MINISTERO DELL'UNIVERSITE DELLA

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MINISTERO DELL'UNIVERSITE DELLA Powered By Docstoc
					       MINISTERO DELL'UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA SCIENTIFICA E TE CNOLOGICA
                         DIPARTIMENTO AFFARI ECONOMICI
        PROGRAMMI DI RICERCA SCIENTIFICA DI RILEVANTE INTERESSE NAZIO NALE
                          RICHIESTA DI COFINANZIAMENTO
                             (DM n. 811 del 3 dicembre 1998)
                   PROGETTO DI UNA UNITÀ DI RICERCA - MODELLO B
                            Anno 1999 - prot. 9906185558_003
                                                Parte: I1.1 Programma di Ricerca di tipo: interuniversitario
                                                Area Scientifico Disciplinare: Scienze Mediche (98%)
                                                        Area Scientifico Disciplinare: Scienze Biologiche (1%)
                                               Area Scientifico Disciplinare: Scienze Agrarie e Veterinarie (1%)

1.2 Durata del Programma di Ricerca: 24 mesi

1.3 Titolo del Programma di Ricerca
    Testo italiano
    Autoimmunità e malattia celiaca: glutine, induzione di fenomeni autoimmuni e
    meccanismi effettori di danno intestinale

    Testo inglese

1.4 Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
                      AURICCHIO                                         SALVATORE
(cognome)                                                    (nome)
                                                                    Facoltà di MEDICINA e
      Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"
                                                                         CHIRURGIA
(università)                                                 (facoltà)
                            F19A                                 Dipartimento di PEDIATRIA
(settore scient.discipl.)                                    (Dipartimento/Istituto)


                                         troncone@unina.it
(E-mail)

1.5 Responsabile Scientifico dell'Unità di Ricerca
                  VENTURA                                ALESSANDRO
(cognome)                                          (nome)


    Professore associato                18/05/1950                   VNTLSN50E18C957E
(qualifica)                   (data di nascita)              (codice di identificazione personale)

         Università degli Studi di TRIESTE               Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA
(università)                                         (facoltà)
                          F19A                                 Istituto Clinica pediatrica
(settore scient.discipl.)                            (Dipartimento/Istituto)

             040/3785312                    040/3785362                ventura@burlo.trieste.it
(prefisso e telefono)               (numero fax)                   (E-mail)

1.6 Settori scientifico-disciplinari interessati dal Programma di Ricerca
   F07E                                                    F19A
1.7 Parole chiave
    Testo italiano
    DIABETE MELLITO INSULINO-DIPENDENTE ; ANTICORPI ANTI-ENDOMISIO ;
    DIETA SENZA GLUTINE ; CELIACHIA ; ANTICORPI ANTI-INSULA ; PARENTI DI
    PRIMO GRADO ; PREVENZIONE

    Testo inglese
    INSULIN DEPENDENT DIABETES MELLITUS ; ANTI-ENDOMYSIUM ANTIBODIES ;
    GLUTEN FREE DIET ; CELIAC DISEASE ; ANTI-INSULA ANTIBODIES ; FIRST
    DEGREE RELATIVES ; PREVENTION

1.8 Curriculum scientifico del Responsabile Scientifico dell'Unità di Ricerca
    Testo italiano
    Alessandro Ventura e' attualmente Direttore della Clinica Pediatrica dell'Università di
    Trieste presso l'IRRCS Burlo Garofolo. In questa sede è cresciuto professionalmente ed è
    rientrato dall'anno accademico 1997-98, dopo aver svolto attività come professore
    associato di Pediatria, negli anni accademici 1994-1997, presso l'Istituto di Clinica
    Pediatrica dell'Università di Pisa. Principali campi di interesse sono la
    gastroenterologia, l'immunologia e allergologia clinica. E' consigliere della Società
    Italiana di gastroenterologia ed epatologia pediatrica ( SIGEP), nell'ambito della quale
    ha coordinato diversi studi multicentrici. E' autore di oltre 300 pubblicazioni ed è tra i
    fondatori e i responsabili scientifici della rivista di aggiornamento pediatrico Medico e
    Bambino

    Testo inglese
    Alessandro Ventura is the director of the Pediatric Clinic of the University of Trieste at
    the "IRCCS Burlo Garofolo". Between 1994 and 1997 he worked as assistant professor
    at the Pedaitric Clinic of the University of Pisa. His main fields of interest are
    gastroenterology, clinical immunology and allergy. He is a member of the Italian Society
    of Pediatric Gastroenterology and Hepatology (SIGEP), and coordinator of several
    multicentric studies. He is the author of more then 300 publications and is in the
    scientific committee of the journal "Medico e Bambino" since its foundation.

