GABA y su función regulatoria en plantas

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS GABA y su función regulatoria en plantas Andrea Vega Contreras Noviembre 2004 Introducción El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es un aminoácido no proteico de cuatro carbonos conservado en la mayoría de los organismos. Se ha descrito su existencia desde bacterias a plantas y vertebrados. Sin embargo, la función más importante de GABA se relacionó principalmente con vertebrados por su acción neurotransmisora en el cerebro y su función como molécula señalizadora. Se han descrito funciones de neurotransmisor inhibitorio, inhibidor de la división celular de neuronas corticales y factor de crecimiento. En plantas, GABA fue descubierto en el año 1949. En cambio en plantas sólo se le atribuyó una función de metabolito frente a situaciones de estrés. La vía de síntesis del GABA esta relacionado a varias respuestas fisiológicas, incluyendo la regulación del pH citosólico, flujo de carbono en el ciclo de los ácidos carboxílicos (TCA), metabolismo de nitrógeno, respuesta a insectos, protección contra estrés oxidativo y osmoregulación. En plantas y animales GABA es sintetizado por una vía corta de tres enzimas, llamada “GABA shunt” debido a que esta vía representa un bypass del ciclo de los ácidos grasos. La vía metabólica esta compuesta de una enzima citosólica denominada glutamato carboxilasa (GAD) y de las enzimas mitocondriales GABA transaminasa (GABA-T) y succinil semialdehido deshidrogenada (SSADH). En conclusión, las investigaciones de GABA en vertebrados se focalizó en su función como molécula señalizadora y neurotransmisor; y en plantas, GABA fue principalmente considerado como un metabolito en el contexto de la respuesta de la planta a una condición de estrés bióticos y abióticos, debido principalmente a su rápida acumulación en respuesta a estas condiciones. Sin embargo, investigaciones recientes sugieren que su principal función en plantas no había sido dilucidada; reportando un posible rol de GABA como molécula señalizadora. Esta hipótesis se basa en que una gradiente de esta molécula es esencial para el crecimiento y guía del tubo polínico, sugiriendo que este aminoácido juega una función en la señalización intracelular en plantas, posiblemente similar a su función en animales. La mutante pollen-pistil-interaction-2 (pop2) de Arabidopsis thaliana no codifica una enzima trasaminasa que degrada GABA, perdiendo esta gradiente, que inhibe el crecimiento del tubo polínico en pistilos pop2. Además, estudios en la relación entre el flujo de nitrato, la expresión génica de su transportador y composición aminoacídica del floema en Brassica napus reportan una positiva correlación entre niveles de GABA en el floema y la absorción de nitrato. Este estudio proporciona la primera evidencia que GABA puede actuar como una molécula señalizadora de larga distancia, permitiendo un aumento en la expresión del transcrito de la proteína transportadora de nitrato. La principal interrogante surgida de estos reportes que involucran a GABA como una molécula señalizadora en plantas es la implicancia de esta molécula en cambios en el desarrollo y la vía de señalización celular que interactúa con los receptores hipotéticos de GABA. GABA en plantas El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es un aminoácido no proteico de cuatro carbonos conservado en la mayoría de los organismos. Se ha descrito su existencia desde bacterias a plantas y vertebrados, siendo un compuesto importante en la población de aminoácidos libres en la célula. Este compuesto es altamente soluble en agua debido a su estructura flexible que puede adoptar diferentes conformaciones en solución, incluyendo una estructura cíclica similar a prolina. GABA fue descubierto en plantas en el año 1949, donde Stewards y cols. lo describieron como un constituyente de la población de aminoácidos libres en el tubérculo de papas. En los siguientes cincuenta años se acumuló considerable literatura que demostraba una rápida acumulación de GABA en respuesta a diversos estímulos. Por ejemplo, en respuesta a daño por frío o daño mecánico, los niveles de GABA en hojas de soya (Glycine max) aumentaban 20 a 40 veces en aproximadamente 5 minutos (Wallace et al., 1984). Además se observó una disminución en la concentración de L-glu. Este cambio en