Medios de cultivo y esterilización

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					                                                                              Métodos de esterilización
                                                                       u FISICOS:
                    Medios de cultivo y                                u Calor   – oxidación o coagulación de
                      esterilización                                       proteínas; método más confiable
                                                                           – seco – conducción de calor más lento y
                        Curso: Sistemática de insectos y                     menor penetración
                        diagnóstico de enfermedades de
                              importancia agrícola                         – húmedo
                                  Agosto 2005
                                                                       u Ondas      luminosas:
                                                                                    luminosas: UV
                                                   MSc.
                         Ing. Agr. Vivienne Gepp, MSc.
                                                                       u QUIMICO




                               Calor seco                                              Calor húmedo
            u    Para: vidrio, metal, algunos plásticos, sustancias    u   Con presión: autoclave, olla presión
                 estables a altas temp.                                u   Para: sustancias estables al calor, tener en
            u    Tiempo y temperatura: 1h a 180ºC, 2h a 170º, 4h           cuenta combinaciones reactivos a temp altas
                         12-                               temp)
                 a 140º, 12-16h a 120ºC (tiempo a esas temp)           u   Temperatura – presión – tiempo
            u    Para evitar recontaminación: recipientes de metal o   u   15 min a 121ºC o 30 min a 115ºC, 15lb (2 atm)atm)
                 envolver en papel (usar temp. Menor en este caso)     u   ¿cómo optimizar eficacia? Contenidos similares,
            u    Precauciones: vidrio debe estar seco                      no apretados, dejar espacios verticales
            u    No usar para esterilizar vidrio graduado              u   Precauciones: tapas sueltas, recipientes con
            u    Dejar que vuelva a temp ambiente antes de abrir           hasta 1/3 de volumen, vuelta a presión normal
                                                                           lenta para evitar que salten tapones y que hierva
                                                                           el contenido.




                                Autoclave                                    Calor húmedo con presión
            1.    Poner agua (si es necesario)                         u                                 0,2-
                                                                           Modifica los medios: pH en 0,2-0,4 unidades,
            2.    Colocar medios, etc.                                     hidrólisis parcial de azúcares, proteínas
            3.    Cerrar bien tapa                                                                          (-
                                                                           modificadas, concentra medio (- 3 a 5% de agua)
            4.    Abrir válvula de desagote                            u   Glucosa + aminoácidos pueden reaccionar e
            5.    Encender fuente de calor                                 inhibir mo
            6.    Desagotar aire                                       u   Esterilización en exceso puede hidrolizar agar
            7.    Cerrar válvula                                           parcialmente – puede inhibir m.o.
            8.    Vigilar presión, computar tiempo cuando llega a      u   Calentamiento de medios ácidos disminuye
                  15 lb                                                    capacidad de solidificarse del agar: acidificar
            9.    Luego de 15 – 20 min. apagar fuego y dejar                            autoclavar,
                                                                           después de autoclavar, no recalentar medio V8
                  enfriar                                              u   Vitaminas, hormonas, antibióticos, etc. se
            10.   Abrir válvula luego de >20 min.                          esterilizan por filtrado y se agregan después




                                                                                                                               1

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                   Calor húmedo sin presión                                               Fuego directo
            u 20    min. a 100ºC en 3 días sucesivos                         u Para  objetos de metal
                                                                             u Según   el metal: anzas directamente
                                                                               al fuego,
                                                                                        bisturíes,
                                                                             u pinzas, bisturíes, agujas pasar por
                                                                               etanol 96 y flamear
                                                                             u Ídem portaobjetos, cubres.




                    Esterilización por filtrado                                  Esterilización por luz UV
            u   Elimina microorganismos >virus                               u Luzultravioleta
            u   Ventaja: no modifica composición
            u   Para: cantidades pequeñas                                    u Capacidad de penetrar en materiales
            u   Para: vitaminas, hormonas, antibióticos, etc.
            u   De diferentes materiales:
                         (scintered) re-
                – vidrio (scintered) re-usables, se lavan con ácidos
                – Fibras de amianto y celulosa: 1 uso, sitios de adsorción
                – Membranas de ésteres de celulosa: 1 uso, poros de 0,22
                  µm
                – Dos últimos se esterilizan en autoclave previo al uso




                      Esterilización química                                             Medios de cultivo
                Ventajas: no requiere altas temp ni aparatos
                                                                             u Componentes    básicos:
            u
                costosos
            u   Desventajas: mayor tiempo, sustancias
                inflamables y muy tóxicos y alto costo
            u   Oxido de etileno: muy efectivo pero inflamable en
                          etileno:                                           u ¿Sólido o líquido?
                contacto con aire, hierve a 10,8ºC. Requiere
                recipientes especiales.                                      u Ajuste de pH
            u             propileno:
                Oxido de propileno: menos efectivo y menos
                penetrante, hierve a 34ºC. Se aplica frío en un              u Inhibidores de “contaminantes”:
                recipiente hermético o bolsa de polietileno. Placas
                con medio sólido + 1ml de PO enfriado, en                      – bacterias
                cámara de gas a temp ambiente.                                 – hongos no deseados
            u   Formaldehído:
                Formaldehído: excelente contra m.o. y virus,
                Desventajas: olor, pobre penetración y difusión y
                tóxico. En recipiente hermético o bolsa de
                polietileno.




                                                                                                                      2

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                Clasificación de medios de cultivo                    ¿Qué aportan los medios?
                                                                 u Soporte              solidificantes:
                                                                              - Agentes solidificantes:
            u Sintéticos– más complicados para
                                                                                                           25-
                                                                     – gelatina: fusión a 37ºC, solidifica 25-30ºC, se
              elaborar, muchos componentes                             descompone a 121ºC
                                                                                      80-                     35-
                                                                     – agar: fusión a 80-100ºC, solidifica a 35-50ºC
            u Naturales – raíces y frutos aportan lo
                                                                 u   Carbono orgánico
              necesario para hongos, ¿bacterias                      – Azúcares inducen crecimiento micelio, pueden
              necesitan más?                                                                temporal- permanentem.
                                                                       inhibir esporulación temporal- o permanentem.
                                                                 u Vitaminas    y otros factores de crecimiento
              Semi-
            u Semi-sintéticos
                                                                 u Inhibidores
                                                                 u Sustancias                          spp.
                                                                              que permiten diferenciar spp. o
                                                                   biotipos
                                                                 u Indicadores




                          Medios comunes:                                Dispensado de medios
            u   Agar papa dextrosa    u   Nutriente agar         u Temperatura:         45-
                                                                                        45-50ºC
                                          dextrosa
                                                                     – mayor: condensa H2O
            u   Agar agua
                                      u   Extracto de levadura       – menor: solidificación prematura
            u   Agar malta                dextrosa con           u Placas        Petri:
                                                                              de Petri: aprox. 20 ml c/u
                                          carbonato de calcio
                                          (Yeast Dextrose        u Tubos      de ensayo: vertical o pico de
                Agar harina de maíz
            u                             CaC03)
                                          CaC03)                     flauta
            u   Agar V8               u   B de King




                                                                                                                         3

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