1.9 Pubblicazioni scientifiche più significative del Responsabile Scientifico dell'Unità di Ricerca
    1. CATALDO F, VENTURA A., LAZZARI R, NASSIMBENI G, BALLI F, "Antiendomysium antibodies and
        coeliac disease : solved and unsolved questions. An italian multicentre study." , Rivista: Acta Paediatr ,
        Volume: 84 , pp.: 1125-31 , ISBN/ISSN: 0803-5326 , (1995) .
    2. POCECCO M, VENTURA A., "Coeliac disease and insulin dependent diabetes mellitus : a causal
        association ?" , Rivista: Acta Paediatr , Volume: 84 , pp.: 1432-1434 , ISBN/ISSN: 0803-5326 , (1995) .
    3. CATASSI C, FABIANI E, RATSH IM, COPPA GV, GIORGI PL, PIERDOMENICO R, ALESSANDRINI S,
        IWANEJKO G, DOMENICI R, MEI E, MIANO A, MARANI M, BOTTARO G, SPINA M, DOTTI M,
        MONTANELLI A, BARBATO M, VIOLA F, LAZZARI R, VALLINI M, GUARISO G, PLEBANI M,
        CATALDO F, TRAVERSO G, VENTURA A., "The coeliac iceberg in Italy. A multicentre antigliadin
        antibodies screening for coeliac disease in school-age" , Rivista: Acta Paediatr Suppl , Volume: 412 , pp.:
        29-35 , ISBN/ISSN: 0803-5326 , (1996) .
    4. LEPORE L, MARTELOSSI S, PENNESI M, FALCINI F, ERMINI EL, FERRARI R, PERTICARARI S,
        PRESANI G, LUCCHESI A, VENTURA A., "Prevalence of coeliac disease in patients with juvenile
        chronic arthritis." , Rivista: J Pediatr , Volume: 129 , pp.: 311-313 , ISBN/ISSN: 0022-3476 , (1996) .
    5. NOT T, CITTÀ A, LUCCHESI A, TORRE G, MARTELOSSI S, VENTURA A., "Anti-endomysium antibody
        on human umbelical cord vein tissue: an inexpensive and sensitive diagnostic tool for the screening of
        coeliac disease." , Rivista: Eur J Pediatr , Volume: 156 , pp.: 616-18 , ISBN/ISSN: 0340-6199 , (1997) .

1.10 Risorse umane impegnabili nel Programma dell'Unità di Ricerca
1.10.1 Personale universitario dell'Università sede dell'Unità di Ricerca
                                                                                                          Mesi
                                                                                                 Settor uomo
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        Cognome                Nome                 Dipart./Istituto               Qualifica        e
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                                                                                                 scient. 199 200
                                                                                                          9 0

1   VENTURA             ALESSANDRO            Clinica pediatrica            Prof. associato      F19A   4    4
2   CATTIN              LUIGI                 Clinica medica generale       Prof. associato      F07A   3    2
3   CROVELLA            SERGIO                Clinica pediatrica            Ricercatore          F03X   3    4
4   NOT                 TARCISIO              Clinica pediatrica            Ricercatore          F19A   6    6

1.10.2 Personale universitario di altre Università
                                                                                                 Sett   Mesi
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        Cognome              Nome           Università       Dipart./Istituto        Qualifica
º                                                                                                scie
                                                                                                  nt. 1999 2000



1.10.3 Titolari di assegni di ricerca
                                                                                                        Ann
                                                                                                              Mes
                                                                                                          o
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        Cognome              Nome                               Dipart./Istituto                         del
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                                                                                                        titol
                                                                                                               o
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1.10.4 Titolari di borse per Dottorati di Ricerca e ex L. 398/89 art.4 (post-dottorato e specializzazione)
                                                                                                        Mes
                                                                                             Anno del i
 Nº        Cognome                   Nome                        Dipart./Istituto
                                                                                               titolo uom
                                                                                                         o
1. BERTI                    IRENE                    Clinica pediatrica                      1998          2
2. BURATTI                  EMANUELE                 Medicina clinica                        1999          3
3. CENTUORI                 SUSANNA                  Clinica pediatrica                      1999          2
4. PETRUCCO                 ALESSANDRA               Medicina clinica                        1996          2
5. TOMMASINI                ALBERTO                  Clinica pediatrica                      1997          2
6. TREVISIOL                CHIARA                   Clinica pediatrica                      1999          4

1.10.5 Personale a contratto da destinare a questo specifico programma
                                                                                                            Mes
N                                                                                                            i
                                        Qualifica                                         Costo previsto
º                                                                                                           uom
                                                                                                             o

1.10.6 Personale extrauniversitario dipendente da altri Enti
                                                                                                            Mes
                                                                                                             i
Nº        Cognome                 Nome                   Dipart./Istituto                  Qualifica
                                                                                                            uom
                                                                                                             o
1. CITTA'                   ANGELO              IRCCS BURLO GAROFOLO               BIOLOGO                     4
2. FACCHINI                 SERGIO              IRCCS Burlo Garofolo               Borsista                    2
3. LEOPALDI                 AGNESE              IRCCS BURLO GAROFOLO               BIOLOGA                     4
                                                                                   DIRIGENTE 1°
4. MARTELOSSI               STEFANO             IRCCS BURLO GAROFOLO                                             3
                                                                                   LIVELLO
5. NERI                     ELENA               IRCCS BURLO GAROFOLO               BORSISTA                      5
                                                                          DIRIGENTE 1°
6. TONINI                 GIORGIO            IRCCS BURLO GAROFOLO                                   2
                                                                          LIVELLO
                                                                          DIRIGENTE 1°
7. TORRE                  GIULIANO           IRCCS BURLO GAROFOLO                                   3
                                                                          LIVELLO
8. TORTUL                 CARLA              Ospedale Civile Monfalcone   dirigente 1° livello      2
9. VELUSSI                MARIO              Ospedale Civile Monfalcone   dirigente 1° livello      2


                                   Parte: II2.1 Titolo specifico del programma svolto dall'Unità di Ricerca
    Testo italiano
    Efficacia della dieta senza glutine nella prevenzione del diabete in familiari di diabetici
    insulino dipendenti ICA positivi.

