Postnatal Section (Blood samples) Regional Cytogenetics Department by hjg19296


									User Guide for Blood Samples 

                          Postnatal Section (Blood samples) 
                          Regional Cytogenetics Department 
                                 St James’s Hospital 
                                      LS9 7TF 

                           Head of section: Steve Morris 
                             Telephone: 0113 206 6566 

Referral categories 

The main referral categories include abnormal newborns, patients with unexplained 
learning difficulties, dysmorphic children, investigation of infertility and recurrent 
miscarriage, parents of children with a known chromosome abnormality, follow­up 
from prenatal diagnosis, family follow­up and screening of patients and donors for 

Referral for Prader Willi and Angelman’s Syndrome: In addition to routine 
cytogenetic analysis all Prader­Willi and Angelman syndrome cases are passed on to 
the Regional DNA laboratory to determine if there is an abnormal DNA pattern 
present and to check for uniparental disomy. 

Chromosome Breakage Syndrome: Routine and specialised cultures are prepared for 
these cases and more blood will be required (at least 5 ml). Conditions amenable to 
cytogenetic analysis include ataxia telangiectasia, Bloom’s syndrome, Fanconi’s 
anaemia and Nijmegen Breakage Syndrome. Please indicate on the request card which 
test is required. 

Microdeletion testing: A variety of genetic syndromes associated with specific 
chromosome micro­deletions have been identified. Testing using an MLPA 
(Multiplex Ligation­Dependent Probe Amplification) reaction for some of these 
syndromes (see list below) is now performed. 

Sub­telomere testing: This is performed on patients following consultation with the 
Clinical Genetic’s Department, Chapel Allerton. 

Further clinical advice is available from the Department of Clinical Genetics, 
Chapel Allerton Hospital, Leeds

Chromosome analysis. 

   Requirements: 1­2 mls (minimum) peripheral blood in a lithium heparin tube 
   (green or orange top) & referral card completed with Name, NHS no., d.o.b. 
   address and comprehensive clinical details. 

 1.  Breakage Syndrome studies. 

   Routine and specialised cultures are prepared for these cases and more blood will 
   be required (at least 1.5 ml). Conditions amenable to cytogenetic analysis include 
   ataxia telangectasia, Bloom’s syndrome, Fanconi’s anaemia and Nijmegen 
   Breakage Syndrome. Please indicate on the request card which test is required. 

   Requirements: 1.5mls (minimum) of peripheral blood in a lithium heparin tube 
   (green or orange top). 

Sample Tubes 

Blood should be collected in a lithium heparin tube (orange or green top), and mixed 
well to prevent clotting. 
It is important to ensure that the sample tube contains lithium heparin irrespective of 
the colour of the tube top. 

Preferred volumes of blood 
Adults 5ml 
Children 2­5ml 
Infants 1­2ml
More blood may be required if chromosome breakage studies are required. 

Blood in EDTA will also be accepted, however many bloods sent in EDTA do not 
grow and those that do often require a repeat sample. Blood in other containers is not 
suitable for culture. Clotted blood is unsuitable for cytogenetic analysis. 

Sample Transport 

• Samples should be addressed to: 

Cytogenetics Unit, 
St. James’s Hospital 
Beckett Street, 
LS9 7TF 

• Cytogenetic analysis requires living cells. Please ensure that the sample reaches us 
as quickly as possible (within 48 hours). First class post is satisfactory for non­urgent 
• Urgent samples should be sent by courier or taxi. 
• Samples should not be frozen, exposed to excess heat or stored in formalin. 
• If there is a delay in transit please store the sample at 4°C (in a refrigerator). 
• Please try to avoid sending samples at weekends or bank holidays as post is not 
delivered on these days. 

              (Copies are available from the Post Office) 

Urgent Samples 

Cases treated as urgent are all new borns, cordocentesis specimens, pregnant couples 
including follow up of prenatal diagnosis, children awaiting surgery and others cases 
as discussed with the laboratory. 

