Amplificación y diseminación de la señal de silenciamiento. Posible rol de una ARN polimerasa dependiente de ARN by sammyc2007

VIEWS: 97 PAGES: 12

									Pontificia Universidad Católica de Chile Facultad de Ciencias Biológicas Programa de Doctorado en Ciencias Biológicas Mención Genética Molecular y Microbiología

Seminario Departamental “Amplificación y diseminación de la señal de silenciamiento. Posible rol de RNA polimerasas dependientes de RNA”
Paulo Francisco Canessa Águila

Santiago, Junio 2004

Resumen
El proceso de silenciamiento génico mediado por RNAs pequeños en Caenorhabditis elegans es un proceso de carácter sistémico. Curiosamente, cuando el gusano es alimentado con bacterias que expresan el RNA de doble hebra (dsRNA) diseñado para silenciar un gen de interés, ya sea este endógeno o un transgen, absorbe dicho dsRNA en primera instancia a través del sistema digestivo, distribuyéndose a lo largo del nematodo e inclusive heredándolo a su progenie, mediando de esta forma el silenciamiento de dicho gen a lo largo del organismo de un modo sistémico, lo que no ocurre en Drosophila o mamíferos. El entendimiento del silenciamiento génico conocido como RNA interferente (RNAi) en C. elegans puede ser una ventana para la aplicación de esta técnica en terapias contra diversas patologías en humanos. Diversas líneas de evidencias sugieren que enzimas RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRPs) podrían estar relacionadas íntimamente al fenómeno de silenciamiento mencionado anteriormente. Tanto en plantas como en C. elegans, el silenciamiento inducido por dsRNA requiere de RNA polimerasas dependientes de RNA, las cuales podrían estar implicadas en la amplificación de la señal de silenciamiento y por consiguiente, en su diseminación. Según esto, distintos estudios han demostrado que siRNAs puede servir como partidores para la síntesis de dsRNA adicional por estas RNA polimerasas dependientes de RNA. Interesantemente, cuando el nemátodo es inyectado con RNA de hebra simple antisentido al mRNA que se desea silenciar, dependiendo del tejido específico en el cual se inyecte este RNA antisentido, se puede o no observar silenciamiento sistémico del mensajero blanco. Teniendo en cuenta una serie de datos experimentales que apuntan a la importancia de moléculas de RNA de doble hebra (dsRNA) para mediar silenciamiento génico mediante RNA interferente, entre los cuales se incluye una proteína de membrana transportadora de dsRNA, se propone analizar el efecto de la RNA polimerasa dependiente de RNA codificada en dos tipos celulares distintos sobre el fenómeno de RNA interferente que se observa en Caenorhabditis elegans.

Amplificación y diseminación de la señal de silenciamiento. Posible rol de RNA polimerasas dependientes de RNA.
El fenómeno de silenciamiento génico mediado por RNAs pequeños en Caenorhabditis elegans. Importancia de la amplificación.