    Testo inglese
    Efficacy of a gluten free diet in prevention of insulin-dependent diabetes mellitus in ICA
    positive relatives of diabetics.

2.2 Base di partenza scientifica nazionale o internazionale
    Testo italiano
    La malattia celiaca è classicamente caratterizzata dal punto di vista clinico da una
    sindrome da malassorbimento e da quello istologico da una enteropatia glutine
    dipendente. La sua prevalenza è stata in passato variamente riportata in diversi Paesi,
    con          un         valore         medio          dell'ordine        del        1:1000.
    Peraltro, la disponibilità di test di screening sierologico facili da eseguire (anticorpi
    antiglutine, anticorpi antiendomisio = EMA) ha permesso di chiarire che la prevalenza
    della malattia è in realtà almeno 5 volte più frequente (1:200) (1) e che lo spettro delle
    manifestazioni cliniche glutine dipendenti e' molto più ampio di quanto fino ad oggi noto
    (2). In particolare, è oggi ben noto che l'intolleranza al glutine può sottendere numerose
    manifestazioni cliniche immunomediate anche in assenza di chiari disturbi
    gastroenterologici (la dermatite erpetiforme e il linfoma intestinale sono esempi noti da
    lungo tempo, mentre più recente e' stata la dimostrazione di altre manifestazioni
    autoimmuni glutine dipendenti come alcune sindromi neurologiche (3, 4), l'alopecia (5),
    alcune connettiviti (6). La malattia celiaca stessa ha una patogenesi immunomediata con
    elementi di autoimmunità (anticorpianti endomisio o anti-transglutaminasi tissutale) (8)
    (9), scatenata da un fattore esogeno conosciuto (la gliadina) su un terreno di
    predisposizione genetica (HLA DR3/DQ2) (7). Una frequente associazione tra malattia
    celiaca e altre malattie autoimmuni è ben nota, in particolare con il diabete mellito
    insulino dipendente (10). Questo tipo di associazione è stato classicamente attribuito a
    fattori genetici comuni (HLA DR), ma esistono oggi numerose evidenze per pensare che
    almeno una quota delle malattie autoimmuni che si associano alla celiachia (o che sono
    presenti in soggetti con la caratterizzazione genetica della celiachia) siano anch'esse
    glutine dipendenti. Numerosi altri autoanticorpi, organo e non organo specifici (come gli
    anticorpi anti trireoperossidasi, anticardiolipina,antinucleo, ICA), oltre agli EMA, si
    sono dimostrati in diversa misura glutine dipendenti in soggetti celiaci (11).
    E' ben noto che la comparsa di anticorpi anti cellula insulare pancreatica (ICA) ha un
    valore predittivo la comparsa del diabete nei familiari di soggetti con IDDM. Alcune
    evidenze aneddotiche e studi prospettici in corso suggeriscono che soggetti celiaci che
    siano anche ICA positivi negativizzano questo ultimo tipo di anticorpo dopo un tempo
    variabile dall'inizio della dieta senza glutine (11). Di particolare importanza, nel lasciar
    supporre che lo spettro della autoimmunità glutine dipendente sia molto più ampio della
sola enteropatia, ci sembra il risultato di uno studio collaborativo coordinato dal nostro
gruppo all'interno della Societa' Italiana di Gastroenterologia Pediatrica: la prevalenza
delle malattie autoimmuni nei soggetti adolescenti celiaci si e' dimostrata fortemente
dipendente dalla durata dell'esposizione al glutine (12). In particolare, la prevalenza di
IDDM in soggetti adolescenti non e' risultata superiore all'atteso (0.8 %) nel caso la
diagnosi di celiachia fosse stata fatta precocemente e la dieta senza glutine fosse stata
iniziata entro i due anni, con un aumento al 4.5% nel caso la dieta fosse stata iniziata tra
i due ed i 10 anni e al 7% nel caso di una diagnosi di celiachia e di un inizio della dieta
senza glutine oltre i 10 anni. Inoltre un'aumentata prevalenza di celiachia o di reattività
al glutine (senza i caratteri diagnostici della celiachia) è stata documentata anche nei
familiari      di    primo      grado      di     soggetti      diabetici   non     celiaci.
Molto interesse viene oggi posto sulle strategie di intervento che possano prevenire
l'insorgenza di diabete in soggetti a rischio (come i familiari di diabetici), ma nessuna
strategia si e' fino ad oggi dimostrata utile in questo senso.
Studi di familiarità hanno stabilito che fattori genetici sono di primaria importanza nella
suscettibilità        alla       malattia         celiaca         ed      al       diabete.
In parte l'influenza genetica è correlata alla presenza di specifici HLA di classe II.
Nel caso della celiachia la suscettibilità alla malattia risulta conferita dalla presenza
dell'eterodimero of HLADQA1*0501, DB1*0201, capace di legare con elevata affinità
alcuni                       peptidi                      della                   gliadina.
Nel caso del diabete si è dimostrato che la presenza di un acido aspartico in posizione 57
della catena DQB è associata con la suscettibilità alla malattia.
La determinazione degli HLA raramente contribuisce alla diagnosi di celiachia e
diabete, ma può essere molto utile per definire il rischio di un soggetto di manifestare le
due malattie.