Reporting of Results 

• Urgent cases. Usually within 5­7 days which is within the national guidelines. An 
aneuploidy screen can often be done overnight as a Fluorescent in situ Hybridisation 
(FISH) test (please contact the laboratory). 
• Other cases. We attempt to report within the national guidelines which are within 28 
days. If results are required earlier please contact the lab. 
• Complex abnormalities, or abnormalities that are difficult to interpret, may require 
FISH to resolve the karyotype, this may delay some results. 
• Results are sent to the referring clinician. Complex abnormal results are usually 
telephoned prior to the written report being sent and the interpretation and implication 
discussed. Abnormal results from urgent cases will be telephoned to the referring 
• In response to telephone enquiries, only normal results or those which confirm a
previous finding are given to a clinicians’ secretary or the clinic sister. All other 
results are only given to clinicians.
 * Please note that FISH testing might be performed if the sample received is 
 sub­optimal (sent without an EDTA sample or too small (<1.0mls)) or where 
 it is considered by the lab to be the most cost effective approach. 

1.  MLPA microdeletion studies. 

 Requirements: 1­2 mls (minimum) of peripheral blood in a lithium heparin tube 
 (green or orange top) AND 1­2 mls of peripheral blood in a EDTA tube (purple 
 top) & referral card completed with Name, NHS no., d.o.b. address and 
 comprehensive list of clinical details. 

2.  MLPA sub­telomere studies. 

 Referrals for this test must be arranged through the Clinical Genetics Department, 
 Chapel Allerton Hospital, Leeds. 

 Requirements: 1­2 mls (minimum) of peripheral blood in a lithium heparin tube 
 (green or orange top) AND 1­2 mls of peripheral blood in a EDTA tube (purple 
 top) & referral card completed with Name, NHS no., d.o.b. address and 
 comprehensive list of clinical details. 

 Please note this test will only detect unbalanced rearrangements.
Summary of Microdeletion syndromes tested for by the P245 MLPA 
                       microdeletion kit 

      Loci Tested                 Associated Microdeletion/duplication Syndrome 

        1p36.33                              1p36 Deletion syndrome 

        2p16.1                               2p16 Deletion syndrome 

         3q29                                3q29 Deletion syndrome 

        4p16.3                               Wolf­Hirschhorn syndrome 

        5p15.33                                Cri­du­Chat syndrome 

        5q35.3                                  SOTOS syndrome 

        7q11.2                         Williams syndrome/7q11.23 duplication 

        8p23.1                               8p23 Deletion syndrome 

         8q24                                Langer­Gideon syndrome 

        9q22.33                              9q22 Deletion syndrome 

         10p14                             DiGeorge syndrome region 2 

         11p13                                   WAGR syndrome 

        15q11.2                          Prader­Willi/Angelmans syndrome 

        15q24.1                              15q24 Deletion syndrome 

        16p13.3                             Rubinstein­Taybi syndrome 

        17p11.2                     Smith­Magenis syndrome/17p11.2 duplication 

        17p13.3                               Miller­Dieker syndrome 

        17q11.2                                    NF1 Deletion 

       17q21.31                              17q21 Deletion syndrome 

        22q11.2                       DiGeorge syndrome/22q11.2 duplication 

        22q13.3                             Phelan­McDermid syndrome 

         Xq28                              MECP2 duplication syndrome
Technical details of P245 kit (Base positions based on Human GRCh37 Assembly 

General Reference: 

DiGeorge (22q11.2) 

3 probes for 22q11.2:  CLDN5  at 19.51Mb  1.5Mb deletion 
                       GP1BB   at 19.71Mb  3  Mb deletion 
                       SNAP29 at 21.24Mb 

Sensitivity:  ~96% patients carry either the 1.5Mb or 3Mb deletion and will be 
detected using this assay.  Mutations of TBX1 have also been described. 

Reference:     Lancet. 362:1366­1373, 2003. 