la concentración de aminoácidos vuelve a sus concentraciones normales a los 60 minutos, indicando un mecanismo de respuesta para la condición descrita. Otros reportes en varios tejidos indican un aumento en la concentración de GABA en respuesta a daño mecánico, hipoxia, acidificación citosólica, estrés hídrico y fitohormonas (Tabla 1). Las funciones de GABA y su metabolismo reportadas desde su descubrimiento como metabolito en plantas son las siguientes: • Contribución al balance de carbono y nitrógeno : GABA presenta altos niveles de concentración en ciertos tejidos vegetales. Por ejemplo, en frutos de tomate puede representar más del 50% del aminoácido libre (Breitkreuz et al., 1999). GABA esta involucrado en la acumulación y transporte de nitrógeno. Además el metabolismo de GABA esta relacionado con el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. • Regulación de pH citosólico: La producción de GABA es activada por la acidificación del pH celular, debido a que la actividad de GAD es activada por un pH ácido (Baum et al., 1993) Esto sugiere la posible participación de GABA en regular el pH celular. • Protección contra estrés oxidativo: En A. thaliana, mutantes en SSADH son más sensibles a estrés ambientales debido a la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El metabolismo de GABA proporciona sustratos para la cadena respiratoria (succinato y NADH). Estas evidencias sugieren que la degradación de GABA permite prevenir la acumulación de ROS bajo condiciones de estrés oxidativo que inhiben ciertas enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílico (TCA) (Baum et al., 1996). • Defensa contra insectos: GABA es un neurotransmisor en vertebrados e invertebrados. Esta evidencia sugiere que GABA podría ser producido por la planta en defensa a los insectos. Se ha reportado que daño mecánico induce acumulación en la concentración de GABA y su posible ingestión interfiere con el desarrollo normal de los insectos (Shelp et al., 1999). Plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan GABA son descritas como resistentes contra algunos insectos. • Osmoregulador: Transportadores de prolina de A. thaliana (Breitkreuz et al., 1999) y tomate (Schwacke et al., 1999) se describen como transportadores de GABA. Estos transportadores son inducidos en respuesta a estrés salino o deshidratación y son capaces de transportar solutos que poseen una función protectora. El descubrimiento más interesante de este metabolito en plantas fue su posible acción como molécula señalizadora. GABA es un neurotransmisor en animales que posee una función definido en la vía de transducción de señales. Recientes reportes indican que GABA podría ser una molécula señalizadora en plantas. Además, esta hipótesis se ve complementada con la descripción de receptores que unen GABA como un ligando modulador. Metabolismo de GABA en plantas En plantas y animales, GABA es principalmente metabolizado en una vía corta denominada “GABA shunt”, debido que esta vía es un bypass de dos reacciones enzimáticas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Figura 1). Esta vía metabólica esta compuesta por tres enzimas, una enzima citosólica denominada glutamato descarboxilasa (GAD) y dos enzimas mitocondriales denominadas GABA transaminasa (GABA-T) y semialdehido succínico deshidrogenada (SSADH). La regulación de esta vía conservada posee características muy particulares en plantas. Las principales observaciones de regulación fueron reportadas en su rápida acumulación en respuesta a estrés bióticos y abióticos (Shelp et al., 1999). El primer paso de la vía metabólica de GABA es la directa e irreversible descarboxilación de glutamato por GAD. La actividad de GAD ha sido caracterizada in vitro en extracto de proteínas de variadas especies y tejidos. Esta enzima posee un dominio de unión a calmodulina, el cual es importante para su regulación. Los genes de GAD de petunia, tomate, tabaco y A. thaliana han sido identificados. Figura 1. Vía metabólica de GABA y su regulación en plantas. La segunda enzima involucrada en esta vía es GABA-T. Ésta cataliza la conversión reversible de GABA a semialdheído succínico usando piruvato (GABA-TP) o αcetoglutarato (GABA-TK) como un receptor del grupo amino. En extractos proteicos, la GABA-T es más específica para piruvato. Sin embargo ambas actividades han sido identificadas en