Testo inglese
Celiac disease is characterized by a syndrome of malabsorption with hystologic features
of gluten sensitive enteropathy. The prevalence of the disease, previously estimated as
1:1000, is in fact about 1:200 as shown in several countries after population screenings
based on serologic tests (antigliadin and antiendomysium antibodies) (1).
These screenings have also improved the knowledge of CD and have widened the clinical
spectrum of the disease (2). In celiac subjects, even in the absence of overt enteropathy,
gluten ingestion is a risk factor for developing several extraintestinal autoimmune
diseases (IDDM, thyroiditis, alopecia, connective tissue diseases, ataxia) (3,4,5,6) and
malignancies.
Celiac disease itself has an immunomediated pathogenesis with elements of autoimmunity
(anti-endomysium-EmA- or anti tissue transglutaminase) triggered by a know
environmental factor (the gliadin) on a genetic predisposition in part linked to the HLA
antigens (HLA DR3/DQ2) (7).
Nowadays we have several evidences that the strong association between CD and
autoimmune diseases is related mainly to the length of gluten intake, and not only to the
sharing of the same HLA (12).
Furthrmore we have shown that celiac subjects with positive anti islet antibodies (ICA)
cease the production of ICA after a variable length of gluten free diet (11).
Much effort is devolved today to find strategies for the prevention of IDDM in subject at
risk (relatives of diabetics with anti-pancreas antibodies), but no intervention has been so
far effectiv .
We suggest that occurrence of IDDM may be gluten related also in a part of subjects
without the characteristic features of CD (EmA and intestinal mucosa inflammation). In
fact in some IDDM patients EmA positivity may appear several years after the onset of
    diabetes, and we cannot exclude that the spectrum of gluten sensitivity is wider than that
    identified with EmA.
    Therefore we propose a trial of gluten free diet for preventing diabetes in ICA positive
    relatives of IDDM patients.
    Family studies have established that genetic factors play a major role in susceptibility
    both for coeliac disease (CD) and for insulin dependent diabetes mellitus (IDDM). This
    genetic influence has been mapped, in part, to the short arm of chromosome 6, in the
    region encoding class II human leucocyte antigens. These cell-surface proteins are
    essential for the presentation of processed exogenous antigens to CD4 positive T
    lymphocytes, which is facilitated through the binding of 15-20mer antigenic peptides to a
    cleft within their tertiary structure. Polymorphisms of the genes encoding these molecules
    alter the configuration of this cleft, affecting individual binding affinities, influencing the
    T-cell response generated to a particular antigen. These HLA molecules also play a role
    in shaping T-cell reportoire within the thymus. The three families of class II HLA
    molecules are termed DR, DQ and DP.
    The strong association of CD with HLA DQ2, DR3 or DQ2, DR4/DR7 aplotypes is well
    know. In both cases genetic analysis of the class II HLA reveals the presence of
    HLADQA1*0501, DB1*0201 alleles, encoding the heterodimer characteristic of the
    disease.
    In celiac patients the HLA typing is rarely useful for diagnosis but in their first degree
    relatives there are several evidences that this investigation may help to define the risk of
    gluten sensitivity. Indeed there is an increased density of gamma/delta T lymphocytes in
    the mucosa of HLA DQ2 positive first degree relatives of celiac patients (Lancet
    1992;339:1500-3, Lancet 1993;342:492-3) and, among them, some subjects will develop
    overt celiac disease only after many years of gluten ingestion.
    For IDDM, it was shown that alleles encoding amino acid other than aspartic acid at
    DQB chain residue 57 (non-Asp 57) are associated with disease susceptibility.
    It is well known that HLA typing for diabetes in relatives of IDDM patients identify, in
    addition to pancreatic autoantibodies, an increased risk of developing diabetes.
    So we believe that it is important to typify both the celiac disease heterodimer and the
    IDDM related HLA in all the relatives of diabetics that will be included in the study.

2.2.a Riferimenti bibliografici
    1) Catassi et al.,        Acta Paed.Suppl. 412, 29-35, 1996
    2) Collin et al.          GUT 35, 1215, 1994
    3) Gobbi et al            Lancet 340,439,1992
    4) Hadjivassiliou et al Lancet, 347, 369, 1996
    5) Corazza et al Gastroenterology 109, 1333, 1995
    6) Lepore et al. J.       Pediatr, 129, 311, 1996 etc
    7) Maki                   Lancet, 348,1046,1996
    8) Dieterich et al        Nat Med 3, 797, 1997
    9) Picarelli et al.       Lancet 348,1065, 1996
    10) Cronin et al          Lancet, 349,1096,1997
    11) Ventura Proceedings of the meeting "Changing features of coeliac disease, Tampere
    1998, pag 67-72
    12) Ventura et al, J Pediatr. Gastroenterol. Nutr.24, 463,1997

