Docstoc

THE ROLE OF NS1 ANTIGEN FOR DIAGNOSING DENGUE INFECTION

Document Sample
THE ROLE OF NS1 ANTIGEN FOR DIAGNOSING DENGUE INFECTION Powered By Docstoc
					        THE ROLE OF DENGUE NS1 ANTIGEN AS DIAGNOSTIC TOOL

                                         ARYATI



ABSTRACT

       In tropical and subtropical region, endemic dengue disease is the most important
arbovirosis in terms of morbidity and mortality. To implement appropriate treatment,
there is a need for a direct, rapid and specific detection test during the acute phase of the
infection. For that purpose, viral culture or nucleic acid detection require specialised
environment but sometimes with delays to report results. Dengue specific antibodies
detection is commonly used even if these antibodies appear several days after onset of
symptoms.

       Dengue NS1 Ag assay is an easy-to-use ELISA for dengue antigen detection. The
assay allows early and specific diagnosis of both primary and secondary dengue acute
infections. This new test should be considered in diagnostic algorithms to improve patient
care monitoring. During the first 8 days after clinical onset, detection rates ranged from
93.4 to 63.0 % for NS1 Ag and from 0.0 to 30.8% for IgM serology. When considering
all dengue infected patients, NS1 sensitivity was significantly higher for IgM negative
(88.7%) than for IgM positive (66.2%) samples .

       The dengue NS1 antigen-capture ELISA gave an overall sensitivity of
63.0 % - 93.4% and a specificity of 100%. The sensitivity was significantly higher in
acute primary dengue (97.3%) than in acute secondary dengue (70.0%). The positive
predictive value of the dengue NS1 antigen-capture ELISA was 100% and negative
predictive value was 97.3%.

       Comparatively, virus isolation gave an overall positive isolation rate of 68.1%
with a positive isolation rate of 73.9 and 31.0% for acute primary dengue and acute
secondary dengue, respectively. Molecular detection of dengue RNA by RT-PCR gave an
overall positive detection rate of 66.7% with a detection rate of 65.2 and 75.9% for acute
primary dengue and acute secondary dengue, respectively.


                                                                                           1
       The results indicate that the commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA may
be superior to virus isolation and RT-PCR for the laboratory diagnosis of acute dengue
infection based on a single serum sample.

       NS1 antigen detection could be used for first-line testing for acute dengue virus
infection in clinical diagnostic laboratories.

Keywords: Dengue infection, NS1 antigen detection, Diagnostic, ELISA



PENDAHULUAN
       Gambaran klinis penyakit yang disebabkan oleh infeksi virus dengue ini sering
tidak khas, dapat menyerupai penyakit flu, demam tifoid, demam chikungunya,
leptospirosis, malaria dan berbagai penyakit lain. Manifestasi klinis akibat infeksi virus
dengue ini dapat menyebabkan keadaan yang beranekaragam, mulai dari tanpa gejala
(asimtomatik), demam ringan yang tidak spesifik (undifferentiated febrile illness),
demam dengue (DD) atau bentuk yang lebih berat yaitu demam berdarah dengue (DBD)
dan sindrom syok dengue (SSD) (WHO, 1997).
       Untuk mengantisipasi agar diagnosis DBD dapat ditegakkan dengan segera,
diperlukan pemahaman imunopatogenesis penyakit DBD, pemeriksaan laboratorium
yang tepat dan interpretasi yang didapat dari hasil laboratorium untuk melengkapi gejala
klinis yang ada. Permasalahan sering timbul akibat dari miskomunikasi klinisi dengan
pihak laboratorium, baik dokter spesialis patologi klinik, analis, teknisi dan pasien, di
samping tahapan praanalitik, analitik dan pascaanalitik.
       Penegakkan diagnosis DBD masih menggunakan kriteria WHO, 1997, yaitu
kriteria klinis dan laboratoris berupa trombositopenia kurang dari 100.000/ul atau
peningkatan hematokrit ≥ 20%. Untuk mendapatkan peningkatan hematokrit sebesar
≥ 20% secara tepat, sulit dilakukan, mengingat belum ada nilai standar hematokrit orang
Indonesia anak-anak maupun dewasa. Hal yang tak kalah penting adalah memahami
kelemahan pemeriksaan laboratorium tersebut. Pemeriksaan hemoglobin, leukosit, hitung
jenis, hapusan darah tepi maupun enzim hati seperti SGOT dan SGPT, juga diperlukan di




