Singlet Oxygen Quencher dari ekstrak buah pinang _Areca catechu by malj

VIEWS: 993 PAGES: 23

									 Singlet Oxygen Quencher dari ekstrak buah pinang (Areca catechu) untuk
             melindungi kerusakan lemak akibat fotooksidasi

                              Sri Raharjo1 dan Edi Suryanto2
                     1
                    Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil Pertanian
          Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
                              Email : sraharjo_ugm@yahoo.com

                                      2
                                     Jurusan Kimia
                   Fakultas MIPA, Universitas Sam Ratulangi, Manado


                                          ABSTRAK



       Penelitian ini dimaksudkan untuk (1) mendapatkan ekstrak biji buah pinang yang
memiliki kemampuan untuk menghambat reaksi fotooksidasi, (2) mengisolasi dan
mengidentifikasi senyawa dalam ekstrak tersebut, (3) mengetahui mekanisme dan
kinetika singlet oxygen quenching dari salah satu senyawa dalam ekstrak biji buah
pinang, dan (4) mengembangkan kombinasi antifoto-oksidan dari ekstrak biji pinang
yang efektif melindungi lemak dari kerusakan foto-oksidatif.
       Ekstrak etanol biji buah pinang telah diuji dalam sistem reaksi foto-oksidasi dan
menunjukkan kemampuan mampu menghambat reaksi foto-oksidasi pada minyak sawit
yang dimurnikan dan disensitasi oleh eritrosin. Ekstrak sequensial etanol biji pinang
difraksinasi dan dilakukan identifikasi terhadap ekstrak tersebut menggunakan LC-MS
dan diketahui komponen penyusunnya terdiri dari katekin (BM 291), procyanidin (BM
563), and robinetinidol (BM 866). Mekanisme quenching dari katekin adalah bereaksi
dengan oksigen singlet dan tidak bereaksi dengan sensitiser yang tereksitasi.
Konstanta laju kuensing oksigen singlet total (kq + kox – Q) dari katekin adalah 3,32 x 106
M-1s-1. Hasil optimasi formula anti-fotooksidan menunjukkan bahwa ekstrak biji pinang
sendiri memiliki kemampuan menghambat foto-oksidiasi yang efektif. Jika ekstrak biji
buah pinang 500 ppm dikombinasikan dengan asam askorbat 500 ppm, dengan atau
tanpa asam sitrat 250 ppm ternyata memberikan efek penghambatan foto-oksidasi yang
tidak berbeda nyata. Dengan kata lain singlet oxygen quenching pada ekstrak biji pinang
tidak bersinergi dengan vitamin C maupun asam sitrat.


Kata kunci : Biji pinang, oksigen singlet, foto-oksidasi, antioksidan



                                                                                         1
                                   1. Latar Belakang


1.1. Latar belakang
       Konsumen dewasa ini makin menuntut tersedianya produk makanan yang bukan
hanya menyehatkankan dan aman dikonsumsi, namun juga faktor rasa dan aroma akan
selalu menjadi faktor penentu kesukaannya. Bisa dikatakan bahwa salah satu insentif
utama yang ingin diperoleh manusia ketika makan adalah rasa dan sekaligus aroma
(flavor). Oleh karena itu segala upaya telah dan akan selalu dilakukan oleh industri
makanan untuk menjaga agar mutu produknya terhindar dari kerusakan rasa dan
aromanya. Produk makanan yang lezat biasanya disebabkan oleh kandungan lemak
dan zat-zat lain yang memberi citarasa. Produk hewani seperti daging, ikan, susu, dan
telur dikenal sebagai bahan makanan yang berprotein dan berlemak. Bahkan pada
kelompok serealia sekalipun kadar lemaknya rendah namun sudah bisa menimbulkan
aroma yang tidak sedap (bau tengik atau apek) terutama selama penyimpanan.
Kerusakan pada aroma dan rasa bisa berakibat produk tersebut tidak akan dibeli atau
disukai oleh konsumen.
       Selama ini yang sudah banyak diketahui sebagai penyebab kerusakan aroma
dan rasa adalah terjadinya reaksi oksidasi pada lemak tidak jenuh oleh oksigen di udara
dan didukung oleh adanya panas, baik selama pengolahan maupun penyimpanan.
Namun yang belum banyak disadari adalah terjadinya reaksi oksidasi yang diinduksi
oleh adanya cahaya atau disebut fotooksidasi. Fotooksidasi ini melibatkan oksigen
singlet yang dihasilkan dari oksigen triplet (molekul oksigen yang ada di udara) dengan
bantuan suatu zat yang berperan sebagai sensitiser. Sensitiser berfungsi mengubah
energi cahaya menjadi energi kimia untuk memulai reaksi oksidasi. Pada bahan
makanan ternyata terdapat beberapa zat yang bisa berperan sebagai sensitiser yaitu
misalnya: riboflavin, mioglobin, klorofil dan pigmen lainnya. Oksidasi oleh oksigen singlet
ini bisa terjadi bahkan pada suhu rendah sekalipun, karena energi aktivasinya rendah.
       Ini menjadi masalah yang sangat serius ketika produk makanan biasanya diolah
dan dipajang (display) dibawah cahaya yang bersumber dari lampu fluoresen. Kemasan
yang menarik dan pencahayaan yang memadai memberikan daya tarik tersendiri bagi
konsumen untuk membeli, namun hal ini jika tidak dikendalikan juga memicu terjadinya
reaksi oksidasi oksigen singlet yang bisa menyebabkan kerusakan aroma dan rasa,
serta berkurangnya vitamin. Dampak reaksi oksidasi oksigen singlet ini makin besar