2.3 Descrizione del programma e dei compiti dell'Unità di Ricerca
    Testo italiano
    Obiettivo del progetto
Lo studio e' finalizzato a verificare sia la prevalenza di marcatori sierologici, istologici e
immunoistoistochimici di celiachia nei familiari di I° grado, ICA positivi, di soggetti con
diabete insulino dipendente, sia l'efficacia della dieta senza glutine nella prevenzione del
diabete                  negli                 stessi                 soggetti                .
Percorso del progetto.
- Reclutamento di circa 1000 familiari di soggetti con IDDM in collaborazione con
diversi centri di diabetologia della Regione FVG e della Campania.
-             Richiesta            di             consenso              informato             .
- Tutti i soggetti reclutati verranno sottoposti a screening sierologico della malattia
celiaca (EMA e anticorpi anti transglutaminasi) e a ricerca degli autoanticorpi che
predittivi di IDDM (ICA, GAD, IA2).
- Una biopsia duodenale con valutazione dei marcatori immuonoistochimici di malattia
celiaca verrà effettuata in tutti i soggetti ICA positivi e/o EmA positivi. Inoltre la
possibile sensibilità al glutine sarà valutata anche con challenge rettale (valutazione
immunoistochimica: gamma/delta, espressione dei DR dopo instillazione rettale di
glutine).
- Tutti i soggetti EMA positivi e/o con le alterazioni della mucosa intestinale tipiche della
celiachia vengono messi in dieta senza glutine.
- I soggetti ICA positivi (numerosita' prevista tra 50 e 100), EMA negativi, vengono
randomizzati, dopo consenso informato, per ricevere per un anno dieta senza glutine. Al
momento della randomizzazione, tutti i soggetti ICA positivi che accetteranno di entrare
nello studio saranno sottoposti ad accertamenti immunologici atti a definire sia lo spettro
di autoanticorpi sierici presenti (antitiroide, antienterocita, antitransglutaminasi, ANA,
anticardiolipina) sia i marcatori di intolleranza al glutine latente (anticorpi antiglutine,
antitransglutaminasi), sia la presenza degli HLA specifici rispettivamente per la
celiachia ed il diabete .
- L'effetto della dieta senza glutine sullo stato generale, sui parametri sierologici e
immunoistochimici verrà valutato sia nei soggetti EMA positivi (ICA positivi o negativi),
che nei soggetti EMA negativi/ ICA positivi.
- Il follow up di questi pazienti sarà quello classico del paziente celiaco con valutazione
ogni 4 mesi degli EMA per controllare l'adeguatezza della dieta, ma darà la possibilità
di valutare l'andamento in dieta senza glutine anche degli autoanticorpi diabete correlati
eventualmente positivi prima della dieta.
- Dopo un anno, verranno nuovamente sottoposti a biospia intestinale tutti i soggetti
messi in dieta senza glutine che erano inizialmente stati sottoposti a biopsia.
METODI
Ricerca degli autoanticorpi.
1) Anticorpi anti intestino.
Gli anticorpi anti-intestino sono stati descritti in rari casi di diarrea cronica intrattabile,
a patogenesi autoimmune (enteropatia autoimmune). Il substrato utilizzato per la ricerca
degli anticorpi anti-intestino è costituito da criosezioni di mucosa intestinale ottenuta da
espianto. Il pattern caratteristico è costituito da una fluorescenza citoplasmatica diffusa,
con risparmio dei nuclei, maggiormente visisbile negli enterociti maturi dell'apice del
villo intestinale (Walker-Smith JA Lancet 1982;1:566-567).
2) Anticorpi antinucleo (ANA).
Gli Anticorpi Anti Nucleo (ANA) rappresentano un test di screening per patologie
autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico e l'epatite cronica attiva. Sono una
famiglia di autoanticorpi che reagiscono con una ampia ma distinta gamma di proteine,
nucleoproteine ed acidi nucleici presenti nel nucleo di cellule di mammifero. Gli
anticorpi antinucleo verranno ricercati con la metodica di immunofluorescenza indiretta
su vetrini di cellule Hep-2, coltivate in vitro e contenenti un sufficiente numero di figure
mitotiche.
Su tale substrato sono riconoscibili diversi pattern di fluorescenza ben codificati, che
rispecchiano la reattività nei confronti di diversi autoantigeni.
In generale maggiore è il titolo degli ANA, maggiore è la probabilità che essi si associno
a una specifica malattia autoimmune. Resta invece in buona parte da definire il
significato di una reattività a basso titolo.
3) Anticorpi anti Insula (ICA).
Gli anticorpi anti-insula sono stati il primo marker sierologico identificato nel siero di
pazienti con diabete mellito insulino dipendente (Bottazzo GF Lancet 1974;2:1279). Gli
ICA vengono ricercati su criosezioni di tessuto pancreatico ottenuto da espianto. Il
pattern di fluorescenza caratteristico è rappresentato da una colorazione omogenea delle
beta cellule nelle isole pancreatiche. Sono un marker dotato di elevata sensibilità ma
bassa specificità, in quanto identificano un'elevata percentuale di soggetti non diabetici,
che solo in alcuni casi svilupperanno la malattia.
4) Anticardiolipina.
Gli anticorpi anticardiolipina sono comunemente ricercati nei soggetti con Lupus
eritematoso sistemico, nei quali possono indicare un rischio di complicazioni
neurologiche e vascolari (anticardiolipina IgM). La presenza di anticardiolipina di
isotipo IgG è inoltre associata a un maggior rischio di aborto. La cardiolipina, che si
trova nei mitocondri, probabilmente non è l'antigene riconosciuto in vivo dagli anticorpi.
Tuttavia, poiché gli anticorpi anti-fosfolipidi crossreagiscono con altri fosfolipidi
elettronegativi la cardiolipina può essere utilizzata come antigene rappresentativo nel
sistema.
Procedura: ELISAcon piastre commerciali sensibilizzate con cardiolipina.
5) Antiperossidasi tiroidea e Antitireoglobulina.
Gli anticorpi antireoperossidasi e antireoglobulina sono marker sierologici delle
tireopatie autoimmuni, ma al pari di altri autoanticorpi organo specifici, il loro riscontro
è frequente in soggetti con altre malattie autoimmuni. Inoltre anche questi autoanticorpi
sembrano associarsi ad un maggior rischio di poliabortività. Essi vengono dosati con
sistema immunoenziamtico utilizzando piastre sensibilizzate con i rispettivi antigeni
purificati.
5) Anti ds-DNA.
Gli anticorpi anti DNA doppia elica (anti ds-DNA) sono considerati un marker
fortemente specifico di Lupus Eritematoso Sistemico. Nei pazienti con Les, tali anticorpi
sono presenti ad alto titolo ed esistono numerosi dati ad indicare una loro genesi
"guidata" dall'antigene. Il riscontro degli anticorpi anti-DNA nella popolazione è molto
raro, ma un recente studio dimostra che essi sono presenti con una frequenza
significativa in soggetti celiaci (Lerner A Dig Dis Sci 1998; 43:723-726). Anche il loro
significato, analogamente a quanto accade per gli anticardiolipina sembra rispecchiare
un disturbo nei processi di apoptosi cellulare.
Procedura: Verranno valutati con una metodica immunoenzimatica (ELISA) dotata di
maggior sensibilità rispetto al test radioimmunologico di riferimento (test di Farr), anche
se di minor specificità per quanto riguarda la diagnosi di LES. Un test di conferma sarà
l'immunofluorescenza su vetrini preparati con colture di Crithidia luciliae, un parassita
emoflagellato contenente una larga rete di ds-DNA chiamata chinetoplasto.
Immunoistochimica.
La biopsia intestinale viene ottenuta per mezzo della capsula di Watson nel bambino e
per mezzo di esofago-gastro-duodenoscopia nell'adulto.
L'analisi istochimica viene effettuata su criosezioni di mucosa, per mezzo di anticorpi
anti CD3 e anticorpi anti catena delta, rilevati con la tecnica della streptavidina-
perossidasi. In sintesi, le sezioni incubate con gli anticorpi di pecora monoclonali anti
CD3 e anti catena delta vengono lavate e quindi reincubate per 30' a temperatura
ambiente con anticorpi di capra anti Ig di pecora, coniugati con streptavidina-
perossidasi. La sezione viene quindi colorata per mezzo dell'aggiunta del substrato della
perossidasi e controcolorata con Ematossilina acquosa.(soluzione di Mayer).
Challenge rettale .
Dopo aver eseguito una prima biopsia rettale, vengono instillati 2 grammi di idrolisato
peptico-triptico di gliadina sulla mucosa rettale. La biopsia viene ripetuta sei ore dopo. I
parametri studiati sul materiale bioptico sono l'infiltrazione linfocitaria CD3+, e la
percentuale dei linfociti T con recettore gamma delta. L'analisi istochimica viene
effettuata come su riferito per le biopsie intestinali.
Tipizzazione HLA.
Il DNA verrà estratto da leucociti da sangue periferico per mezzo del Kit Genomix
(Talent).
Gli alleli HLA DQA1*0501 e DB1*0201 verranno amplificati utilizzando il Kit SSP DQ
"low resolution" (Dynal). Questo kit è basato sulla tecnologia PCR allele specifica,
seguita da verifica della lunghezza dell'amplificato su gel di agarosio. L'analisi della
posizione 57 della molecola HLA DQB1 sarà effettuata per mezzo di amplificazione
mediante PCR e successiva ibridizzazione con oligonucleotidi specifici (SSO).