Digeorge Region 2 (10p14) 

2 probes for 10p14:  GATA3         at 8.10Mb 
                     DKFZp566L0824 at 10.548966Mb 

Sensitivity:  2 Critical region s :– 

1. DGCR2 with cardiac defect and T cell deficiency  is defined as between D10S547 
(10.550410Mb) and D10S585 (11.25Mb). 
2. HDR1 with hypoparathyroidism, deafness and renal dysplasia is defined as between 
D10S189 (6.72Mb) and D10S226 (8.92Mb). 

Whilst the DKFZp566L0824 probe lies outside the defined critical region it will 
detect the majority of cases as only one published case has a deletion not covered by 
this probe. 

The GATA3 probe lies within the HDR1 critical region and therefore will detect all 
deletions associated with HDR. 

References:  European Journal of Human Genetics. 6, 213–225, 1998. 
             J Med Genet.  37:33­37, 2000. 
             J Mol Med.  80:431–442, 2002. 

1p36 Deletion Syndrome (1p36.33) 

3 probes:      TNFRSF4 at 1.15Mb 
               GNB1    at 1.76Mb 
               GABRD  at 1.96Mb
Sensitivity:  Will detect up to 98% of 1p36 deletions 

Reference:     Am. J. Hum. Genet. 72:1200–1212, 2003 

2p16.1 Deletion Syndrome (2p16.1) 

2 probes:      FANCL          at 58.45Mb 
               REL            at 61.15Mb. 

Common region spans RP11­426N8 (57.68Mb) and RP11­470L12 (61.58Mb). 

Sensitivity:  Will detect all occurrences of 2p16.1 deletion described in the 

Reference:     J. Med. Genet. 45:122­124, 2008 

3q29 Deletion Syndrome (3q29) 

2 probes:      DGL1 at 196.79Mb 
               DGL1 at 197.02Mb 

Common deletion and duplication spans 195.92Mb to 197.30Mb.  Other cases of 
duplication described are bigger and cover this region. 

Sensitivity:  Will detect all reported occurrences of 3q29 deletion/duplication. 

Reference:     Am. J. Hum. Genet. 77:154–160, 2005 
               Cytogenet Genome Res. 123:65–78, 2008 

WHS 4p16.3 

2 probes:      LETM1  at 1.84Mb 
               WHSC1 at 1.93Mb. 

Sensitivity:  The majority of Wolf­Hirschhorn deletions are terminal and will be 
detected by this assay.  A small number of interstitial deletions may not be detected 
by these probes. 

References:  Am. J. Hum. Genet. 72:590 –597, 2003 
             J Med Genet.  45:71­80, 2008.
Cri du Chat Syndrome (5p15.3) 

2 probes:      TERT  at 1.28Mb 
               CRR9p at 1.34Mb 

Sensitivity:  ~91.25% deletions are terminal and will be detected using these 
probes.  ~8.75% patients have been described with an interstitial deletion, which will 
not be picked up by this assay. 

References:  J Med Genet.  38:151–158, 2001 
             Am. J. Hum. Genet. 76:312–326, 2005 

Sotos Syndrome (5q35.3) 

2 probes:      NSD1 Exon17  at 176.68Mb 
               NSD1 Exon 22 at 176.72Mb 

Sensitivity:  10­15% of NSD1 abnormalities in Europe and US are microdeletions 
(>50% in Japan), which will be detected with this assay.  Intragenic mutations ac 
count for the remainder of patients. 

References:  Am. J. Hum. Genet. 77:193–204, 2005 
             European Journal of Human Genetics. 15, 264–271, 2007 

Williams Syndrome (7q11.23) 

3 probes:      ELN  at 73.44Mb 
               ELN  at 73.47Mb 
               LIMK1 at 73.51Mb 

Sensitivity:  Up to 94% caused by deletion of ELN, which will be detected by this 
assay.  Balanced rearrangements with breakpoints within ELN may account for other 
patients, which would be detected by G­banding. 

References:  Human Molecular Genetics.  Vol. 12, Review Issue 2, 2003. 
             Am. J. Hum. Genet. 59: 781­792, 1996. 