                                                                                         2
terutama pada produk berbentuk serbuk (powder) dan disimpan dalam waktu beberapa
bulan.


1.2. Potensi lokal dan nilai sejarah buah pinang
         Pinang (Areca catechu) banyak tumbuh dan buahnya diperdagangkan di wilayah
Sumatra, Kalimantan, dan bahkan di sebagian wilayah timur Indonesia. Buah pinang
yang secara tradisional sering digunakan untuk makan sirih, diperlukan oleh dunia baik
dalam bentuk segar maupun kering (dried bettle nuts). Senyawa dalam ekstrak buah
atau biji pinang diolah dan telah digunakan untuk bahan pembuatan cat, penyamak kulit,
dan campuran obat-obatan. Pasar ekspor biji pinang Indonesia dalam bentuk utuh,
belah, maupun giling     antara lain India, Pakistan dan Sri Lanka. Pemerintah India
memberikan ketentuan baru mengenai prosedur impor biji pinang untuk menjaga
kestabilan pasar dan pertimbangan efiensi dan kualitas. Adanya senyawa di dalam buah
atau biji pinang yang bisa bermanfaat untuk menghambat atau mencegah kerusakan
mutu produk makanan maupun kosmetika belum banyak diketahui dan dipublikasi.


1.3. Dasar teori / Kajian Pustaka

         Kelompok peneliti antioksidan di Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil Pertanian,
Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gadjah Mada selama lima tahun terakhir ini
telah mengidentifikasi sumber-sumber antioksidan alami yang berasal dari sumber
nabati. Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya sudah mendapatkan ekstrak singlet
oxygen quencher (SOQ) atau antioksidan alami dari beberapa sumber antara lain buah
andaliman (Edi Suryanto et al, 2004a; 2004b), dan rempah-rempah (Sri Raharjo and Edi
Suryanto, 2005). Ekstrak antioksidan tersebut telah dipastikan memiliki kemampuan
menghambat terjadinya foto-oksidasi pada beberapa model sistem (Yohana SKW. et al.,
2004, Lydia N.L. et al, 2004 ). Kinetika dan mekanisme reaksi quenching oksigen singlet
yang dihasilkan melalui foto-oksidasi pada medium minyak nabati sudah diketahui
(Posman Sibuea et al., 2004a; 2004b). Selanjutnya yang menjadi arah penilitian okidasi
lemak dan antioksidasi pada saat ini adalah mempelajari peran oksigen singlet terhadap
kerusakan oksidasi yang mengarah pada penurunan mutu produk makanan selama
pascapanen, pengolahan, dan penyimpanan.
         Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengatasi masalah reaksi oksidasi lemak
oleh oksigen di udara misalnya dengan menggunakan pengemasan vakum,