El estudio de los RNA pequeños comenzó hace más de 10 años, en una investigación en donde se demostró que un gen conocido como lin-4, que controla el desarrollo larval en Caenorhabditis elegans, no codifica un producto génico proteico, sino que un RNA pequeño que media la represión de lin-14, fenómeno que conocemos hoy en día como RNA interferente o RNAi. Con el pasar del tiempo, estos RNAs pequeños fueron cobrando mayor importancia, descubriéndose funciones que incluyen proliferación y diferenciación celular, desarrollo de hojas y flores en plantas, desarrollo en animales e inclusive, roles en la regulación metabólica mediante al menos tres procesos que incluyen degradación del mRNA del gen a silenciar, represión traduccional del gen blanco y silenciamiento transcripcional mediando, por ejemplo, metilación de histonas a nivel de la cromatina (Bartel, 2004). El gran número de estudios hechos durante el último tiempo en este campo han permitido investigar este fenómeno en diversos organismos, esperándose para este año no menos de 2000 publicaciones asociadas a este tema (van Rij, 2004). Uno de los hechos más fascinantes del silenciamiento génico conocido como RNAi, es la alta eficiencia con que este proceso se lleva a cabo, dado que bastan pocas moléculas de RNA para gatillar el silenciamiento específico del producto génico de interés, silenciándose muchas veces dicho producto a lo largo del organismo de manera sistémica, como se ha observado en plantas y en C. elegans, organismo que inclusive adquiere el silenciamiento en la progenie (Nishikura, 2001). Dicho en otras palabras, si pocas moléculas de RNA producen silenciamiento y este adicionalmente es de carácter sistémico, debe existir necesariamente una amplificación de la señal que silencia. Visto de modo muy esquemático y de manera muy resumida, el proceso de silenciamiento génico mediado por micro RNAs (miRNAs) en metazoos se describe de la siguiente manera: un gen que codifica para el miRNA (de origen endógeno) es transcrito por alguna de las RNA polimerasas celulares, generándose un precursor de miRNA conocido como pri-miRNA (ver figura 1A), el cual es procesado y exportado hacia el citoplamasma como pre-miRNA. Este pre-miRNA es finalmente procesado por una enzima conocida como DICER, la que en última instancia genera un producto RNA de hebra simple (ssRNA), el cual al ser reclutado por un complejo proteico conocido como RISC, media la represión del gen blanco por alguno de los mecanismos mencionados anteriormente. En su contraparte, cuando el RNA que inicia el silenciamiento es exógeno (ver figura 1B), la enzima DICER procesa un RNA de doble hebra (dsRNA) de gran tamaño, generando un duplex siRNA (del inglés small interference) para finalmente y de manera análoga a lo descrito para los miRNAs, producir el silenciamiento génico mediante ssRNA unido a RISC (figura 1). Dado que el mecanismo de silenciamiento presenta una gran eficiencia, especificidad y se encuentra ampliamente conservado en distintas especies, un buen número de aplicaciones dirigidas a manejar exógenamente la expresión génica han sido desarrollados en el último tiempo. Existen hasta la fecha al menos cinco formas descritas para producir RNAi en C. elegans. El primero de estos métodos consiste en

inyectar directamente en cualquier parte del animal, dsRNA complementario al gen blanco a silenciar, observándose que el sitio escogido para la inyección no interfiere con el objetivo final de silenciar el gen blanco (Kamath, 2000). Adicionalmente, este organismo puede ser alimentado con bacterias manipuladas genéticamente para expresar el dsRNA necesario para inducir el silenciamiento génico, o simplemente suspendiendo el nemátodo en una solución que contenga el dsRNA en alta concentración. También es posible silenciar un gen de interés en C. elegans mediante transcripción in vivo del transgen que genere el dsRNA en el organismo, utilizando promotores tejido específicos (Timmons, 2003). Por último, también se ha observado que la inyección de RNA de hebra simple (ssRNA) es capaz de inducir silenciamiento génico (Tijsterman, 2002) cuando este RNA es antisentido. Gen miRNA dsRNA exógeno (transposón, virus, etc.))

dsRNA de gran tamaño

Núcleo Citoplasma Duplex siRNA

miRNA maduro asociado a RISC mRNA blanco no relacionado con miRNA

siRNA maduro asociado a RISC

FIGURA 1: Biogénesis de miRNAs y siRNAs. (A), Biogénesis de miRNA de metazoos y (B), biogénesis de siRNA animales. Adaptación de Cell (116), 281-297, 2004.

RNA polimerasas dependientes de RNA: enzima clave en la amplificación.