Langer­Giedion Syndrome (8q24) 

2 probes:      TRPS1 at 116.68Mb 
               EIF3S3 at 117.66Mb
Sensitivity:  Phenotype in all cases is due to deletion of both TRPS1 and EXT1 
genes, which will be detected by this assay.  There is one report of a deletion that does 
not encompass TRPS1 but does cover EIF3S3. 

Reference:  Am J Med Genet A 146A:1587–1592, 2008 
9q22.3 Deletion Syndrome (9q22.3) 

2 probes:      TGFBR1 at 101.908Mb 
               TGFBR1 at 101.910Mb 

Sensitivity:  All deletions described encompass the TGFBR1 gene.  Therefore all 
cases described in literature will be detected by this assay. 

References:  European Journal of Human Genetics. 14, 759– 767, 2006 

WAGR Syndrome (11p13) 

1 probe:       PAX6 at 31.82Mb. 

Sensitivity:  ~66.6% patients with WAGR carry a deletion of PAX6 which will be 
detected with this probe.  Due to the lack of a probe for WT1, FISH analysis is also 

Reference:     Am. J. Hum. Genet. 71:1138–1149, 2002 

Prader­Willi/Angelman Syndrome (15q11.2) 

4 probes:      NDN             at 23.93Mb 
               SNRPN           at 25.10Mb 
               SNRPN           at 25.21Mb 
               UBE3A           at 25.62Mb. 

Sensitivity:  70­75% Prader­Willi patients carry a deletion, which will be detected 
by this assay.  The remaining cases are caused by maternal UPD15 or an imprinting 

                ~70% Angelman patients carry a deletion, which will be detected by 
this assay.  The remaining cases are caused by paternal UPD15 or an imprinting 

         In all suspected cases of Prader­Willi/Angelman syndrome molecular genetic 
testing is recommended. 

15q24.1 Deletion Syndrome (15q24.1) 

2 probes:      SEMA7A          at 74.71Mb 
               CYP1A1          at 75.01Mb.
Sensitivity:  The minimal deleted region for this syndrome spans ~74.50­76.00Mb 
therefore these probes will detect all described occurrences of this deletion. 

Reference:    Human Molecular Genetics .  16(5):567–572, 2007. 

Rubinstein­Taybi Syndrome (16p13.3) 

1 probe:      CREBBP at 3.93Mb (Exon 1) 

Sensitivity:  Deletions of CREBBP account for ~10% RSTS cases.  Partial 
deletions of CREBBP are common and this probe will only detect ~50% deletions. 
Intragenic mutations of CREBBP and mutations of EP300 accounting for the vast 
majority of cases.  This assay cannot exclude a diagnosis of RSTS. 

Reference:    J. Med. Genet.  37:168­176, 2000 . 

Miller­Dieker Syndrome (17p13.3) 

2 probes:     PAFAH1B1 (LIS1) at 2.568Mb 
              PAFAH1B1 (LIS1) at 2.570Mb 

Sensitivity:  All cases of Miller­Dieker show deletions which encompass 
PAFAH1B1 along with other genes.  These MLPA probes will therefore detect all 
cases of Miller­Dieker syndrome.  All known duplications of this regions also 
encompass PAFAH1B1 and will be detected with this assay. 

References:  Am. J. Hum. Genet. 72:918–930, 2003 
             J Med Genet.  46:703­710, 2009. 

Smith­Magenis Syndrome (17p11.2) 

3 probes:     RAI1           at 17.58Mb 
              LRRC48         at 17.89Mb 
              LLGL1          at 18.14Mb 

Sensitivity:  ~90.5% patients carry a deletion which encompasses RAI1.  Duplication 
sizes are reciprocal.  This assay will detect all deletions and duplications of this 
region.  ~9.5% patients carry an intragenic mutation of RAI1, which will not be 

Reference:    Clin Genet.  71: 540–550, 2007.
NF1 (17q11.2) 

2 probes:     NF1 at 29.53Mb 
              NF1 at 29.55Mb 

Sensitivity:  5­20% NF1 patients carry a micro­deletion, which encompasses NF1, 
these will be detected with this assay.  The remainder of patients carry a point 
mutation of NF1. 