                                                                                        2
samping trombosit dan hematokrit, untuk memberi informasi lebih, dalam menunjang
diagnosis DBD.
       Pemeriksaan serologis berupa IgM dan IgG antidengue diperlukan untuk
membedakan demam yang diakibatkan virus dengue ataukah demam oleh sebab lain
(demam tifoid, influenza, malaria, hepatitis dan lain-lain). Saat ini sudah ada tes yang
dapat mendiagnosis DBD dalam waktu demam 8 hari pertama yaitu antigen virus dengue
yang disebut dengan antigen NS1. Keuntungan mendeteksi antigen NS1 yaitu untuk
mengetahui adanya infeksi dengue pada penderita tersebut pada fase awal demam, tanpa
perlu menunggu terbentuknya antibodi.
       Pemeriksaan IgM dan IgG antidengue tetap diperlukan untuk membedakan
infeksi primer atau infeksi sekunder. Hal ini penting untuk penatalaksanaan manajemen
terapi di samping epidemiologi, karena pada infeksi sekunder keadaan dapat menjadi
lebih berat (DBD/SSD= Sindrom Syok Dengue).
       Pemeriksaan antigen NS1 diperlukan untuk mendeteksi adanya infeksi virus
dengue pada fase akut, dimana pada berbagai penelitian menunjukkan bahwa NS1 lebih
unggul sensitivitasnya dibandingkan kultur virus dan pemeriksaan PCR maupun antibodi
IgM dan IgG antidengue. Spesifisitas antigen NS1 100% sama tingginya seperti pada
gold standard kultur virus maupun PCR.




STRUKTUR ANTIGEN NS 1 VIRUS DENGUE
       Virus dengue terdiri dari 4 serotipe yaitu DEN-1, DEN-2, DEN-3 dan DEN-4.
Keempat serotipe virus ini terdapat di Indonesia dan dilaporkan bahwa serotipe virus
DEN-3 sering menimbulkan wabah, sedangkan di Thailand penyebab wabah yang
dominan adalah virus DEN-2 (Soegijanto, 2004). Pada penelitian penulis, dominasi
serotipe di Indonesia pada kurun waktu tahun 2003-2005 adalah DEN-2, diikuti oleh
DEN-3, DEN-4 dan DEN-1 (Aryati, 2006). Virus dengue termasuk dalam genus
Flavivirus, famili Flaviviridae, yang terdiri dari 10.700 basa di dalam genomnya. Virus
dengue terdiri dari single-stranded positive sense RNA (ssRNA sense +). Di dalam
genomnya terdapat sebuah single Open Reading Frame (ORF ) yang mengkode 2 macam
protein yaitu protein struktural dan protein nonstruktural. Protein struktural terdiri dari



                                                                                         3
C (protein inti/capsid/core), M (protein membran, termasuk preMembrane) dan
E (protein envelope) serta 7 macam protein nonstruktural yaitu NS1, NS2A, NS2B, NS3,
NS4A, NS4B, NS5 yang ditandai oleh sebuah 5’ dan 3’ nontranslated region (NTR) pada
kedua ujungnya (Yao, 2002).
       Antigen NS1 merupakan glikoprotein tersekresi 48 kDa yang tidak terdapat pada
partikel virus yang terinfeksi namun terakumulasi di dalam supernatan dan membran
plasma sel selama proses infeksi. NS1 merupakan gen esensial di dalam sel yang
terinfeksi dimana fungsinya sebagai ko-faktor untuk replikasi virus,      yang terdapat
bersama di dalam bentuk replikasi RNA double-stranded (Mackenzie, 1996). Immune
recognition dari permukaan sel NS1 pada sel endotel dihipotesiskan berperan dalam
mekanisme kebocoran plasma yang terjadi selama infeksi virus dengue yang berat.
Sampai saat ini, bagaimana NS1 berhubungan dengan membran plasma, yang tidak berisi
motif sekuens membrane-spanning masih belum jelas.
       NS1 terikat secara langsung pada permukaan berbagai tipe sel epitelial dan sel
mesensimal, juga menempel secara kurang lekat terhadap berbagai sel darah tepi.Lebih
lanjut, NS1 juga terikat pada biakan sel endotel mikrovaskuler manusia lebih baik
daripada sel endotel aorta atau umbilical cord. Spesifisitas ikatan ini sudah dibuktikan
terdapat pada ikatan NS1 pada endotel paru dan hati namun tidak pada usus atau otak dari
jaringan tikus.