                                                                                     3
pendinginan, dan penambahan antioksidan sintetis (misal : BHT, BHA, TBHQ, PG)
maupun alami (misal: tokoferol, asam askorbat, karotenoid). Namun penggunaan bahan
sintetis cenderung dihindari oleh konsumen dan hasilnya belum bisa sepenuhnya efektif
mencegah terjadinya kerusakan oksidatif, khususnya reaksi fotooksidasi. Oleh karena
itu perlu dibuktikan bahwa reaksi fotooksidasi bisa memperparah tingkat kerusakan
oksidatif pada produk makanan terutama selama penyimpanan baik pada suhu kamar
maupun suhu rendah. Selanjutnya mendapatkan senyawa alami yang bisa berfungsi
sebagai penangkap oksigen singlet (Singlet Oxygen Quencher / SOQ). Penelitian kami
sebelumnya telah menunjukkan bahwa senyawa flavonoid dalam ekstrak buah
andaliman (Zanthoxylum acanthopodium) memiliki kemampuan sebagai SOQ dan bisa
menghambat reaksi fotooksidasi pada produk daging dan ikan (Edi Suryanto, 2001).
Namun ekstrak yang diperoleh rendemennya masih rendah dan masih terikut aroma dan
pigmennya. Oleh karena itu penelitian selanjutnya perlu diarahkan untuk mendapatkan
ekstrak yang memiliki kemampuan sebagai SOQ yang lebih tinggi, rendemen yang lebih
banyak, tidak berwarna, dan tidak berbau.
       Jika oksigen triplet diaktivasi melalui pemberian cahaya, maka energi yang
diserap tersebut digunakan mengubah oksigen triplet yang semula memiliki dua elektron
yang tidak berpasangan dan arah spin paralel menjadi elektron terluarnya berpasangan
dengan arah spin berlawanan. Dalam kondisi seperti itu oksigen disebut dalam bentuk
singlet yang elektron terluarnya sudah berpasangan dan arahnya saling berlawanan.
Kondisi ini menyebabkan oksigen singlet bersifat lebih mudah bereaksi dengan molekul
organik pada bahan makanan yang biasanya juga memiliki elektron terluar berpasangan
dengan spin berlawanan. Sebagai contoh laju reaksi oksigen triplet dan oksigen singlet
dengan asam linoleat adalah 8,9 x 101 M-1S-1 dan 1,3 x 105 M-1S-1 (Rawls and
VanSanten, 1970). Dengan demikian, laju reaksi oksigen singlet dengan asam linoleat
sekitar 1450 kali lebih cepat dibandingkan oksigen triplet dengan asam linoleat.
       Hasil dari penelitian ini diharapkan akan berupa tiga hal. Pertama, diperolehnya
metoda preparasi untuk menghasilkan ekstrak biji buah pinang yang memiliki
kemampuan untuk menghambat reaksi fotooksidasi. Kedua, diperolehnya formula
antifoto-oksidasi dari ekstrak biji buah pinang yang efektif melindungi produk makanan
dari kerusakan oksidatif. Ketiga, diketahuinya mekanisme dan kinetika singlet oxygen
quenching dari salah satu senyawa dalam ekstrak biji buah pinang.
       Metoda ekstraksi buah atau biji pinang kering yang dirancang menggunakan
pelarut secara sequensial pada suhu kamar diharapkan akan mendapatkan ekstrak



                                                                                     4
yang didalamnya mengandung senyawa yang perpotensi sebagai anti-fotooksidasi
dengan rendemen yang cukup tinggi. Penggunaan metoda ekstraksi yang dilanjutkan
dengan fraksinasi dan upaya untuk menghilangkan bau yang tidak dikehendaki serta
menghilangkan warna diharapkan akan menghasilkan ekstrak buah atau biji pinang
yang bisa dikombinasikan dengan bahan lain.
              Sejauh ini yang telah banyak dipublikasikan sebagai antioksidan alami
antara lain ekstrak dari rimpang, teh, bumbu-bumbu, buah, dan bahan sisa produk
hewani seperti cangkang udang. Ektrak tersebut selama ini hanya diklaim sebagai zat
yang bisa menghambat reaksi autooksidasi, bukan foto-oksidasi. Hal ini dibuktikan
dengan cara-cara pengujian aktivitas antioksidannya menggunakan efek pemanasan
atau efek foto-oksidasi tidak dikendalikan. Pada hal foto-oksidasi kemungkinan
terjadinya sangat tinggi dan jika berlangsung maka tidak memerlukan adanya panas dan
secara cepat bisa menginisiasi proses kerusakan aroma pada makanan.


                           2. Tujuan Penelitian dan Manfaat


       Penelitian ini bertujuan (1) mendapatkan ekstrak biji buah pinang yang memiliki
kemampuan      untuk    menghambat      reaksi   fotooksidasi,   (2)   mengisolasi   dan
mengidentifikasi senyawa dalam ekstrak tersebut, (3) mengetahui mekanisme dan
kinetika singlet oxygen quenching dari salah satu senyawa dalam ekstrak biji buah
pinang, dan (4) mengembangkan kombinasi antifoto-oksidan dari ekstrak biji pinang
yang efektif melindungi lemak dari kerusakan foto-oksidatif.
       Formula antifoto-oksidasi yang mengandung bahan alami memiliki peluang
digunakan oleh industri pangan maupun sebagai bahan kosmetika alami yang banyak
dibutuhkan saat ini. Penggunaan formula antifoto-oksidasi bisa untuk mengatasi
masalah oksidasi lemak maupun protein oleh oksigen singlet yang menimbulkan flavor
(aroma dan rasa) yang tidak disukai terutama selama penyimpanan yang terpapar oleh
cahaya. Penggunaan ekstrak bahan alam yang memiliki kemampuan sebagai singlet
oxygen quencher (SOQ) untuk kosmetika sangat sesuai untuk perlindungan kesehatan
kulit dari paparan langsung cahaya matahari maupun lampu fluoresen.
       Dengan diketemukannya cara untuk mengendalikan faktor-faktor pemicu foto-
oksidasi yang antara lain melalui penggunaan singlet oxygen quencher bisa menjaga
umur simpan produk menjadi lebih lama, memperluas distribusi dan penjualan, dan
meminimalkan produk atau bahan pangan yang dibuang karena aromanya sudah



                                                                                       5
mengalami kerusakan. Pihak yang relevan menggunakan temuan dari penelitian ini
bukan hanya industri pengolahan makanan namun juga industri kosmetika.


