Contra defensa viral miARN y su rol en la supresión del silenciamiento mediado por ARN en plantas

Pontificia Universidad Católica de Chile Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Genética Molecular y Microbiología Laboratorio de Bioquímica Contra-defensa viral: siRNA y su rol en la supresión del silenciamiento génico mediado por virus en plantas Paola Canón Guidetti Junio, 2004 Introducción Silenciamiento génico : gen RNA proteína DNA evitando la expresión del gen (SGT) RNAevitando que sea traducido (SGPT) Silenciamiento a nivel del RNA • dsRNA formación de RNAs pequeños • este proceso se encuentra altamente conservado a lo largo de la evolución. ANIMALES: RNA de interferecia (RNAi) HONGOS: “quelling” PLANTAS: silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) Introducción REGULACIÓN DE GENES ENDÓGENOS: regulando la expresión diferencial de genes durante el desarrollo miRNA MECANISMO DE DEFENSA: eliminación de ácidos nucleicos extraños siRNA siRNA miRNA Introducción MECANISMO DE DEFENSA: eliminación de ácidos nucleicos extraños siRNA Cómo ocurre este mecanismo de defensa mediado por siRNA Modelo de silenciamiento génico post-transcripcional VIRUS Introducción ssRNA Silenciamiento del virus (RISC) Defensa Plasterak, R.H.A. (2002) Science 296:1263-1265 Modelo de silenciamiento génico post-transcripcional VIRUS Introducción ssRNA Silenciamiento del virus Amplificación de la señal de silenciamiento (RISC) Defensa Plasterak, R.H.A. (2002) Science 296:1263-1265 Introducción RNasa clase III ssRNA ATP DICER AMP+PPi 2 nts libres en 3’ : ATP QUINASA AMP+PPi RISC P P P Extremo 5’ fosforilado P Introducción siRNA * Presentan un apareamiento perfecto con su gen blanco * son generalmente de 21-24 nts * poseen un 2 nts libres en el extremo 3’ * luego del corte con DICER, se fosforilan en sus extremos 5’ * Al ser reconocidos por RISC, inducen el silenciamiento del gen blanco CONTRA-DEFENA viral VIRUS Supresores virales del silenciamiento génico Introducción Supresores virales del silenciamiento de RNA Introducción HC-Pro p19 Mecanismos de acción de supresores virales Introducción Chapman, E. y cols. Genes & Develop. 18:1174 (2004) Proteína p19 de Tombusvirus Proteína Cubierta p92 p41 RNAsg 1 Introducción Replicasas p33 Proteína Movimiento p19 p22 RNAsg 2 pX ? ssRNA + 4.8 kb ? Indispensable para la replicación RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) Microscopía electrónica de Tomato burshy stunt virus (TBSV) p19 suprime el silenciamiento mediado por siRNA Antecedentes 21nt CIP PNK p19 suprime el silenciamiento p19 une siRNA 21 nts in vivo (actividad supresora del silenciamiento) Plantas-P19  siRNAs de menos tamaño Plant Cell 2004, Dunoyer P. Estructura del “complejo” p19 2:siRNA Antecedentes P19 permitiría el acceso de una endonucleasa al extremo 3’ libre** nts que interactúan directamente con p19 Current Biology 14:R198 (2004) siRNA de 19 nts:romo inducen menor grado de silenciamiento Drosophila melanogaster Antecedentes 21 nts El tamaño óptimo del siRNA para inducir el silenciamiento es de 21 nts Los 2 nts libres en el extremo 3’son esenciales para la inducción del silenciamiento génico EMBO J 20: 6877 (2001) Antecedentes Considerando que... 1. 2. 3. p19 es un supresor del silenciamiento génico p19 genera siRNA de 19 nts in vivo siRNA de 19 nts son menos eficientes en inducir el silenciamiento en Drosophila RISC reconoce siRNA de 21 nts con extremos cohesivos Hipótesis p19 induce un corte del extremo 3’ libre (2nts) del siRNA para contrarrestar el PTGS mediante la interacción con nucleasas Hipótesis p19 induce un corte del extremo 3’ libre (2nts) del siRNA para contrarrestar el PTGS mediante la interacción con nucleasas TBSV ssRNA RdRp (viral o celular) Complejo RISC PAZ Silenciamiento del virus Hipótesis p19 induce un corte del extremo 3’ libre (2nts) del siRNA para contrarrestar el PTGS mediante la interacción con nucleasas TBSV ssRNA p19 ? ? RdRp (viral o celular) Complejo RISC PAZ Silenciamiento del virus Estrategia experimental 1. Evaluar si los siRNA de 19 nucleótidos de extremos romos son incapaces inducir el silenciamiento de un gen reportero en plantas a a b b siRNA GFP Estrategia experimental 2. Determinar si existen proteínas que interactúan con p19 • Ensayos de pull-down o inmunoprecipitación con anticuerpo anti-Tag, usando GST-p19 o p19-Tag, respectivamente. Ensayos con extractos celulares de plantas infectadas y no infectadas. Controles GST solo y anticuerpo inespecífico. Screening de una genoteca de expresión de Tomate o Nicotiana benthamiana, utilizando el supresor p19 marcado. • 3. Mediante herramientas bioinformáticas, poder establecer algún dominio funcional en la(s) proteína(s) encontradas, ojalá! posible dominio nucleasa 4. Utilizando sustratos sintéticos, probar la acción de la proteína X, y hacer ensayos funcionales, mutando la proteína y evaluando la inducción del silenciamiento.