                                                                                      4
MANIFESTASI KLINIS


                                      Infeksi Virus Dengue


                  Asimtomatik                                 Simtomatik




       Demam tidak       Demam Dengue
       Spesifik




                    Perdarahan (-)        Perdarahan (+)     Syok (-)   Syok (+)
                                                                           (SSD)
                                     DD                             DBD


       Gambar. Spektrum Klinis Infeksi Virus Dengue (dikutip dari WHO, 1997)


IMUNOPATOGENESIS
       Imunopatogenesis terjadinya DBD masih belum jelas diketahui, namun berbagai
macam teori masih dianut seperti hipotesis infeksi sekunder (teori secondary
heterologous infection) , antibody dependent enhancement (ADE) hypothesis, aktivasi
sel-T, teori virulensi virus yang didasarkan pada perbedaan serotipe virus dengue DEN-1,
DEN-2, DEN-3 dan DEN-4, juga faktor genetik, teori autoantibodi dan teori sitokin.
Semuanya dapat ditemukan pada berbagai kasus yang fatal, tetapi berbeda antara daerah
yang satu dengan yang lain. Secara singkat, dikatakan bahwa imunopatogenesis dimulai
dari ADE menyebabkan peningkatan aktivasi sel-T dan produksi sitokin, kemudian
secara berurutan akan mengaktivasi sistim komplemen sehingga menyebabkan kerusakan
sel endotel. Di samping monosit dan sel-T, sel-B pun berkontribusi dalam patogenesis ini
dengan cara memproduksi antiplatelet dan anti-endothelial cell autoantibodies dalam
jumlah tinggi, terutama untuk penderita DBD dan SSD yang selanjutnya akan
menginduksi terjadinya koagulopati dan vaskulopati. Virus dengue juga menginfeksi sel
dendritik, dimana sel dendritik merupakan professional APCs (antigen presenting cells)



                                                                                      5
yang berperan di dalam respon imun primer (Ho, 2001). Menurut Wiwanitkit, 2004,
antigen NS1 memiliki hubungan dengan common epitopes pada fibrinogen dan protein
integrin/adhesin pada trombosit, sehingga peranan NS1 sebagai protein yang penting
dalam reaksi imunologi terjadinya komplikasi perdarahan pada DBD masih merupakan
isyu yang menarik untuk diteliti.
       Pemahaman patogenesis virus dengue ini masih sangatlah kurang disebabkan
tidak adanya model invitro dan invivo yang dapat digunakan untuk pembuktian penyakit
akibat infeksi virus dengue ini.
       Leitmeyer membentangkan sekuens genom virus dengue dikaitkan dengan
kejadian demam dengue maupun demam berdarah dengue. Ia mendapatkan perbedaan
determinan pada DBD terletak pada protein E, bagian 5’UTR, 3’UTR , NS4b dan NS5
(Leitmeyer, 1999). Saat ini patogenesis DBD ini tidak berhenti sampai level serotipe,
namun sampai genotipe/subtipenya. DEN-1 dikategorikan ke dalam 3-5 macam genotipe.
DEN-2 dikategorikan ke dalam 5-6 macam genotipe, DEN-3 ke dalam 4-5 macam
genotipe sedangkan DEN-4 dikategorikan ke dalam 2 macam genotipe.