                              3. METODA PENELITIAN


3.1. Ekstraksi buah pinang secara sekuensial
       Buah pinang dan bijinya diperoleh dalam bentuk kering dari perkebunan di
Sumatra Utara. Buah pinang dikupas dipisahkan bijinya dan dikeringkan dengan
penjemuran. Biji buah pinang kemudian digiling menggunakan sampel mill dan diayak
dengan ayakan 40 mesh. Selanjutnya dilakukan ekstraksi senyawa yang memiliki
potensi sebagai singlet oxygen quencher menggunakan urutan pelarut seperti pada
Gambar 1.
       Ekstraksi biji buah pinang dilakukan secara sekuensial dengan menggunakan
pelarut heksana dan etanol. Pelarut pertama digunakan dengan tujuan untuk
menggurangi lemak yang terdapat di biji buah pinang disamping mungkin adanya
senyawa-senyawa yang berfungsi sebagai sensitiser. Pelarut etanol digunakan karena
diperkirakan dalam pelarut ini terdapat senyawa-senyawa fenolik yang dapat berfungsi
sebagai antioksidan dan antifotooksidatif. Sebanyak 20 g serbuk biji buah pinang
diekstraksi dengan cara soxhlet dengan pelarut heksana (200 mL) selama 6 jam. Ampas
dari ekstrasi heksana kemudian dikering anginkan. Setelah kering dilakukan ekstraksi
kembali dengan cara maserasi dengan menggunakan 3 x 200 mL etanol 95 % selama 1
jam. Prosedur di atas dilakukan sebanyak 2 kali ulangan. Selanjutnya ekstrak heksana
(EH) dan ekstrak sekuensial etanol (ESE) dievaporasi dengan rotary evaporator. Ekstrak
yang diperoleh disimpan dalam suhu -20oC untuk dianalisis.




                                                                                    6
                                          20 g serbuk biji buah pinang

                                                              - diekstraksi dengan 2 x 200 mL heksana
                                                              - evaporasi




                    residu                                                             ekstrak heksana

                        - ekstraksi kedua dengan 2 x 200 mL aseton
                        - evaporasi




ekstrak sequential                                   residu
 heksana-aseton
                                                           - ekstraksi ketiga 2 x 200 mL etanol
                                                           - evaporasi




                        ekstrak sequential                                    residu
                      heksana-aseton-etanol

                                     Dikromatografi kolom dengan silika gel
                                     (MeOH-EtOAc-CH3COOH 8:2:0,1)



F-1           F-2            F-3           F-4            F-5             F-6

      Gambar 1. Skema ekstraksi sequential dan fraksi-fraksi antioksidan dari buah pinang


 3.2. Pengujian kemampuan singlet oxygen quenching (SOQ)


           Pengujian terhadap kemampuan ekstrak biji pinang dalam menghambat reaksi
 foto-oksidasi dilakukan dengan menggunakan model pencahayaan lampu fluoresen
 maupun lampu pijar. Kedua sumber cahaya ini dipilih karena keduanya yang paling
 sering digunakan untuk menerangi ruangan atau rak-rak penjualan produk makanan
 segar/mentah maupun yang telah dimasak.



                                                                                                        7
       Ekstrak buah dan biji pinang masing-masing dengan konsentrasi 100, 200, 300,
400, dan 500 ppm dicampurkan kedalam minyak sawit yang telah dimurnikan dan diberi
20 ppm riboflavin sebagai sensitizer. Sebanyak 15 mL sampel minyak diambil dan
dimasukkan ke dalam botol serum berukuran 30 mL yang dilengkapi dengan penutup
ulir. Sampel tersebut kemudian diletakkan dan disimpan di dalam kotak yang telah
dilengkapi dengan lampu fluresen ataupun lampu pijar dengan intensitas cahaya 4.000
lux. Angka peroksida diukur setiap interval waktu 1 jam selama 6 jam dengan metoda
AOAC (1980).