extractos de proteínas de hojas de tabaco. Los genes que codifican para la enzima GABA-TP han sido parcialmente identificados en plantas de tabaco y un homologo de A. thaliana ha sido clonado (Van Cauwenberghe et al., 2002). La transaminación de GABA ocurre a través de diferentes tipos de GABA-T, los cuales probablemente poseen una expresión tejido específica y una función especializada. A. thaliana mutantes knockout en GABA-TP, muestran un aumento en la concentración de GABA en las flores y un incremento limitado en otros tejidos. Esta evidencia experimental indica que GABA-TP posee una función especializada en flores (Palanivelu et al., 2003). El último paso de esta vía metabólica es catalizado por SSADH, oxidando irreversiblemente el semialdehido succínico a succinato. El gen de esta enzima ha sido clonado y la proteína ha sido analizada bioquímicamente (Busch y Fromm, 1999). Ensayos in vitro revelan que esta enzima es regulada negativamente por NAPH y ATP, lo que sugiere un débil feedback en la cantidad de sustrato entregado para la cadena respiratoria. Esto permitiría mantener estados definidos de GABA y posibilita la función de molécula señalizadora (Bouche y Fromm, 2004). • Regulación por glutamato descarboxilasa (GAD) Los primeros reportes de esta enzima sugieren que su actividad estaba regulada por la acidificación intracelular y como consecuencia la inducción de GABA. Esta observación se fundamentaba en reportes experimentales que indicaban que un aumento en H+ citosólicos precedía la acumulación de GABA. Datos in vitro e in vivo indicaban que una reducción en el pH citosólico activaba la actividad de GAD y la acumulación de GABA. Sin embargo, otras condiciones que no involucraban una acidificación estimulaban la actividad de GAD y la acumulación de GABA, por lo tanto otros mecanismos de activación estaban involucrados en esta respuesta. Ca2+ y CaM tienen una función crítica en la señalización en plantas y se encuentran involucradas en la regulación del crecimiento y en respuesta a cambios ambientales. Varias enzimas en plantas han sido identificadas como reguladas por Ca2+ y su molécula sensora calmodulina, entre las que se encuentra GAD, que cataliza la conversión de glutamato a GABA. Esta enzima esta presente en diversos mamíferos, levaduras y bacterias, pero sólo en plantas se ha identificado su regulación por CaM. La función de esta enzima y su regulación en plantas ha sido enriquecida por la clonación del gen que codifica GAD en petunia y la caracterización de la enzima codificante como una enzima Ca2+ calmodulina dependiente (CaM) binding protein (Baum et al., 1993). Esta unión Ca2+ CaM fue reportada al analizar extractos proteicos de soya (Snedden et al., 1995) y de A. thaliana (Shelp et al., 1999). La caracterización molecular de este dominio de unión a Ca2+ CaM y de una enzima recombinante permitió determinar la importancia de este dominio en la regulación enzimática. Estos reportes permiten explicar la rápida estimulación de la actividad de GAD en respuesta a situaciones de estrés que elicitan cambios en la concentración de Ca2+ citosólico. Esta hipótesis fue fundamentada por evidencias experimentales que muestran que la estimulación en la actividad de GAD en respuesta a diversos estrés están vinculados a respuesta a Ca2+ intracelular y no ha cambios en el pH intracelular, como demostraban las primeras evidencias (Aurisano et al., 1995). Recientemente, la estructura tridimencional de CaM unido a GAD de petunia ha sido determinada por resonancia magnética. Este estudio reporta que la activación de GAD por unión de CaM es requerido para el normal crecimiento de la planta a través de la regulación de GABA y su metabolismo. Por otro lado, la interacción de GAD con CaM en el dominio terminal induce la dimerización de la enzima, proceso involucrado en su activación por Ca2+ y la habilidad de CaM para activar dos moléculas de enzima simultáneamente (Yap et al., 2003). Además, el uso de plantas que expresan una enzima GAD silvestre o una GAD mutante sin el dominio de unión a CaM proporcionan evidencias in vivo de la importancia de esta unión para la regulación de GAD y su importancia en el desarrollo de la planta (Baum et al., 1996). Sin embargo, hay evidencias que muestran que algunas isoformas de GAD no poseen ese dominio de unión. Análisis in sílico del genoma de A. thaliana