DIAGNOSIS
       Diagnosis ditegakkan berdasarkan diagnosis klinis dan laboratoris menurut
kriteria WHO, 1997.
Semua kriteria di bawah harus dipenuhi untuk definisi kasus DBD,

   a. Demam tinggi mendadak, tanpa sebab jelas, berlangsung terus menerus selama
       2-7 hari.
   b. Terdapat manifestasi perdarahan ditandai dengan salah satu di bawah :
              uji Rumpel Leede/RL/tourniquet positif,
              petekiae, ekimosis, purpura,
              perdarahan mukosa, epistaksis, perdarahan gusi,
              hematemesis dan atau melena.
   c. Trombositopenia (100.000/l atau kurang).
   d. Hemokonsentrasi, dapat dilihat dari peningkatan hematokrit 20% atau lebih,
       menurut standar umur dan jenis kelamin, atau penurunan hematokrit 20% sesudah
       terapi cairan.


                                                                                   6
    Pada kasus syok/SSD, selain ditemukan hasil laboratorium seperti DBD di atas, juga
terdapat kegagalan sirkulasi ditandai dengan terjadi penurunan demam disertai keluarnya
keringat, ujung tangan dan kaki teraba dingin, nadi cepat atau bahkan melambat hingga
tidak teraba serta tekanan darah tidak terukur. Seringkali sesaat sebelum syok, penderita
mengeluh nyeri perut, beberapa tampak sangat lemah dan gelisah.

    Pada pemeriksaan laboratoris sebaiknya juga dilakukan pemeriksaan Rumpel Leede
(RL) serta darah lengkap selain trombosit dan hematokrit, yaitu hemoglobih, leukosit,
hitung jenis dan hapusan darah serta pemeriksaan enzim hati. Enzim hati akan meningkat,
kadarnya dapat dimulai dari peningkatan 2x normal bahkan ada yang mencapai ratusan
dan ribuan. Hal ini disebabkan karena virus dengue menginfeksi hepatosit di hepar.

        Selain kriteria klinis dan laboratoris menurut WHO, 1997 di atas, saat ini juga
terdapat panduan diagnosis dengue menurut WHO, 2005 (sebagai proceedings dari
international workshop), dimana pada dasarnya harus dipahami respons imunologis
terhadap infeksi virus dengue.



INFEKSI AKUT

Secara umum, pada infeksi akut, dapat dilakukan pemeriksaan :

1. Isolasi virus.

Pengambilan darah terbaik dalam 3 hari fase awal demam yaitu saat terjadinya viremia,
sebelum terbentuknya antibodi antidengue. Sampel dapat berupa serum, plasma atau
buffy-coat darah-heparinized.

Pemeriksaan yang sering dilakukan menggunakan sel kultur C6/36, dilakukan pasase
selama 1-3 minggu. Setelah tampak tanda ada pertumbuhan sel virus dengue, maka
dilanjutkan dengan pemeriksaan ELISA ataupun indirect immunofluoresence yang
dianggap sebagai baku emas. Pada umumnya, isolasi virus hanya digunakan untuk
penelitian, tidak untuk diagnosis laboratorium disebabkan waktu yang lama 1-3 minggu,
membutuhkan peralatan mahal dan tenaga terlatih.




                                                                                       7
2. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) dari serum atau plasma.

RT-PCR dapat dilakukan dengan cara one-step atau nested RT-PCR atau dapat berupa
nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Saat ini di luar negeri , telah banyak
dilakukan pemeriksaan RT-PCR dengan menggunakan alat real-time PCR, dimana hasil
yang didapat lebih cepat dan bersifat kuantitatif.

Keberhasilan PCR juga tergantung dari fase pengambilan serum dan variabilitas yang
luas antar laboratorium dimana masih dibutuhkan standardisasi yang lebih baik.

Hasil akan didapatkan lebih banyak positif pada keadaan viremia.

3. Antigen NS1 (nonstructural glycoprotein 1)

NS1 merupakan glikoprotein yang highly conserved , yang tampaknya merupakan regio
penting dalam viabilitas virus namun tidak memiliki aktivitas biologis. Tidak seperti
glikoprotein virus yang lain, NS1 diproduksi baik dalam bentuk yang berhubungan
dengan membran maupun dalam bentuk yang disekresikan (Dussart, 2006).