3.3. Fraksinasi dan Identifikasi komponen dalam ekstrak etanol biji pinang


       Fraksinasi ESE dilakukan menggunakan kolom kromatografi yang berdiameter
1,5 cm dengan panjang kolom 50 cm dengan pelarut metanol. Penyerap (absorben)
yang digunakan adalah silika gel G-60 sebanyak 15 g. Sebelum dibuat bubur silika
diaktifkan terlebih dahulu pada suhu 150oC selama 24 jam. Selanjutnya didinginkan
dalam eksikator agar tidak mengikat air. Setelah dingin, alumina dibuat bubur dengan
menggunakan pelarut metanol. Ke dalam kolom tersebut dimasukkan glass wool
sebagai penyaring dari kolom dan pelarut dengan ketinggian seperempat kolom. Bubur
silika dimasukkan secara perlahan-lahan membentuk suatu kolom yag kompak. Pada
waktu pembuatan kolom, kran pada kolom dibuka untuk mengalirkan pelarut.
Selanjutnya kran ditutup, didiamkan selama 24 jam agar silika gel me memadat.
Sebelum ESE (2 g) dimasukkan ke dalam kolom, di atas kolom dilapisi dengan glass
wool terlebih dahulu. Fraksi-fraksi yang diperoleh ditampung dalam 80 botol, masing-
masing sebanyak 5 mL. Fraksi yang mempunyai puncak absorbansi (λ= 340 nm) yang
sama digabung dan diuapkan pelarutnya.
       Pemisahan fraksi 2 dengan HPLC menggunakan metode Wang dan Lee (1996)
yang dimodifikasi. Secara singkat, kolom HPLC yang digunakan Lichrospher 100 RP-18
(panjang 25 cm; diameter 4 mm). Pelarut yang digunakan adalah asam asetat 1 %
(pelarut A) dan acetonitril (pelarut B) untuk digunakan untuk elusi gradien. Gradien linear
dimulai dari 100 % pelarut A dan terakhir dengan 100 % pelarut B sekitar 60 menit.
Kecepatan alir dijaga 0,8 mL/menit dan panjang gelombang pada detektor UV adalah
280 nm. Senyawa standar yang digunakan adalah katekin (BDH).




                                                                                         8
3.4. Mekanisme dan kinetika singlet oxygen quenching


       Minyak sawit (refined-bleached-deodorized) dilewatkan kolom kromatografi yang
berisi 120 g silicic acid (100 mesh, Mallinkrodt) yang telah diaktivasi, 40 g campuran
arang aktif dan celite (2:1) (Sigma Chemical Co.), 120 g serbuk gula dan celite (2:1), dan
120 g silicic acid yang telah diaktivasi. Kolom kromatografi ini dibungkus dengan
aluminium foil untuk menghindari pengaruh cahaya terhadap minyak yang dimurnikan.
Hasil yang diperoleh disebut sebagai minyak yang telah dimurnikan.
       Kadar tokoferol dianalisis menggunakan metoda HPLC (Carpenter 1979) dan
kadar karotenoid ditera dengan metoda spektofotometri (Proctor and Snyder, 1987).
Pengujian ini dimaksudkan untuk memastikan kadar antioksidan alami yang mungkin
terdapat pada minyak sudah bisa diminimalkan.
       Mekanisme quenching dan kinetika singlet oxygen quenching (SOQ) dari tanin di
dalam model foto oksidasi minyak sawit yang telah dimurnikan ditentukan metoda
kinetika steady-state dari Foote and Denny (1968). Sampel asam linoleat sebanyak
0.025, 0.05, 0.067, 0.10, atau 0.20 M dalam pelarut metilen klorida yang mengandung
20 ppm riboflavin dicampur dengan tanin dengan konsentrasi 0.025 x 10-5, 0.05 x 10-5,
0.75 x 10-5, atau 1.0 x 10-5 M.
       Sampel dari campuran tersebut sebanyak 15 mL diambil dan dimasukkan ke
dalam botol serum berukuran 30 mL. Sampel ini dipersiapkan masing-masing dua botol,
ditutup rapat sehingga tidak ada udara masuk, dan diletakkan dalam kotak dengan
sumber cahaya 4.000 lux selama 2 jam (Lee and Min, 1990). Kinetika dan mekanisme
quenching oksigen singlet ditetapkan berdasarkan pengukuran angka peroksida.