Un aspecto muy interesante del silenciamiento génico conocido como RNAi en C. elegans es la habilidad que posee este mecanismo de propagarse a lo largo del organismo. Este fenómeno de amplificación y diseminación de la señal de silenciamiento debe requerir de un sistema que permita primero, una estrategia molecular que permita amplificar la señal, y segundo, el paso de la señal de una célula a otra (Hannon, 2002). Respecto de la amplificación, las RdRPs juegan un rol fundamental. La existencia de RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRPs) ha sido un hecho de larga data en la historia de la biología molecular de más de 30 años. La mayoría de la información que se posee respecto de estas enzimas se debe a la existencia y estudio de virus que poseen como genoma RNA, codificando en éste RdRPs necesarias para iniciar el proceso infectivo en distintos tipos celulares. Sin embargo, la existencia de estas enzimas también ha sido demostrada en células no infectadas, lo que ha permitido distinguir RdRPs celulares (Ahlquish, 2002) de aquellas codificadas en genomas virales. Como se mencionó anteriormente, una de las formas de producir RNAi en C. elegans es mediante la introducción de dsRNA, de modo análogo a lo que ocurre por ejemplo, con infecciones virales como se esquematiza en la figura 1B. Aunque este proceso lleva consigo una amplificación de la señal de silenciamiento dado el hecho que el dsRNA es cortado en varios fragmentos de siRNA (a diferencia del modelo que se esquematiza en la figura 1A), el mecanismo por el cual se observa silenciamiento debe poseer de un sistema adicional de amplificación de dicha señal (Nishikura, 2001): puesto que pocas moléculas de dsRNA son capaces de silenciar un gran numero de copias de mRNA del gen blanco (hay que tener en cuenta que dicho silenciamiento puede ser inducido inyectando dsRNA en un tipo celular en particular y de todos modos, generar silenciamiento sistémico), una posibilidad que podría explicar el fenómeno observado consiste en un segundo método de amplificación de la señal que genera RNAi, puesto que el sólo clivaje del dsRNA en varios fragmentos de siRNA no es capaz de dar cuenta por si sólo de la gran amplitud de silenciamiento observado (Wei et. al., 2003), dado que la mayoría de los dsRNAs utilizados para gatillar RNAi en C. elegans son insuficientes (Sijen, 2001). Dentro de las RdRPs celulares, la mejor caracterizada hasta la fecha es la descrita en tomate. Esta enzima puede producir dsRNA de al menos unos 100 pares de bases (pb), tamaño que debe tenerse en mente para este trabajo. Este proceso puede ser llevado a cabo extendiendo partidores siRNA (o sin partidores) sobre templado RNA, generando de esta forma RNA de doble hebra, el cual es utilizado por la maquinaria de silenciamiento génico como ha sido expuesto (Ahlquish, 2002). En Drosophila se ha demostrado que el siRNA puede servir como molde para generar nuevamente dsRNA, el cual a su vez es nuevamente procesado para volver a producir siRNA de segunda generación, y así gatillar un fenómeno de amplificación de la señal de silenciamiento génico que sería dependiente de una RdRP, como se esquematiza en la figura 2. En dicha generación, el siRNA que sirve como partidor para la polimerasa mencionada, requiere que el 3´ OH esté lo suficientemente íntegro y libre para llevar a cabo el proceso de formación de dsRNA a partir de siRNA, haciendo posible el RNA de interferencia. Dicho de otro modo, la RdRP al generar dsRNA a partir de mRNA o siRNA puede explicar en parte el potencial subestequeométrico de silenciamiento que poseen los dsRNA en distintos organismos (Wei et. al., 2003).

La actividad de RdRP descrita en tomate cofracciona con una proteína de 127 kD, careciendo de homología con otras proteínas de función conocida, incluyendo RdRP codificadas por virus, RNA polimerasas, DNA polimerasas y transcriptasas reversas (Keck et. al., 2000). Interesantemente, homólogos de la RdRP de tomate no sólo ha sido encontrada en Arabidopsis y en otras plantas, sino que también en Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe (Ahlquish, 2002), Dictyostelium (Wei et. al., 2003) y en C. elegans.

