriction? •Quels sont les vecteurs de clonage? •Comment l’ADN d’intérêt et le vecteur sont-ils liés? •Les cellules hôtes •Comment l’ADN recombinant est introduit dans une cellule hôte et comment celle-ci se multiplie? •Les intérêts du clonage? Quelques exemples... De type procaryotique: Cas d’un vecteur plasmidique Cas d’un vecteur phagique: Production de protéines Utilisation de vecteur d’expression Exemple de l’insuline Molecular Cell Biology Quelles types de protéines chercheriez vous à produire? Autres exemples Levures et bactéries utilisées comme usines: production d'antibiotiques -pénicilline, tétracycline-, d'enzymes comme lipases -lessives-... Création de plantes transgéniques An Introduction to Genetic Analysis Création d’animaux transgéniques Banques d’ADN Cours de Sophie Chauvet Banque (librairie)d’ADN génomique Que chercheriez-vous à cloner? Molecular Cell Biology Comment définir si une banque est suffisamment grande pour espérer trouver un fragment d’intérêt? Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnée en fonction de: Quels peuvent-être à votre avis les facteurs à prendre en compte pour ce calcul? Comment définir si une banque est suffisamment grande pour espérer trouver un fragment d’intérêt? Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnée dans une banque. N=ln(1-P)/ln(1-f) N: nombre de recombinants P: probabilité désirée f: proportion de génome dans un seul recombinant Ex: 99% de probabilité d’avoir une séquence représentée dans une banque de fragments de 17kb d’un génome eucaryote (3.109pb) N= ln(1-0.99)/ln(1-(1,7.104/ 3.109))=8,1.105 colonies Taille de différentes banques N:nombre de colonie Source d'ADN Taille moyenne des fragments d’ADN clonés Criblage d’une banque phagique Hybridation avec uns sonde spécifique... Prochain cours! P=0.90 P=0.95 P=0.99 E.coli 8,5 10 6 1 10 7 1 10 7 720 940 1440 Yeast 2300 3000 4600 Drosophile 23 000 30 000 46 000 An Introduction to Genetic Analysis Exemples de démarches à suivre afin d’isoler un gène Banque d’ADNc Le problème ici est l’obtention de clone dit « full lenght ». Dépend du matériel de départ: •Si séquence régulatrice: criblage d’une banque d’ADN génomique puis une banque d’ADNc •Si séquence codante: criblage directement d’une banque d’ADNc Références •Griffiths, Anthony J.F., Miller, Jeffrey H., Suzuki, David, Lewontin, Richard C., Gelbart, William M., An introduction to genetic analysis, 7/e, 2000, W.H. Freeman. Chapitre 12 et 13 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=i ga •Lodish, Berk, Zipursky Matsudaira, Baltimore, Darnell, Molecular Cell Biology Chapitre 7 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mc b.TOC