3.5. Formula antifoto-oksidasi dan aplikasinya pada minyak kacang tanah


       Minyak kacang tanah dipilih untuk media pengujian foto-oksidasi karena
mengandung proporsi asam lemak tidak jenuh yang relatif tinggi. Sebelum melakukan
pengujian formulasi ekstrak pinang terhadap fotooksidasi minyak kacang tanah, maka
dilakukan pemurnian minyak. Minyak kacang tanah yang dimurnikan dengan
menggunakan teknik kolom kromatografi yang berisi asam silikat, campuran arang aktif-
celite, serbuk gula, celite dan asam silikat yang disusun secara seri.
       Sebanyak 100 g minyak kacang tanah dilewatkan dengan kromatografi kolom
yang berisi 120 g asam silikat (100 mesh) yang telah diaktivasi, 40 g campuran arang



                                                                                        9
aktif dan celite (2:1), 120 g serbuk gula dan celite (2:1), dan 120 g asam silikat. Kolom
kromatografi ini dibungkus dengan aluminium foil untuk menghindari pengaruh cahaya
terhadap minyak yang dimurnikan. Hasil yang diperoleh disebut sebagai minyak kacang
tanah telah dimurnikan (MKTM). Analisis kimia yang dilakukan disini adalah asam lemak
bebas, angka peroksida, -karoten dan -tokoferol. Angka peroksida dan asam lemak
bebas ditentukan berdasarkan metoda AOCS (1980). Untuk -tokoferol ditentukan
dengan cara HPLC (Carpenter, 1979) dan -karoten ditentukan secara spektrofotometer
(Cagampang and Rodrigues, 1980).
       Formulasi dilakukan dengan mencampurkan minyak kacang tanah yang telah
dimurnikan dengan ekstrak pinang. vitamin C, dan asam sitrat dalam berbagai
konsentrasi seperti yang tertcantum pada Tabel 1.


Tabel 1. Komposisi perlakuan untuk optimasi kombinasi anti-foto oksidan yang
mengandung ekstrak biji pinang, vitamin C, dan asam sitrat.


      Perlakuan No.   Ektrak Biji Pinang (ppm)   Vitamin C (ppm)   Asam Sitrat (ppm)
             1                     0                   500               500
             2                  1000                   250                0
             3                     0                   500                0
             4                     0                    0                500
             5                  1000                   500               500
             6                   500                   500               250
             7                     0                   250               250
             8                   500                   250               500
             9                     0                    0                 0
            10                  1000                    0                250
            11                  1000                   500               250
            12                   500                   500                0
            13                   500                    0                 0
            14                  1000                   250               500
            15                     0                   250                0

       Efek kombinasi ekstrak dengan vitamin C maupun asam sitrat terhadap
fotooksidasi diukur menggunakan konsentrasi yang telah ditentukan di atas dalam
minyak kacang tanah murni 10 % yang dipersiapkan dalam metilen klorida dan
mengandung 100 ppm eritrosin sebagai sensitiser (Lee et al., 1997). Sampel dari
campuran tersebut sebanyak 10 mL diambil dan dimasukkan ke dalam botol serum yang
berukuran 30 mL yang dilengkapi dengan penutup karet dan aluminium foil. Botol
tersebut kemudian diletakkan dan disimpan di dalam kotak (70 x 50 x 60 cm) dengan


                                                                                       10
intensitas cahaya 4.000 lux. Angka peroksida diukur selama 5 jam dengan metoda
AOCS (1990).


                           4. HASIL DAN PEMBAHASAN


4.1. Ekstrak biji buah pinang, kadar total fenol, dan tanin


        Ekstraksi biji buah pinang dengan pelarut pertama heksana menghasilkan
rendemen 13,9  2,7 % (b/b) dan ekstraksi lebih lanjut menggunakan pelarut kedua
etanol menghasilkan rendemen 40,7  3,4 % (b/b). Jika bubuk biji pinang diekstrak
dengan pelarut pertama dengan etanol ternyata menghasilkan rendemen yang lebih
sedikit. Ini menunjukkan bahwa komponen lain yang bersifat menghalangi ekstraksi
etanol sudah bisa dikurangi dengan pelarut heksana, sehingga bisa diperoleh rendemen
lebih tinggi.
        Analisis terhadap ekstrak heksana dan ekstrak sekuensial etanol menunjukkan
kadar total fenol masing-masing 3,4 mg/100 g dan 64,5 mg/100 g. Sedangkan analisis
kadar tanin terkondensasi pada ekstrak heksana dan ekstrak sekuensial etanol
menunjukkan masing-masing 6,1 mg/100g dan 38,2 mg/100g.