revelan la presencia de cinco genes codificantes de GAD. GAD1 y GAD2 presentan una distribución tejido específica, lo que podría indicar otra forma de regulación. Funciones de GABA en el desarrollo Estudios genéticos muestran que la modificación de las concentraciones de GABA puede provocar severas consecuencias en plantas. Plantas transgénicas de tabaco que expresan constitutivamente la enzima GAD activa, sin el dominio de unión a CaM que permite su regulación, generan altas concentraciones de GABA y una baja concentración de glutamato. Estas plantas presentan un fenotipo anormal en crecimiento y en desarrollo (Baum et al., 1996). Por otro lado, al analizar mutantes T-DNA knockout de A. thaliana del único gen de SSADH se reportó que estas plantas acumulaban altos niveles de ROS, revelando que el funcionamiento de la vía metabólica de GABA es esencial para el desarrollo normal de la planta, al menos en parte por suprimir la acumulación de especies reactivas de oxigeno bajo condiciones de estrés (Beuche et al., 2003). En estudios de Palanivelu y cols. (2003), la inactivación del gen que codifica para una GABA transaminasa provoca acumulación de altas concentraciones de GABA en flores de A. thaliana, aunque menos generalizado, en el resto de la planta. Al analizar este fenotipo resulta interesante la correlación entre esterilidad y contenido de GABA, debido a que estas mutantes pop2 producen muy pocas semillas. Esto demuestra que modificaciones en los niveles de GABA endógeno pueden afectar el desarrollo de todo el organismo. GABA como una molécula señalizadora en plantas La función potencial de GABA como molécula señalizadora fue propuesta en sus inicios por Snedden y Fromm (1999). Estos autores se basaron en las evidencias experimentales que reportaban importantes flujos de GABA inducidos por distintos tipos de estrés. Esta hipótesis permaneció de manera especulativa principalmente porque no se identificaban los receptores de esta molécula. Sin embargo, análisis de secuencias permitieron identificar receptores de glutamato en plantas, los que presentaban parte de la secuencia de un receptor de GABA descrito en animales en su región extracelular (Turano et al., 2002). La presencia de esta secuencia localizada antes de dos dominios teóricos de unión a glutamato en la región N terminal sugieren una función conjunta entre glutamato y GABA (Kang y Turano, 2003). Estos receptores estarían involucrados en el desarrollo de la planta mediante acción de glutamato y GABA, actuando vía canales de Ca2+ (Kang y Turano, 2003). Estos autores reportan que receptores de glutamato en plantas pueden regular el flujo de carbono y de nitrógeno en A. thaliana. • GABA y el crecimiento del tubo polínico En plantas con flores, el proceso de polinización se inicia cuando el polen (gametofito masculino) haploide es depositado sobre el pistilo. Posteriormente, el polen germina y gracias al crecimiento del tubo polínico a través del pistilo hacia el ovulo ocurre la fecundación. En la década pasada, varias señales fueron implicadas en este reconocimiento, incluyendo glicoproteínas, pequeños péptidos y polisacáridos, pero nada en relación a la molécula señalizadora que guía al tubo polínico al ovulo. La descripción de mutantes pop2 permitió determinar la importancia del GABA en el crecimiento del tubo polínico. Estas mutantes pop2 de Arabidopsis thaliana muestran un fenotipo de esterilidad debido a dificultades en la guía y el crecimiento del tubo polínico en el pistilo. Al analizar en gen mutado en pop2 se identificó una enzima del metabolismo de GABA conocida como GABA-T dependiente de piruvato. El gen pop2 codifica una transaminasa que degrada GABA, lo que permite regular los niveles de GABA del pistilo y del tubo polínico. En mutantes pop2, GABA se encuentra en altos niveles en las flores, lo que causa un defecto en el crecimiento del tubo polínico, en la guía y en la fertilidad. Esto sugiere que GABA influye en la estimulación del crecimiento, presenta una función inhibitoria a altas concentraciones en la elongación y es una molécula señalizadora que guía al tubo polínico, actuando junto a otras moléculas. Plantas silvestre muestran una concentración de GABA creciente entre el estigma y el septum, parte basal del pistilo, lo que permitiría un rápido crecimiento del tubo polínico. Ensayos in vivo sugieren que esta