Testo inglese
Aim of the study.
1) To evaluate the prevalence of serologic and immunohystochemicals markers of Celiac
Disease (CD) in first degree relatives of IDDM patients.
2) To evaluate the prevalence of anti-pancreas autoantibodies (ICA, anti Gad, anti IA2)
in first degree relatives of IDDM patients.
3) To evaluate the efficacy of a gluten free diet in the downregulation of ICA, both in
celiacs and in non celiacs IDDM relatives.
Study design        .
- Recruitment of about 1000 relatives of IDDM patients from the diabetologic centers of
Friuli-Venezia Giulia and Campania.
- Request of the informed consent.
- All the subjects will be screened for autoantibodies related to CD (EmA and anti-tissue
transglutaminase) and related to IDDM (ICA, anti GAD, anti IA2).
- A jejunal biopsy with immunohystochemical evaluation will be performed in all ICA
positive and/or EmA positive relatives. Furthermore, sensitivity to gluten will be
evaluated also by rectal challenge (infiltration of T cell with increased gamma-delta
receptor subset after the rectal administration of gliadin).
- All the subjects with EmA positivity and/or with immunohystochemical features of CD
will assume a gluten free diet.
- ICA positive/EmA negative subjects (from 50 to 100 subjects), will be randomized after
informed consent, to receive a 1 year gluten free diet. All the subjects participating in the
trial will be evaluated for a wide spectrum of autoantibodies and thei HLA status will be
determined.
- The effect of a gluten free diet on ICA positivity will be evaluated both in celiacs and in
not celiacs with ICA posive.
- Follow-up with autoantibodies evaluation every 4 months and second biopsy after 1
year. .
Methods.
Autoantibodies.
1) Anti-gut.
Anti-gut antibodies have been described in patients with autoimmune enteropathy with
    chronic intractable diarrhea.
    Procedure: immunofluorescence on criosections of gut mucosa. Positive results showed a
    pattern of intracytoplasmic fluorescence without staining of the nucleoli (Walker-Smith
    JA Lancet 1982;1:566-567).
    2) Antinuclear antibodies (ANA).
    ANA are a useful screening test for several autoimmune disease.
    Procedure: immunofluorescence on Hep-2 cells. There are different patterns, suggestive
    of distinct autoimmune disease. On this substrate different pattern of
    immunofluorescence are well recognized and reflect the reactivity toward different
    autoantigens.
    3) Anti Insula antibodies (ICA).
    They are the first serologic marker of IDDM (Bottazzo GF Lancet 1974;2:1279). They
    are useful in relatives of diabetics, where ICA identify the population at risk for
    developing IDDM.
    Procedure: immunofluorescence using as substrate criosections of human pancreas.
    4) Anticardiolipin antibodies.
    Procedure: ELISA.
    5) Antiperoxidase and Antittyreoglobulin.
    They are markers of autoimmune thyreopathies, but they are frequently positive also in
    other autoimmune disorders.
    5) Anti ds-DNA.
    They are a specific marker of Systemic Lupus Erithematosus.
    Procedure: ELISA.
    Immunohystochemistry.
    Intestinal biopsy will be performed with a Watson capsule in infants and biopsy under
    duodenoscopy in adults. Intraepithelial lymphocytes will be stained with antibodies to
    CD3 and gamma delta receptors.
    Rectal Challenge.
    After a first rectal biopsy, 2 grams of hydrolyzed gliadin will be administered in rectum
    and a second biopsy will be performed after 6 hours.
    HLA Typing.
    DNA will be extracted from peripheral blood with standard techniques using the
    Genomix Kit (Talent).
    The DQA1*0501 and DB1*0201 alleles will be determined using the SSP DQ "low
    resolution" kit (Dynal). This kit is based on allelic specific PCR technology allowing
    HLA alleles identification by PCR amplification and subsequent run on 1% agarose gel
    in presence of an internal positive control (human growth hormone gene, 429 base
    pairs).
    The analysis of the position 57 of DQB1 molecules will be conducted by polymerase
    chain reaction (PCR) and subsequent specific sequences oligonucleotide (SSO)
    hybridisation.