Antigen NS1 terdapat baik pada infeksi primer maupun sekunder. Antigen NS1 dapat
dideteksi dalam 9 hari pertama demam, yang terdapat baik pada serotipe DEN-1
(terbanyak), DEN-2, DEN-3 dan DEN-4 (Alcon, 2002).
Kumarasamy, 2007, meneliti sensitivitas dan spesifisitas NS1 pada 554 donor sehat dan
297 pasien terinfeksi virus dengue dimana 157 pasien PCRnya positif dan pasien
diperiksa juga IgM dan IgG antidengue. Beliau mendapatkan spesifisitas 100% dan
sensitivitas 91,0 % dari 157 sampel yang positif PCR nya dengan perbedaan yang tidak
signifikan untuk ke empat serotipe, sedangkan Blacksell, 2008 meneliti NS1 dan beliau
mendapatkan sensitivitas NS1 63% dan spesifisitas 100% dengan memperhatikan adanya
perbedaan sekresi yang bervariasi antar serotipe.
Terdapat 2 macam kit pemeriksaan antigen NS1 di Indonesia, yaitu dari Panbio dan
BioRad, keduanya memakai prinsip metode ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay). Saat ini juga sudah terdapat reagen NS1 dalam bentuk rapid test(ICT).
4. IgM dan IgG antidengue, baik dengan cara rapid test menggunakan metode
imunokromatografi (ICT) ataupun enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)




                                                                                       8
Pada respon imun primer, IgM diproduksi dimulai pada hari ke 3, namun pada umumnya
baru dapat dideteksi pada hari ke 7 demam atau lebih (WHO,2005). Kadar IgM ini terus
meningkat dalam 1-3 minggu dan dapat terdeteksi sampai 2 bulan setelah infeksi.

IgG antidengue diproduksi pada 2 minggu sesudah infeksi dan akan tetap ada di dalam
tubuh selamanya, namun untuk kadar yang dapat dideteksi dengan reagen komersial
IgG capture ELISA, pada umumnya adalah IgG dalam kadar setara dengan infeksi
sekunder (batas Hemagglutination Inhibition > 1/1280 atau ada reagen komersial yang
mematok batas HI > 1/2560). Keadaan akut juga dapat ditentukan dengan menggunakan
rasio IgM dibandingkan dengan IgG antidengue.

Penting untuk membedakan infeksi primer maupun sekunder. Hal ini dapat ditentukan
dari terbentuknya IgG anti dengue yang menunjukkan infeksi sekunder, dimana sudah
dapat dideteksi pada hari ke 3 demam.

Pada respon imun sekunder, IgM dapat dimulai timbul pada hari ke 3, namun optimal
paling sedikit 5 hari setelah demam, bahkan 25-78% tidak terdeteksi pada infeksi
sekunder. IgG antidengue pada respon imun sekunder, meningkat cepat dalam 3-5 hari
demam. Pola reaktivitas IgM dan IgG yang ditentukan dengan menggunakan ELISA ini,
telah dapat membedakan infeksi primer atau sekunder. Keberadaan antibodi IgM tanpa
IgG menunjukkan infeksi primer, sedangkan IgG yang kadarnya meningkat jauh melebihi
IgM menunjukkan infeksi sekunder. IgM dan IgG ini dapat dijumpai baik pada semua
manifestasi klinis infeksi virus dengue, baik yang asimtomatik, demam dengue, demam
berdarah dengue hingga syok sindrom dengue.


KESIMPULAN
       Diagnosis infeksi virus dengue dapat ditegakkan berdasarkan pemahaman
imunopatogenesis, sehingga dapat dipilih dan diikuti berbagai tes laboratorium dengan
tepat. Antigen NS1 dapat dideteksi pada awal demam hari pertama sampai hari
ke delapan . Penggunaan IgM dan IgG antidengue tetap diperlukan untuk membedakan
infeksi dengue primer atau sekunder, namun hasil positif keduanya dapat dijumpai tidak
hanya pada DBD tetapi juga pada demam dengue.




                                                                                    9
       Antigen NS1 dianjurkan diperiksa pada awal demam sampai hari ke delapan.
Sensitivitas antigen NS1 berkisar 63% - 93,4% dengan spesifisitas 100% sama tingginya
dengan spesifisitas gold standard kultur virus. Hati-hati hasil negatif antigen NS1 tidak
menyingkirkan adanya infeksi virus dengue, dimana variasi hasil ini diduga berkaitan
dengan serotipe virus dengue yang menginfeksi. Penulis menyarankan pemeriksaan
antigen NS1 tetap disertai dengan pemeriksaan antibodi IgM dan IgG antidengue sebagai
penentu infeksi primer ataupun sekunder, sekaligus untuk mengatasi kemungkinan hasil
negatif palsu pada pemeriksaan antigen NS1.