gradiente desde el estigma al micrópilo, abertura que conecta la célula femenina con los tejidos del pistilo, con mayores niveles en los tegumentos interiores de la flor, tiene una función en guiar el crecimiento del tubo polínico. Al comparar esta hipotética función señalizadora en plantas con la función neurotransmisora en neuronas maduras se pueden visualizar similitudes. GABA está involucrado en el desarrollo del sistema nervioso, promoviendo la migración neuronal, la proliferación y la diferenciación (Owens y Kriegstein, 2002). Este efecto esta mediado por la activación de receptores de GABA, los cuales provocan una despolarización de la membrana en el cerebro inmaduro donde, al contrario que en el cerebro adulto, GABA es un activador. GABA regula la diferenciación neuronal promoviendo el crecimiento de las neuritas, compuestas por un axón en crecimiento y una dendrita. El trabajo de Palanivelu y cols. establece un interesante paralelo entre el rol de GABA en el desarrollo del sistema nervioso central y en el crecimiento del tubo polínico en A. thaliana. Los niveles de GABA in situ en diferentes flores, determinado por anticuerpos anti GABA o por medición directa, aumentan en la región de crecimiento del tubo polínico en el pistilo (Palanivelu et al., 2002). Las concentración de GABA es de 20 mM en el estigma y mayor a 500mM en el tegumento interior de la célula, parte del ovulo y localizado cerca del saco embrionario, donde se encuentra la célula huevo. En mutantes pop2 la gradiente de GABA es modificada y todos los tejidos poseen una concentración de GABA similar; esto produce que el crecimiento del tubo polínico se detenga antes de llegar al ovulo y la fracción que llega al ovulo no fecunda a la célula correcta. Estas evidencias sugieren que la capacidad para degradar GABA es un factor importante que mantiene y guía el crecimiento del tubo polínico; esta actividad de pop2 (GABA-T) esta presente en el pistilo y en el tubo polínico. Aunque este trabajo muestra claramente la función de GABA en el desarrollo del tubo polínico, el mecanismo de acción de GABA todavía no ha sido determinado. El fenotipo mutante pop2 puede ser el resultado de cambios en los receptores de GABA o por una modificación en el metabolismo, como por ejemplo toxicidad por acumulación del metabolito. En neuronas, GABA es acumulado en la vesícula sináptica y liberado por exocitosis. El mecanismo de incorporación de GABA esta acoplado a un cotransportador de Na+ y mediado por un transportador de la familia de neurotransmisores (NTS). En cambio, en plantas no se ha detectado este mecanismo, ni proteínas homólogas para estos transportadores. Sin embargo, se han reportado posibles candidatos para el transporte de GABA, pertenecientes a una superfamilia transportadora de aminoácidos, de los cuales algunos se expresan en polen (Wipf et al., 2002). Heder y cols. (2003) reportaron que ratones transgénicos que sobreexpresan GABA específicamente en las neuronas (GnRH), provocan alteraciones en la migración de células, localizándose en zonas aberrantes en la corteza. Estas células, durante el desarrollo embrionario, se encuentran en su localización correcta en el hipotálamo. Esta similitud entre las neuronas GnRH y el tubo polínico en respuesta a GABA podría corresponder a mecanismos paralelos, los cuales involucran una molécula de señalización (GABA) y sus receptores (Bouché et al., 2003). • GABA como molécula señalizadora en raíces Beuve y cols. (2004) reportan la primera evidencia de GABA como molécula señalizadora de larga distancia en plantas en conjunto con un control negativo de glutamina. Estos autores estudiaron la relación entre el flujo de nitrógeno, la expresión de un transportador y la composición aminoacídica del floema durante etapas de bajos niveles de nitrógeno en Brassica napus. Reportes anteriores habían determinado que NO3 actuaba directamente en la vía de señalización local. Sin embargo, los componentes involucrados en esta señal no habían sido identificados. Estos autores sugieren que GABA no solo presenta una función como molécula de señalización intracelular (corta distancia), sino también como una molécula señalizadora de larga distancia entre distintos tejidos, la señal de raíz a brote en la regulación de la absorción de nitrato. Esta investigación reporta que GABA es una molécula translocada en el floema