FORMACIÓN DE PORO EN MEMBRANA CELULAR POR MEDIO DE by oyn14092

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									              UNIVERSITAS SCIENTIARUM
              Revista de la Facultad de Ciencias                             Julio-diciembre de 2004
              PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA                                         Vol. 9, No. 2, 43-48




    FORMACIÓN DE PORO EN MEMBRANA CELULAR POR
       MEDIO DE LA PEQUEÑA GLICOPROTEÍNA DE
        SECRECIÓN DEL VIRUS DE EBOLA ZAIRE

               Nury EsperanzaVargas-Alejo1; Clara Andrea Rincón-Cortés1;
                            Edgar Antonio Reyes-Montaño2
          1
            Facultad de Ciencias y Educación, Proyecto Curricular de Licenciatura en Química,
              KR 3 N° 26-40, Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Bogotá D.C.
2
    Facultad de Ciencias, Departamento de Bioquímica y Nutrición, Grupo de Investigación Bioquímica
                     Computacional y Estructural, Pontificia Universidad Javeriana
                                     Cra. 7ª N° 42-27, Bogotá D.C.
                          ereyes@javeriana.edu.co; rinconc@javeriana.edu.co


RESUMEN
Uno de los patógenos capaces de inducir fiebres hemorrágicas es el virus de Ebola, clasificado en la
familia filoviridae con cuatro subtipos, de los cuales el más analizado es el subtipo de Ebola Zaire,
identificando en su genoma siete proteínas estructurales y una de secreción denominada pequeña
glicoproteína de secreción del virus de Ebola Zaire.
Utilizando las herramientas de bioinformática y los diferentes estudios realizados al virus de Ebola Zaire
a escala estructural y funcional, se logró predecir la estructura terciaria de su pequeña glicoproteína de
secreción (SSGP EBO-Z). Basados en esta estructura se generó un posible modelo del mecanismo de
entrada del virus de Ebola Zaire a la célula huésped, donde juegan un papel importante los receptores y
ligandos de la membrana celular; permitiendo a la vez explicar los daños patológicos encontrados en los
pacientes.
Palabras clave: bioinformática, célula, estructura, glicoproteína, ligando, proteína, receptores, virus

ABSTRACT
One of the pathogens able to produce haemorrhagic fevers is Ebola virus, classified in the Filovirideae
family, which has four sub-types, the most analyzed of which is the Zaire sub-type. The genome of this
virus contains the information of seven structural proteins and one non-structural glycoprotein called
Small Secretion Glycoprotein of the Ebola Zaire virus (SSGP). Using bioinformatic tools and previous
studies about the Ebola virus, we predicted the tertiary structure of the small secretion glycoprotein (SSGP
EBO-Z), and based on that, we generated a model to explain the mechanism by which the virus enters host
cells, where receptors of the cell surface play an important role. This provided an explanation for the
symptoms and pathological damage found in patients.
Key words: bioinformatics, cell, glycoprotein, protein, receivers, structure, tiing, virus



INTRODUCCIÓN                                            es el virus de Ebola (EBO); clasificado en
                                                        la familia Filoviridae, con un solo género
Las fiebres hemorrágicas son producidas                 Filovirus, perteneciente al orden
por varios patógenos virales, uno de estos              Mononegaviral. De este virus se han esta-