Reference:    Am. J. Hum. Genet. 75:410–423, 2004 

17q21.31 Deletion Syndrome (17q21.31) 

3 probes:     CRHR1         at 43.91Mb 
              MAPT          at 44.09Mb 
              MAPT          at 44.10Mb 

Sensitivity:  Critical deletion region encompasses MAPT gene.  This assay will 
detect all described occurrences of this deletion. 

Reference:    J Med Genet.  45(11):710­20, 2008. 

Phelan­McDermid Syndrome (22q13) 

2 probes:     SHANK3 at 51.14Mb 
              SHANK3 at 51.16Mb 

Sensitivity:  Critical deletion region encompasses  3’ end of SHANK3 gene.  This 
assay will detect all known cases of this deletion.  Some intragenic mutations of 
SHANK3 have been described associated with autistic spectrum disorder. 

References:  Hum Genet.  110 :439–443, 2002. 
             Nat Genet.  39(1): 25–27, 2007. 

MECP2 Duplication Syndrome (Xq28) 

3 probes:     MECP2 at 153.290Mb 
              MECP2 at 153.296Mb 
              MECP2 at 153.364Mb 

Sensitivity:  Minimum duplicated region encompasses entire MECP2 gene and will 
therefore be detected by this assay.
Reference:     Am. J. Hum. Genet. 77:442–453, 2005. 


2 probes:      TNKS            at 9.44Mb 
               GATA4           at 11.57Mb 

Sensitivity:  Commonly deleted region spans ~8.92­11.48Mb, therefore these 
probes will detect the common deletion.  Mutations of GATA4 have also been 
implicated with heart defects. 

Reference:     Am. J. Hum. Genet. 64:1119–1126, 1999. 

Distal 22q11.2 

2 probes:      PPIL2 at 22.05Mb 
               SMARCB1 at 24.14Mb 

Sensitivity:  Abnormalities in this region have not been well characterised.  Studies 
with MLPA have shown the majority of abnormalities in this region to encompass 
PPIL2 and sometimes SMARCB1. 

Reference:     HUMAN MUTATION.  29(3):433­440, 2008. 

Explanation of riders on reports. 

1. The P245 microdeletion kit from MRCHolland ( contains probes 
to detect deletions and duplications of the following regions or syndromes: 

 1p36; 2p16; 3q29; Wolf­Hirschhorn; Cri­du­chat; Sotos; Williams; Langer­Gideon; 
9q22; 10p14; WAGR; Prader­Willi/Angelman Syndrome; 15q24; Rubinstein­Taybi; 
Smith­Magenis; Miller­Dieker; NF1; 17q21; DiGeorge; 22qter; Xq28 (MECP2). 

The kit contains more than 40 separate probes and is designed to aid in the diagnosis 
of 24 recognised micro­deletion syndromes. Hence, the kit contains several probes for 
each locus. 

 2. Modifications of the kit enable the detection of deletions and duplications of distal 
22q11.2 and 8p23.1. 

At the request of our clinicians and in conjunction with MRC Holland, we have 
modified the P245 kit to include probes for 22q11.2 and 8p23.1.
3. This test is unlikely to detect small intragenic mutations, which account for a 
proportion of some of the above mentioned syndromes. 

The kit is designed to assist in the diagnosis of micro­deletion syndromes, however, a 
normal result does not mean the patient does not have the queried syndrome e.g. 70% 
of Prader­Willi syndrome have a deletion detectable by the P245 kit – the remaining 
30% of patients would not be detected by this kit. This point should be reflected in the 
text of the report. 

4. MLPA is unable to detect mosaicism at levels below 50%. 

The presence of  mosaicism might go undetected by the test as the presence of normal 
cells can mask the presence of abnormal cells. 

3.  MLPA is unable to detect balanced rearrangements. 

The technique relies on comparing quantities of DNA from a patient against a 
control. A patient with a balanced rearrangement has a change in the order of their 
DNA but not a change in quantity therefore patients with balanced rearrangements 
are not detected by the test.

To top