y su transporte intracelular esta asociado a dos transportadores de membrana constitutivos (Schwacke et al., 1999). Por otro lado, se reporta un alta correlación entre el contenido de GABA en el floema y cambios en el flujo de nitrato, observándose además que aplicaciones exógenas de GABA inducen un aumento en la expresión del transportador de nitrato. • Receptores del sistema de señalización de GABA El evento inicial de la activación de una vía de señalización celular es la unión de un ligando, como una hormona, a un receptor específico. En el sistema nervioso central de mamíferos, GABA es el principal neurotransmisor, que inhibe la sinapsis por unión a receptores localizados en la membrana. Se han descrito dos tipos de receptores presentes en el cerebro; receptores ionotrópicos (GABAa y GABAc) ligados a canales iónicos y receptores metatrópicos (GABAb) acoplados a proteínas. Los receptores de GABA también han sido identificados en otro tipo de tejidos, como corazón, hígado y ovario (Calver et al., 2000). La función de estos receptores estaría involucrada en la regulación de la secreción de hormonas por GABA (Gamel-Didelon et al., 2003). Esto indica que la molécula de GABA es una molécula señalizadora en el cerebro y otros tejidos. Los genes que codifican estos receptores poseen una alta homología entre animales, pero no han sido identificados en el genoma de Arabidopsis thaliana. Sin embargo, se ha reportado una familia proteica que interactúa con GABA (AtGLRs) en plantas (Lacombe et al., 2001). Estos receptores presentan una alta homología con receptores ionotrópicos de glutamato en animales (iGluRs). AtGLRs contiene segmentos de transmembrana y dos dominios extracelulares que hipotéticamente unen aminoácidos. Estos receptores están involucrados en la entrada de Ca+ a la célula cuando son estimulados por glutamato (Kang y Turano, 2003) o glicina (Dubos et al., 2003). Además, este receptor posee un dominio que une ligandos moduladores muy similares a GABA (Kinnersley y Lin, 2000), lo que permitiría sugerir que este receptor sería capaz de reconocer a GABA como molécula señalizadora. Además, moléculas antagonistas a receptores de GABA en animales presentan un efecto en el crecimiento de Lemma minor, sugiriendo la posible presencia de receptores de GABA en plantas (Kinnersley y Lin, 2000). Kang y Turano (2003) reportan que plantas transgénicas, que poseen uno de los receptores de glutamato suprimido por antisense, no regulan algunas enzimas involucradas en el balance de nitrógeno. GABA puede estar involucrada en el control de esta vía directamente por interacción con los receptores, sugiriendo una función señalizadora. La vía metabólica de síntesis de GABA es común a la mayoría de los organismos y su función como molécula señalizadora no esta restringida a las neuronas, como se había supuesto en los últimos cincuenta años. Por lo tanto, componentes del sistema señalización de GABA podrían estar presentes en un amplio rango de células, sugiriendo la posibilidad que la activación de la vía señalizadora de este aminoácido puede ser un mecanismo conservado en la mayoría de los organismos. En ese sentido, futuros estudios en su función señalizadora en plantas podrían vislumbrar su mecanismo de acción molecular y los componentes genéticos del sistema de señalización. La identificación de este mecanismo nos permitiría contestar la pregunta: ¿GABA en plantas, sólo un metabolito? y conocer la verdadera importancia de esta molécula en el desarrollo. Bibliografía 1. Aurisano, N., A. Bertani y R. Regianni. 1995. Involvement of calcium and calmodulin in protein and amino acid metabolism in rice roots under anoxia. Plant Cell Physiol. 36: 1525–1529 2. Baum G., S. Lev-Yadun, Y. Fridmann, T. Arazi, H. Katsnelson, M. Zik, y H. Fromm. 1996. Calmodulin binding to glutamate decarboxylase is required for regulation of glutamate and GABA metabolism and normal development in plants. EMBO J. 15: 2988–2996 3. Baum, G., Y. Chen, T. Arazi, H. Takatsuji y H. Fromm. 1993. A plant glutamate decarboxylase containing a calmodulin-binding domain. J. Biol. Chem. 268: 1961019617. 4. Beuché, N., B. Lacombe y H. Fromm. 2003. GABA signaling: a conserved and ubiquitous mechanism. Trends Cell Biol. 13: 607-610. 5. Beuve L.N., N. Rispail, P Laine, J.B. Cliquet, A. Ourry y E. 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