                                                                                                        43
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blecido cuatro subespecies: Ebola Sudan,         AAC57990. Una vez obtenida la secuencia
Ebola Reston, Ebola Zaire y Ebola Tai            correspondiente de la SSGP-EBOZ realizar
(Caddell et al., 1997).                          el alineamiento por medio de BLASTP,
                                                 determinando las secuencias de aminoácidos
Estos virus producen una enfermedad que          proteínas con mayor similaridad a SSGP-
se ha encontrado en humanos y primates,          EBOZ. Posteriormente con base a los resul-
presentando una mortalidad entre el 50 y         tados obtenidos en BLASTP predecir
90% de las personas infectadas (Volchkov         características estructurales como el peso
et al., 1998).                                   molecular, punto isoeléctrico, péptido se-
                                                 ñal, su comportamiento hidrofóbico y ac-
El genoma del virus de Ebola consiste en         cesible y los motivos funcionales (Print
una cadena negativa de RNA simple no             y Block) tanto para la SSGP-EBOZ como
segmentada (NNS-RNA) no poliadenilada,           para sus proteínas similares determinadas
con un arreglo lineal de genes y con ocu-        anteriormente, por medio de Expasy y
rrencia de solapamientos. El orden del           Motif respectivamente, seleccionando las
genoma es: 3’-región sin traducir,               proteínas con mayor similaridad a la SSGP-
Nucleoproteína (NP), Proteína Viral estruc-      EBOZ.
tural VP35, VP40, Glicoproteína (GP), VP30,
VP24, Polimerasa L, 5’- región sin traducir.     Posteriormente con ayuda de las proteínas
Con respecto a su GP, se caracteriza por ser     más similares al SSGP-EBOZ, predecir su
una proteína de superficie, sintetizada          estructura tridimensional, identificando los
como una molécula precursora que está            dominios que posean interacciones con los
unida a dos subunidades, la GP1 y la GP2         receptores de membrana celular, y así ge-
probablemente asociadas por enlace               nerar y/o plantear un posible mecanismo
disulfuro, su gen es el cuarto (de siete) pre-   de entrada y posterior infección del virus
sentando dos marcos abiertos de lectura          Ebola - Zaire a la célula huésped, destacan-
(ORFs); el cual produce una proteína de          do el papel de la SSGP-EBOZ.
secreción, denominándose “Pequeña
Glicoproteína de Secreción no Estructural        RESULTADOS Y DISCUSIÓN
del virus de Ebola (SSGP)” reportada por
Sánchez con el número accession                  La secuencia usada de la Pequeña
AAC57990 (Sánchez et al., 1998).                 Glicoproteína de Secreción del Virus de
                                                 Ebola Zaire en está investigación es la re-
La estructura secundaria y posible función       portada por Anthony Sánchez, la cual cons-
de la SSGP se logró establecer en el año de      ta de 364 aminoácidos, identificando el
1999 cuando Reyes y Lareo de la Pontificia       péptido señal, para obtener la proteína ma-
Universidad Javeriana de Colombia                dura que consta de 338 aminoácidos, con
utilizaron las herramientas de Biología          un peso molecular de 38KDa, un punto
Molecular Computacional, para la identi-         isoeléctrico de 8,98 y mostrando diferen-
ficación de las características de la SSGP.      tes comportamientos de hidrofobicidad y
                                                 accesibilidad a lo largo de su estructura.
METODOLOGÍA
                                                 El siguiente paso fue la determinación de
Una de las necesidades primordiales para         bloques y prints, posteriormente se realizó
el desarrollo de este trabajo es hallar la se-   una selección de las proteínas con mayor
cuencia de aminoácidos o estructura pri-         similaridad a SSGP-EBO-Z, teniendo en
maria de la SSGP-EBOZ, la cual se obtiene        cuenta, la cantidad de aminoácidos, pe-
por medio de su código de accession              sos moleculares, puntos isoeléctrico,


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hidrofobicidad, accesibilidad, alineamiento      2. Formación del complejo CTLA-4, el
en Laling, bloques y dominios de cada una           cual desvía e inhibe la respuesta inmu-
de las proteínas.                                   ne de la célula huésped.

En el diseño de la posible estructura            3. Interacción de los dominios de integrina
tridimensional de la SSGP EBO-Z se reali-           con los receptores de la membrana ce-
zó con la búsqueda de la estructura                 lular permitiendo la desestabilización
tridimensional de cada uno de los segmen-           de la laminina.
tos más similares por medio de Swiss
                                                 4. Perforación de la membrana celular por
Model. Posteriormente se realizaron mu-
                                                    parte del dominio de citolisina.
taciones correspondientes a cada uno de
estos segmentos a través de SwisPDB-             5. Una vez abierto el poro se permite la
Viwer, en el cual también se logró unir             entrada del virus y la fácil movilización
cada segmento hasta obtener la estructura           dentro de la célula por la desestabiliza-
tridimensional de la SSGP EBO-Z comple-             ción de la laminina.
ta (figura 1).
                                                 6. Activación del factor de crecimiento
Teniendo como base la posible estructura            endotelial, y posterior cierre del poro
tridimensional (3D) de SSGP EBO-Z, se               por parte del dominio de desintegrina.
puede observar cómo se conservan las pro-
piedades de accesibilidad e hidrofobicidad       7. Llegada del virus al sitio de replicación
confirmándose en la estructura 3D ya que            uniéndose al RNA mensajero del hués-
en esta región se observan hélices alfa ex-         ped por interacción con los extremos
plicando este comportamiento. Mientras              cohesivos.
que los aminoácidos más accesibles son
                                                 8. Se producen varias copias del virus, el
predominantemente expuestas al medio,
                                                    cual utiliza la membrana celular del
confirmándose que su estructura 3D es prin-
                                                    huésped para poder infectar otras célu-
cipalmente en los extremos hojas beta y
                                                    las sin ser atacado por el sistema in-
Vueltas al Azar. Reafirmándose la predic-
                                                    mune del huésped, ayudado por las
ción de la estructura secundaria, donde la
                                                    interacciones celulares en el tejido.
mayor parte de las secuencias tiene tenden-
cia a hojas beta y en la parte central hélices   9. Separación celular por medio del descen-
alfa (Reyes et al., 1999).                          so en el nivel de cadherina y grave daño
                                                    al tejido, debido a la alteración de los
Con base en la posible estructura 3D de             receptores celulares modificando así el
SSGP EBO-Z se puede predecir un me-                 mecanismo de coagulación sanguínea.
canismo de entrada del virus de Ebola
Zaire a célula huésped mediado por esta          10.Manifestaciones clínicas. Reflejándo-
glicoproteína, debido a que en su estructu-         se con hemorragia, fiebre, epidermolosis
ra se presentan varios dominios o seg-              ampollosa, daño hepático, renal,
mentos que ayudan al mecanismo de la                vascular y en la retina ocular, debido a
interacción con membrana, los cuales son            la separación celular en los tejidos.
(figura 2):
                                                 Según las funciones establecidas para cada
1. Reconocimiento, unión al receptor de          dominio presente en la posible estructura
   la matriz extracelular e inactactivación      tridimensional de SSGP EBO-Z se puede
   del factor de crecimiento endotelial por      comprobar su acción: como desintegrina
   parte del dominio de desintegrina.            al separar las células entre sí, como una