4.2. Efek ekstrak biji pinang terhadap fotooksidasi minyak sawit


        Ekstrak heksana biji pinang ketika ditambahkan pada minyak sawit yang telah
dimurnikan ternyata tidak memberikan perlindungan terhadap reaksi fotooksidasi
(Gambar 2). Bahkan penambahan ekstrak heksana biji pinang justru meningkatkan
angka peroksida selama 6 jam reaksi fotooksidasi. Ini menunjukkan bahwa senyawa
yang terdapat dalam ekstrak heksana tersebut banyak mengandung sensitiser,
sehingga justru meningkatkan intensitas reaksi fotooksidasi. Sedangkan jika ekstrak
sekuensial etanol yang ditambahkan pada minyak sawit ternyata secara jelas
memberikan efek penghambatan laju reaksu fotooksidasi (Gambar 3). Hal ini sejalan
dengan data di atas yang menunjukkan bahwa kadar total fenol dan tanin terkondensasi
pada ekstrak sekuensial etanol jauh lebih tinggi. Komponen inilah yang diduga mampu
menimbulkan efek penghambatan fotooksidasi melalui reaksi singlet oxygen quenching.
Untuk memastikan dugaan ini maka selanjutnya dilakukan fraksinasi dan identifikasi
terhadap senyawa yang terdapat dalam ekstrak sekuensial etanol tersebut.



                                                                                 11
                                        40




              Angka peroksida (meq/kg
                                        35
                                        30                                                                                      100 ppm




                      minyak)
                                        25                                                                                      200 ppm
                                        20                                                                                      300 ppm
                                        15
                                                                                                                                400 ppm
                                        10
                                         5                                                                                      500 ppm
                                         0                                                                                      K-1
                                                                          0           1      2      3        4      5      6    K-2
                                                                                          Lama penyinaran (jam)




Gambar 2. Efek berbagai konsentrasi ekstrak heksana terhadap fotooksidasi minyak
          sawit yang diberi cahaya 4000 lux pada suhu kamar selama 6 jam.
          Keterangan: eritrosin diberi cahaya (K-1), tanpa eritrosin diberi cahaya (K-
          2)




                                                                          20                     100 ppm
                                        Angka peroksida (meq/kg minyak)




                                                                          18                     200 ppm
                                                                          16                     300 ppm
                                                                                                 400 ppm
                                                                          14
                                                                                                 500 ppm
                                                                          12                     K-1
                                                                          10                     K-2
                                                                              8
                                                                              6
                                                                              4
                                                                              2
                                                                              0
                                                                                  0         1            2       3         4    5         6
                                                                                                        Lama penyinaran (jam)




Gambar 3 Efek berbagai konsentrasi ekstrak sekuensial etanol pada minyak kacang
         tanah yang diberi cahaya 4000 lux pada suhu kamar selama 6 jam,
         Keterangan: eritrosin diberi cahaya (K-1), tanpa eritrosin diberi cahaya (K-
         2)



                                                                                                                                              12
4.3. Fraksii ekstrak sekuensial etanol (ESE) biji pinang


                              Hasil fraksinasi ESE biji pinang menunjukkan adanya 6 (enam) kelompok fraksi
yang berbeda yaitu kelompok I (tabung 1-12), II (tabung 13-18), III (tabung 19-32), IV
(tabung 33-36), V (tabung 37-53), dan VI (tabung 55-80) seperti terlihat pada Gambar 4.
Selanjutnya dilakukan pengujian kemampuan dari masing-masing kelompok fraksi (300
ppm) dalam menghambat reaksi fotooksidasi pada media asam linoleat. Hasilnya
menunjukkan bahwa keenam kelompok fraksi memberikan efek penghambatan yang
tidak berbeda nyata (Gambar 5). Untuk itu dipilih salah satu kelompok fraksi yang
memiliki puncak yang relatif tajam yaitu kelompok fraksi 2 yang diduga memiliki
kemurnian yang lebih tinggi dibanding kelompok fraksi yang lain. Selanjutnya kelompok
fraksi 2 inilah yang dilakukan isolasi dan identifikasi menggunakan LC/MS.




                        2,5


                         2
  Absorbansi (340 nm)




                        1,5


                         1


                        0,5


                         0
                               1   6   11   16   21   26   31   36   41   46   51   56   61   66   71   76
                                                                Nomor fraksi




  Gambar 4. Fraksinasi ekstrak sekuensial etanol (ESE) dan dibaca pada λ = 340 nm




                                                                                                             13
            Angka peroksida (meq/kg minyak)   14       F-1
                                                       F-2
                                              12       F-3
                                                       F-4
                                              10       F-5
                                                       F-6
                                              8        Kontrol
                                              6

                                              4

                                              2

                                              0
                                                   0         2                 4    6
                                                            Lama penyinaran (jam)




Gambar 5. Efek penambahan 300 ppm masing-masing kelompok fraksi terhadap
          fotooksidasi asam asam linoleat (0,03 M) yang diberi cahaya 4000 lux
          lampu fluoresen pada suhu kamar selama 6 jam.