DAFTAR PUSTAKA

   1. Alcon S, Talarmin A, Debruyne M, Falconar A, Deubel V and Flamand M, 2002.
       Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Specific to Dengue Virus Type 1
       Nonstructural Protein NS1 Reveals Circulation of the Antigen in the Blood during
       the Acute Phase of Disease in Patients Experiencing Primary or Secondary
       Infections. Journal of Clinical Microbiology, February, Vol. 40, No. 2 :
       p. 376-381.
   2. Aryati, Soetjipto, Soedjoko Hariadhi, Fedik Rantam, Soegeng Soegijanto , 2006.
       Profil serotipe virus dengue di Indonesia tahun 2003-2005. Majalah Kedokteran
       Tropis Indonesia ( MKTI ) Maret ; 17 (1) : 72-80.
   3. Blacksell SD, Mammen MP Jr, Thongpaseuth S, Gibbons RV, Jarman RG,
       Jenjaroen K, Nisalak A, Phetsouvanh R, Newton PN, Day NPJ, 2008. Evaluation
       of the Panbio dengue virus nonstructural 1 antigen detection and immunoglobulin
       M antibody enzyme-linked immunosorbent assays for the diagnosis of acute
       dengue infections in Laos. Diagn Microbiol Infect Dis, Jan, vol 60, No. 1. : 43-49.
   4. Dussart P, Labeau B, Lagathu G, Louis P, Nunes MRT, Rodrigues SG, Herrmann
       CS, Cesaire R, Morvan J, Flamand M, and Baril L, 2006. Evaluation of an
       Enzyme Immunoassay for Detection of Dengue Virus NS1 Antigen in Human
       Serum. American Society for Microbiology, Clin Vaccine Immunol, November;
       13(11): 1185–1189.




                                                                                       10
5. Ho LJ, Wang JJ, Shaio MF, Kao CL, Chang DM, Han SW, Lai JH, 2001.
   Infection of Human Dendritic Cells by Dengue Virus causes cell maturation and
   cytokine production. The Journal of Immunology, 166 : 1499-1506.
6. Kumarasamy V, Wahab AHA , Chua SK, Hassan Z, Chem YK, Mohamad M and
   Chua KB, 2007. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA
   for laboratory diagnosis of acute dengue virus infection. Journal of Virology
   Methods, Maret Vol. 140 (1-2) : 75 – 79.
7. Leitmeyer KC , 1999 . Dengue virus structural differences that correlate with
   pathogenesis. Journal of Virology, 73 (6) : 4738 – 4747.
8. Mackenzie JM, Jones MK, Young PR, 1996. Immunolocalization of the dengue
   virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral replication. Virology
   220 : 232-240.
9. Soegijanto S , 2004 . Demam berdarah dengue. Airlangga University Press
   Surabaya. Hal 99.
10. Wiwanitkit V, 2004. Dengue Virus Nonstructural-1 Protein And Its Phylogenetic
   Correlation To Human Fibrinogen and Thrombocytes: A Study To Explain
   Hemorrhagic Complications. The Internet Journal of Genomics and Proteomics.
   Volume 1, Number 2.
11. WHO, 1997 . Dengue Haemorrhagic Fever : Diagnosis, treatment, prevention and
   control. 2nd edition. Geneva, 1-84.
12. World Health Organization (2005). Dengue diagnostics : proceedings of an
   international workshop. UNICEF/UNDP/World Bank/WHO Special Programme
   for Research and Training in Tropical Diseases (TDR). WHO/TDR 4-6 October
   2004.Geneva, Switzerland.
13. Yao H, Fang M, Zhao W, Duan F, Lin L, Chen C, Guo H, 2002. Identification of
   Genetic variation among dengue virus DEN-3 isolates with heteroduplex analysis.
   Dengue Buletin ; 26 : 118-124.




                                                                                   11

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:140
posted:10/11/2010
language:English
pages:11