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citolisina al encontrar células “fantasmas”          Relations. follows; McPheat;
y espacios sin ninguna célula en un campo            Minshull; Moore; Pauptit; Rowsell;
visual (foto 1), su acción sobre cualquier           Stacey; Stanway; Taylor and Abbott.
tipo de célula sin ser específica (Reyes et          Biochemistry Journal, 359: 427-434.
al., 1999), puede interactuar con el sistema
inmune a un nivel celular y humoral, don-        REYES, E.; LAREO L. 1999. Predicción de es-
de los anticuerpos de alta afinidad son diri-        tructura y función de la pequeña
gidos contra la porción NH2-Terminal de la           glicoproteína de secreción del virus
GP (Sánchez et al., 1996).                           de Ebola. Tesis de maestría. Pontificia
                                                     Universidad Javeriana, Bogotá, Co-
CONCLUSIÓN                                           lombia.

Cada uno de los dominios pertenecientes a        SÁNCHEZ, K.; HOLLOWAY, A. 1993. Sequence
la estructura tridimensional de la SSGP              analysis of the Ebola virus Genome:
EBO-Z, desempeñan conjuntamente fun-                 Organization, genetic elements and
ciones específicas que permiten la entrada           comparison with the genome of
del virus a la célula huésped y la poste-            Marburg virus. Virus res. 2: 215-240.
rior infección ya que funcionan como
                                                 SÁNCHEZ, A.; KILEY, M.; HOLLOWAY, B.; AUPERIN,
integrinas, citolisinas, desintegrina, factor
                                                     D. 1998. Sequence analysis of the
de crecimiento y su capacidad de formar
                                                     Ebola virus genome: organization,
un complejo con los linfocitos citotóxicos
                                                     genetic elements, and comparison with
T, por lo cual las manifestaciones clínicas
                                                     the genome of Marburg virus. Virus
debido a la infección por este virus pueden
                                                     Research. 29: 215-240.
ser ocasionadas por su proteína de secre-
ción.                                            SÁNCHEZ, A.; YANG, Z.; XU, L.; NABEL, G.;
                                                     CREWS, T.; PETERS, C. 1998. Biochemical
AGRADECIMIENTOS                                      Analysis of the Secreted and Virion
                                                     Glycoproteins of Ebola Virus. Journal
A Leonardo Lareo, por la colaboración pres-
                                                     of Virology. 72: 6442-6447.
tada durante el desarrollo del trabado, igual-
mente el grupo de investigación Bioquímica       VOLCHKOV, V.; SLENCZKA, K. 1998. Processing
Estructural Computacional y Bioinformá-              of the Ebola virus glycoprotein by the
tica de la Facultad de Ciencias, Pontificia          proprotein convertase furiu. Proc Natl
Universidad Javeriana, por su interés fren-          Acad Sci USA 95: 5762-5767.
te al tema, por último al proyecto curricular
de Licenciatura en Química de la Facultad        VOLCHKOV, V.; VOLCHKOVA, V.; SLENCZKA, W.;
de Ciencias y Educación, por capacitarnos            KLENK, H.; FELDMANN, H. 1998. Release
y llevar a cabo este trabajo en la Universi-         of Viral Glycoproteins during Ebola
dad Distrital Francisco José de Caldas.              Virus Infection. Virology. Volumen.
                                                     245: 110-119.
LITERATURA CITADA
                                                 Recibido: 17-09-2004
CADDELL, A. 1997. Ebola WHO Press Release.       Aceptado: 18-08-2004
    Heslth Communications and Public




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                                                      F I G U R A 1. Primera estructura
                                                      tridimensional propuesta de la
                                                      SSGP EBO-Z.
                                                      Color negro indica las hojas beta,
                                                      color gris las hélices alfa, gris y ne-
                                                      gro intercalado indican las vueltas
                                                      al azar




     A. Acción del dominio de desintegrina.      B. Formación del complejo CTLA-4.




     C. Acción del dominio de integrina         D. Acción de la citolisina.
                    E. Entrada del virus Ebola Zaire a la célula huésped.


FIGURA 2. Mecanismo de entrada del virus de Ebola Zaire a célula huésped, mediado
por la SSGP BO-Z.


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FOTO 1. Acción sobre la SSGP EBO-Z sobre cultivos celulares En la foto se muestra cultivo
celular VERO, procedente de riñón mono verde africano. Izquierda se observa un cultivo
celular sin la expresión de la proteína y a la derecha el efecto producido por la proteína en
el cultivo. (Reyes et al., 1999).




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