FIGURA 2: Modelo de RNAi, en donde se describen distintos modos de acción del mecanismo de amplificación de la señal de silenciamiento mediada por RdRP. (A), modelo tradicional de RNAi, en donde siRNA puede servir como molde para amplificar el mRNA blanco (se omite la interacción de siRNA con RISC). (B), RdRP genera nuevos dsRNA, los cuales son nuevamente procesados por DICER, generando siRNA que vuelven a alimentar el ciclo. (C), replicación del dsRNA que comienza la reacción de silenciamiento (trigger dsRNA) o del nuevo dsRNA podría estar alimentando el sistema, generando en última instancia nuevos siRNA. Sin embargo, la importancia in vivo de este último mecanismo no ha sido planteada. Figura tomada de Cell (107), 415 – 418, 2001.

Lo que se conoce respecto de las RdRPs que han sido caracterizadas en C. elegans se debe principalmente a estudios realizados en donde se han caracterizado 4 RdRPs hipotéticas presentes en el genoma del organismo (no se han aislado las proteínas), para las cuales sólo se tienen evidencias indirectas de su actividad RNA polimerasa dependiente de RNA, puesto que no han sido purificadas y caracterizadas bioquímicamente hablando (Smardon, et al., 2000). Estas enzimas son conocidas como RRF1, RRF2, RRF3 y EGO1. El gen rrf1 es absolutamente requerido para RNAi, RNA transitivo y para la respuesta de silenciamiento frente a la inyección de siRNA. EGO1, por su parte, se expresa en tejido de línea germinal y su deleción en estos organismos es letal (Sijen, 2001), requiriéndose para observar RNAi en dicho tejido (Tijsterman, 2002). Interesantemente, estas RdRPs serían capaces de sintentizar

fragmentos con pequeños moldes de RNA (Sijen, 2001).

Naturaleza móvil de la señal de silenciamiento génico mediada por dsRNA en C. elegans.

El fenómeno de diseminación de la señal de silenciamiento observado tanto en C. elegans como en plantas implica una situación bastante obvia, pero no por eso menos interesante: cuando el animal es alimentado con bacterias que expresan un dsRNA que permite reprimir la expresión de un gen blanco del organismo (endógeno o exógeno), este dsRNA debe ser absorbido por el tracto digestivo de este nemátodo y consiguientemente, la señal que permite silenciar en todo el organismo debe salir de esas células en particular hacia el espacio extracelular, repitiéndose un ciclo de entrada y salida hasta completar el organismo en su totalidad. El dsRNA que es llevado al espacio extracelular puede desencadenar respuestas RNAi sistémicas en un gran numero de organismos, plantas, cnidarios, planarias y coleópteros, (Timmons, 2003). Interesantemente, los mecanismos moleculares que subyacen a la naturaleza móvil del RNA son desconocidos, aunque se ha descrito entrada de dsRNA a células que llevan a cabo silenciamiento génico mediando RNAi, no se ha probado fehacientemente la existencia de salida de dsRNA desde células animales (Timmons, 2003). En el proceso de incorporación de dsRNA, la proteína SID1 juega un rol fundamental, siendo indispensable para el silenciamiento génico que se observa en C. elegans, presentando homólogos en nemátodos, humanos y ratón. Se expresa en los tejidos sensibles a RNAi, encontrándose en la periferia de las células. En los primeros experimentos realizados con esta proteína y mutando sid1, los autores demostraron que la señal de silenciamiento no se puede diseminar desde el intestino hacia las gónadas. Los resultados obtenidos sugirieron que SID1 es requerida para la importación del dsRNA, pero no demuestran que dicha proteína esta vinculada al proceso de exportación de dicha molécula (Winston et. al., 2002). Posteriormente, el mismo laboratorio demostró que SID1 es una proteína de membrana como era de esperar, que contiene 11 segmentos transmembrana y que cuando sid1 es transfectado en células S2 de Drosophila, estas pueden mediar RNAi cuando son incubadas con dsRNA (hecho que no se observa en células wild type) del mismo modo como ocurre naturalmente en C. elegans. Interesantemente, el tamaño del dsRNA utilizado es fundamental para observar RNAi, requiriéndose un mínimo de 100 pares de bases de dsRNA y no ssRNA, puesto que esta última molécula no gatilla RNAi en células S2 transformadas con sid1 (Feinberg y Hunter, 2003).