2.4 Descrizione delle attrezzature già disponibili ed utilizzabili per la ricerca proposta
       Anno di                                           Descrizione
 Nº acquisizi
         one                     Testo italiano                                   Testo inglese
   1. 1993      Leiz Laborlux K. Microscopio a fluorescenza.       Leiz Laborlux K. Fluorescence microscope.
                Tiertek Multiscan Plus. Lettore di piastre         Tiertek Multiscan Plus. ELISA plates
   2. 1992
                ELISA.                                             reader.
   3. 1992      Lavatore di piastre ELISA.                         ELISA plate washer.
   4. 1990      ALC 4227 R: Centrifuga refrigerata.                ALC 4227 R: Refrigerated centrifuge.
   5. 1996      Termal Cycler Perkin Elmer                         Termal cycler Perkin Elmer
2.5 Descrizione della richiesta di Grandi attrezzature (GA)
Attrezzatura I
Descrizione
valore presunto (milioni) percentuale di utilizzo per il programma
Attrezzatura II
Descrizione
valore presunto (milioni) percentuale di utilizzo per il programma

                                       Parte: III3.1 Costo complessivo del Programma dell'Unità di Ricerca
                                     Spesa                              Descrizione
             Voce di spesa
                                     Euro           Testo italiano                     Testo inglese
                                             Microscopio a
                                                                            Fluorescence microscope for
                                             fluorescenza con capacità
                                        30.9                                multi-colour fluorescence
        Materiale inventariabile             di analisi multi-colore,
                                         87                                 analysis, with photographic
                                             macchina forografica e
                                                                            camera and telecamera.
                                             telecamera.
        Grandi Attrezzature
                                             Anticorpi secondari per
                                             Immunofluorescenza e per
                                             ELISA (valutazione dei
                                                                            Secondary antibodies for
                                             diversi autoanticorpi).
                                                                            Immunofluorescence and for
                                             Primers oligonucleotidici e
                                                                            ELISA. Oligonucleotide primers
                                             reagenti per polimerase
                                                                            and reagents for polimerase
        Materiale di consumo e          25.8 chain reaction
                                                                            chain reaction. Reagents for the
        funzionamento                    23 (caratterizzazione HLA).
                                                                            production of recombinant
                                             Reagents for the
                                                                            human tissue transaglutaminase.
                                             production of recombinant
                                                                            Kits for the detection of other
                                             human tissue
                                                                            autoantibodies. Plastics.
                                             transaglutaminase. Kits for
                                             the detection of other
                                             autoantibodies. Plastics.
        Spese per calcolo ed
        elaborazione dati
        Personale a contratto
                                            Assistenza informatica per
                                       2.58 il Database generale di         Database assistance.
        Servizi esterni              5
                                          2 gestione sieri e DNA.           Consuelling.
                                            Consulenze.
                                            Partecipazione ai
                                            congressi europei di            Participation to the european
                                       7.74
        Missioni                    15      Gastroenterologia               meetings of pediatrica
                                          7
                                            pediatrica e di                 gastroenterology and Diabetes.
                                            Diabetologia.
        Altro

                                                                                M£          Euro
                   Costo complessivo del Programma dell'Unità di Ricerca         130          67.139

                   Costo minimo per garantire la possibilità di verifica dei     130           67.139
                                                                    risultati

                                                     Fondi disponibili (RD)       30           15.494

                                                     Fondi acquisibili (RA)       10            5.165

                                     Cofinanziamento richiesto al MURST           90           46.481
         Parte: IV4.1 Risorse finanziarie già disponibili all'atto della domanda e utilizzabili a sostegno del
                                                                                                     Programma
QUADRO RD
                                                        Import
                                                            o
                                                        dispon
                      Provenienza                Anno     ibile nome Resp. Naz.              Note
                                                        M Eur
                                                        £ o
                                                            2.58
         Università                                1998 5
                                                               2
         Dipartimento
         MURST (ex 40%)
         CNR
         Unione Europea
                                                          2 12.9
         Altro                                      1999
                                                          5    11
                                                          3 15.4
         TOTAL
                                                          0 94
                                                   4.1.1 Altro
    25 milioni sono disponibili nell'ambito del progetto dell'IRCCS Burlo Garofolo dal titolo
    "Autoantigeni e autoanticorpi nella malattia celiaca e in altre malattie autoimmuni.
    Ruolo patogenetico e utilizzabilita' per la semplificazione diagnostica".

4.2 Risorse finanziarie acquisibili in data successiva a quella della domanda e utilizzabili a sostegno del
programma nell'ambito della durata prevista
QUADRO RA
                                                                            Q
                                                                            u
                                                                            o
                                                                             t
                                                                            a
                                                                            d
                                                                            is
                                                                            p
                                                                            o
                                                                            n
                                                  Anno
                                                                             i
                                                  della
                                                                            b
                                                 doman
                                                                            il
                                                  da o          Stato di
                     Provenienza                                            e             Note
                                                 stipula    approvazione
                                                                            p
                                                   del
                                                                            e
                                                 contrat
                                                                            r
                                                    to
                                                                            il
                                                                            p
                                                                            r
                                                                            o
                                                                            g
                                                                            r
                                                                            a
                                                                            m
                                                                            m
                                                                            a
                                                                                  E
                                                                                 Mu
                                                                                 £r
                                                                                  o
         Università
         Dipartimento
         CNR
         Unione Europea
                                                                                   5 Progetto dell'IRCCS
                                                                                   . Burlo Garofolo
                                                                                 1
                                                                                   1 "CITOCHINE E
         Altro                                        1999 accettato             0
                                                                                   6 REGOLATORI DELLA
                                                                                   5 PERMEABILITA'
                                                                                     INTESTINALE N...
                                                                                   5
                                                                                   .
                                                                                 1
                                                                                   1
         TOTAL                                                                   0
                                                                                   6
                                                                                   5

                                                      4.2.1 Altro
    Dieci milioni sono disponibili nell'ambito dello progetto di studio del IRCCS Burlo
    Garofolo già approvato, dal titolo: "CITOCHINE E REGOLATORI DELLA
    PERMEABILITA' INTESTINALE NELLA MALATTIA INFIAMMATORIA CRONICA
    INTESTINALE (MICI): PATOGENESI E IMPLICAZIONI TERAPEUTICHE". Tale
    progetto prevede tra l'altro lo studio di nuovi mediatori della permeabilità intestinale,
    che potrebbero svolgere un ruolo di primo piano nella genesi di malattie autoimmuni
    correlate all'assunzione di alimenti. Esistono numerose evidenze sia cliniche (relazioni
    con l'intolleranza al glutine e, forse, con l'intolleranza alle proteine del latte vaccino), sia
    sperimentali (animali che sviluppano il diabete in seguito all'assunzione di glutine) che
    sostengono l'imporatanza di alcuni degli alimenti come fattori scatenanti del diabete
    mellito insulino dipendendente.

4.3 Certifico la dichiarata disponibilità e l'utilizzabilità dei fondi di cui ai punti 4.1 e 4.2: SI
                                 Firma ____________________________________________




(per la copia da depositare presso l'Ateneo e per l'assenso alla diffusione via Internet delle informazioni riguardanti
i programmi finanziati; legge del 31.12.96 n° 675 sulla "Tutela dei dati personali")




                  Firma ____________________________________________                               29/03/1999 18:53:42

				
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