Antecedentes
Los antecedentes que serán utilizados para formular la hipótesis que se planteará en este trabajo son los siguientes:

Antecedente 1: Mediante el análisis de los siRNAs producidos durante el fenómeno de RNAi en C. elegans, se comprobó que una importante fracción de los siRNAs no provenían directamente de la inyección inicial de dsRNA, siendo una prueba de la característica catalítica que muestra el proceso en este organismo. Una población de siRNA secundarios parece derivar de la acción de una RdRP celular que posee una acción sobre el mRNA que es blanco del mecanismo de RNAi. Los autores, para caracterizar la población de siRNAs presentes en C. elegans, realizaron un ensayo de protección a RNAsa utilizando 32P-ssRNA como sonda sobre RNA celular. Adicionalmente, para comprobar que los siRNAs secundarios son capaces de llevar a cabo el fenómeno de RNAi, los autores realizan ensayos de RNAi transitivo (Sijen, 2001), demostrando la generación de siRNAs secundarios que gatillan silenciamiento. Conclusión: estos datos permiten suponer la presencia de RdRPs celulares que produzcan siRNAs secundarios, que median silenciamiento génico por RNAi transitivo, teniendo en cuenta las cuatro RdRPs hipotéticas presentes en C. elegans como ha sido descrito.

Antecedente 2: Hasta la fecha, la posibilidad de vincular a una RdRP en el fenómeno de silenciamiento génico mediado por RNAs pequeños es validada por el aislamiento de actividad RdRP celular endógena en tomates, como ya ha sido mencionado. Puesto que C. elegans posee 4 hipotéticas RdRPs, los autores mencionados en el antecedente 1 decidieron analizar la formación de siRNAs secundarios en animales mutantes nulos para las hipotéticas RdRPs celulares mencionadas. Una de estas mutantes nulas (rrf-1 -/-), no mostró presencia de dichos siRNAs. Se ha observado que en C. elegans, la inyección de siRNA (sintetizado de manera exógena) directamente en una célula, es capaz de llevar a cabo el proceso de silenciamiento conocido como RNAi de manera sistémica. La inyección de siRNA en animales rrf-1 -/- (que no expresan la proteína) demostró el no silenciamiento por siRNAs preformados, inclusive inyectando concentraciones 10 veces superiores a las que gatillan RNAi en animales wild type (Sijen, 2001). Conclusión: la insensibilidad mostrada por los mutantes en rrf-1 sugiere que la reacción inicial siRNA/mRNA blanco es insuficiente para producir un efecto fenotípico en el animal, lo que sugiere a su vez un rol para los siRNAs secundarios, los que serían producidos por una actividad RNA polimerasa dependiente de RNA.

Antecedente 3: Como se mencionó anteriormente, C. elegans tiene la habilidad de incorporar dsRNA desde el medio extracelular a través de la proteína SID1, para mediar RNAi. Experimentos realizados han permitido definir que el mecanismo óptimamente ocurre cuando las células son incubadas con dsRNA de al menos 100 pares de bases (Feinberg, 2003). Estos datos han permitido afirmar que el organismo incorpora dsRNA, pero hasta hoy en día se desconoce el mecanismo de transmisión de la información de silenciamiento desde las células que han incorporado dsRNA hacia otras células, mediando de esa forma el fenómeno de RNA interferente.

Conclusión: dado que el organismo posee la capacidad de incorporar dsRNA y no ssRNA de un tamaño medianamente definido y aunque no se ha demostrado fehacientemente un mecanismo de salida de dsRNA desde la célula hacia el espacio extracelular, si la entrada de dsRNA vía SID1 explica en parte la característica de dispersión del fenómeno interferente mediado por RNAs pequeños en este organismo, la célula que entrega la señal de diseminación debe poseer algún sistema que le permita proporcionar dicha información, la que es captada como dsRNA. En palabras simples, si la célula capta dsRNA, alguien tiene que entregarle dsRNA.

Antecedente 4: Por último, Tijsterman y colaboradores (Science 295, 694 – 697, 2002) demostraron que cuando gónadas de C. elegans que expresan proteína fluorescente verde (GFP) tanto a nivel somático como gonadal son inyectados con RNA de hebra simple (ssRNA) complementario al mRNA de GFP en la gónada, se media RNA interferente sólo a nivel gonadal no mediando este ssRNA silenciamiento sistémico en este caso particular, aunque se expresa la RdRP EGO1. En contraparte, cuando ssRNA es inyectado para silenciar unc22, un gen de expresión exclusivamente somática, es posible observar silenciamiento génico sistémico (a lo largo del organismo, no incluyendo las gónadas), aunque a un nivel inferior al observado con la inyección de dsRNA para silenciar el mismo gen.

Antecedente 5: Mediante diversos estudios genéticos, se han logrado identificar genes que están asociados a la propagación de la señal de silenciamiento (Matthew et. al., 2003). Interesantemente, la naturaleza sistémica del RNAi en C. elegans es completamente funcional en animales mutantes para el gen rde4, aunque estos animales no producen siRNAs eficientemente (Grishok et. al., 2000; Parrish y Fire, 2001). Estos datos sugieren que el siRNA no es requerido para en RNAi sistémico y tangencialmente, apoyan la importancia de dsRNA como la molécula involucrada. Puesto que se ha descrito que la RNA polimerasa dependiente de RNA sería capaz de sintetizar nuevos dsRNAs (con la consiguiente formación de siRNAs) de al menos 100 pares de bases (Ahlquist, 2002) y teniendo en cuenta los antecedentes presentados en conjunto, cabe preguntarse si existirán diferencias funcionales en la hipotéticas RdRPs que se expresan diferencialmente dependiendo del tejido de C.

elegans (EGO1 se expresa en línea germinal, mientras RRF1 se expresa a nivel somático) que pudieran dar cuenta de las diferencias observadas frente a la inyección de ssRNA antisentido en gónadas versus una célula somática en el organismo.

La hipótesis de trabajo es la siguiente:

“Diferencias funcionales entre EGO1 y RRF1, RdRPs de expresión tejido específica, dan cuenta de la característica sistémica diferencial del fenómeno de RNA interferente mediado por ssRNA antisentido”
Objetivo general: Determinar si la expresión tejido específica de EGO1 en tejido reproductivo y de RRF1 en células somáticas puede dar cuenta de las diferencias observadas frente a la inyección de ssRNA antisentido en gónadas versus una célula somática en el organismo.

Metodología
Objetivo específico 1: efecto de la RdRP expresada en células de la línea germinal. Para determinar el efecto de EGO1 en células de la línea germinal, lo más simple sería mutar dicho gen en C. elegans, observando el fenotipo RNAi al inyectar en estas células dsRNA, siRNA y ssRNA antisentido. El problema de realizar esto queda ejemplificado en observaciones previas hechas por diversos autores: animales mutantes ego1 presentan gónadas anormales, siendo un gen esencial para generar animales sanos (Sijen, 2001). Puesto que se propone que la inyección de ssRNA antisentido en gónadas y en células somáticas genera un efecto distinto producto de la RdRP que se expresa, para analizar el papel que EGO1 y RRF1 pueden generar en dicho fenómeno, se podrían producir C. elegans transgénicos que expresen las hipotéticas RdRPs señaladas anteriormente de manera invertida: EGO1 a nivel somático y RRF1 a nivel de la línea germinal. Esperando que la actividad EGO1 wild type sea suplida por RRF1 (generándose animales sanos), evaluaría la actividad RNAi de células germinales y somáticas frente a la inyección de ssRNA antisentido utilizando como reporteros los genes mencionados en el antecedente 4, anteriormente explicado.

Objetivo específico 2: determinar el tamaño de los siRNAs secundarios producidos en células reproductivas wild type y aquellas que expresan RRF1. Para determinar la producción y el tamaño de los siRNAs secundarios que se producen en células de la línea germinal, realizaría experimentos de protección a RNAsa. Utilizando distintas sondas ssRNA sentido, identificaría los productos siRNAs formados de manera secundaria por la RdRP en línea germinal, de acuerdo a lo descrito por Nishikura et. al. Comparando el tamaño promedio de los siRNAs obtenidos cuando estas células expresan la RdRP wild type o RRF1, podría inferir efectos de estas enzimas en el tamaño del siRNA secundario que se genera en cado caso. De obtenerse tamaños notablemente distintos a 100 pb, el fenómeno observado podría ser explicado argumentando en parte problemas de tamaño.

Objetivo específico 3: determinar si la característica de silenciamiento sistémico mediado por RRF1 en C. elegans, puede ser reemplazado por la RdRP caracterizada de tomate. Para esto, animales mutantes para RRF1 pueden ser transformados con un vector de expresión que contenga la secuencia que codifica para la RdRP de tomate, viendo que esta enzima es capaz de rescatar las células que han perdido el fenómeno de RNAi al carecer de RRF1. De mediarse RNAi sistémico, estos resultados podrían entregar nuevos antecedentes respecto de la universalidad del fenómeno de silenciamiento. Esto sería una nueva evidencia sobre el requerimiento de RdRP para mediar silenciamiento. Paralelamente, se podría analizar el efecto de expresar esta enzima de manera tejido específica en células de la línea germinal, de forma análoga a lo que se propone en el objetivo específico 1.

Bibliografía
Ahlquist, P., Science (296), 1270 - 1273, 2002. “RNA-Dependent RNA Polymerases, Viruses, and RNA Silencing”. Bartel, D. Cell (116), 281 – 297, 2004. “MicroRNAs: Genomics, Biogénesis, Mechanism and Function”. Feinberg, E. y Hunter, C.P. Science (301), 1545 – 1547, 2003. “Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1”. Grishock, A., et. al. Science (287), 806 – 811, 2000. “Genetic requirements for inheritance of RNAi en C. elegans”. Hannon, G. Nature (418), 244 - 251, 2002. “RNA interference”. Kamath, R. et. al. Genome Biology 2 (1) 1 - 10, 2000. “Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”. Keck, J., et. al. Science (287), 2482, 2000. “Structure of the RNA Polymerase Domain of E. coli Primase”. Matthew N., et.al. RNA (9) 25-32, 2003. “Gene silencing in Caenorhabditis elegans by Transitive RNA Interference”. Nishikura, K. Cell (107), 415 – 418, 2001. “A Short Primer on RNAi: RNA-Directed RNA Polymerase Acts as a Key Catalyst”. Parrish, S., y Fire, A. RNA (7), 1397 – 1402, 2001. “Distincr roles for RDE-1 and RDE-4 during RNA interference in Caenorhabditis elegans. Sijen, T., et. al. Cell (107), 465 – 476 , 2001. “On the Role of RNA Amplification in dsRNA-Triggered Gene Silencing”. Tijsterman, M. Science (295), 694 – 697, 2002. “RNA Helicase MUT-14 - Dependent Gene Silencing Triggered in C. elegans by Short Antisense RNAs”. Timmons, L., et. al. Molecular Biology of the Cell (14), 2972–2983, 2003 “Inducible Systemic RNA Silencing in Caenorhabditis elegans”. van Rij, R y Andino, R. Science (303), 1978 - 1979, 2004. “Enjoy the Silence”. Wei, Q. et. al. Methods (30), 337 – 347, 2003. “Analysis of the 3-hydroxyl group in Drosophila siRNA function ” Winston, W. et. al. Science (295): 2456-2459, 2002. “Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1”.


								
To top