4.4. Identifikasi fraksi 2 dengan menggunakan LC-MS

Analisis menggunakan HPLC dan MS terhadap kelompok fraksi 2 ekstrak sekuensial
etanol biji pinang menunjukkan ada sejumlah puncak (Gambar 6) yang tiga diantaranya
bisa diidentifikasi sebagai katekin, prosianidin, dan robinetinidol (Gambar 7). Meskipun
yang teridentifikasi dalam ekstrak biji pinang tersebut bukanlah senyawa baru, namun
penelitian ini telah membuktikan bahwa komponen katekin adalah salah satunya. Hal ini
sesuai dengan dugaan semula bahwa komponen tannin yang terkondensasi yang
mampu memberikan efek penghambatan terhadap fotooksidasi minyak sawit. Jika dilihat
dari struktur kimianya maka prosianidin dan robinetinidol menunjukkan bentuk tannin
terkondensasi tersebut (Gambar 8).




                                                                                        14
                                       Katekin


                                             Prosianidin

                                                           Robinetinidol




Gambar 6. Profil pemisahan HPLC dari kelompok fraksi 2 ekstrak sekuensial etanol biji
pinang




                            Katekin

                                                                       Robinetinidol


                                                  Prosianidin




Gambar 7. Profil pemisahan LC/MS dari kelompok fraksi 2 ekstrak sekuensial etanol biji
pinang




                                                                                       15
                                                                          OH

                                                                                    OH


                                              HO            O
                           OH                                                       OH

                                    OH                                                   OH

HO           O                                       OH               O
                                                    HO



                      OH                                                       OH

     OH                                                     OH

            Katekin                                        Procyanidin


                                                           OH

                                                                     OH


                            HO                 O                     OH
                                                                     OH

                                                                           OH
                      OH                              OH

            HO                        HO              O
                                    OH



             HO                                                 OH

                                O              OH




                                         OH

                                    Robinetinidol




          Gambar 8. Struktur kimia tanin terkondensasi pada ekstrak pinang




                                                                                              16
4.5. Kinetika dan mekanisme kuensing katekin
       Mengingat salah satu senyawa dalam ekstrak tersebut adalah katekin maka
selanjutnya perlu diketahui kinetika dan mekanisme quenching oksigen singlet dari
senyawa katekin yang autentik. Intersep dan slop dapat digambarkan dari [AO2]-1 lawan
[A]-1 pada berbagai konsentrasi kuenser (Q) adalah K-1 dan K-1 {kd = kq[Q] + kox-Q [Q] +
kd) / kr} berturut-turut. Intersep dari memplotkan tersebut tidak tergantung konsentrasi
kuenser (katekin) dan slope tergantung pada konsentrasi kuenser. Untuk memplotkan
[AO2]-1 lawan [A]-1 untuk tingkat perbedaan konsentrasi katekin (Gambar 9).



                                       700
                                                 0
                                       600       0,75 x 10-3
                                                 1,5 x 10-3
              1/hidroperoksida [1/M]




                                       500       2,5 x 10-3

                                       400

                                       300

                                       200

                                       100

                                         0
                                             0   5      10          15       20        25   30   35

                                                               1/asam linoleat [1/M]

Gambar 9. Efek katekin terhadap pembentukan peroksida asam linoleat dalam metilen
          klorida yang mengandung 100 ppm eritrosin selama penyimpanan 2 jam.


       Efek konsentrasi katekin terhadap asam linoleat yang dipelajari adalah 0 ; 0,75 x
  -3
10 ; 1,5 x 10-3 dan 2,5 x 10-3 M. Konsentrasi asam linoleat adalah 0,03 ; 0,06 ; 0,09 dan
0,15 M dalam metilen klorida yang mengandung 100 ppm eritrosin pada 35oC selama 2
jam di bawah penyinaran cahaya 4000 lux.

       Angka peroksida sampel asam linoleat menurun dengan meningkatnya
konsentrasi katekin dari 0 sampai 2,5 x 10-3 M. Dalam Gambar di atas, intersep adalah
sama untuk tingkat perbedaan konsentrasi katekin, tetapi slope dari plot naik selama
konsentrasi katekin meningkat dari 0 sampai 2,5 x 10 -3. Ini menunjukkan bahwa katekin



                                                                                                      17
hanya bertindak sebagai kuenser oksigen singlet untuk menurunkan fotooksidasi asam
linoleat Dengan demikian katekin dapat menurunkan fotooksidasi asam linoleat melalui
mekanisme kuensing oksigen singlet, tetapi tidak menunjukkan mekanisme kuensing
sensitiser, dalam hal ini adalah eritrosin.

        Garis regresi linear untuk plot [AO2]-1 lawan [A]-1 tanpa katekin adalah y =
5,4697x + 97,562 (r = 0,9847), dimana y = [AO2]-1 dan x = [A]-1. Rasio antara
slope/intersep dan garis linear adalah 0,0561. Foote (1979) menyatakan bahwa rasio
slope/intersep dari garis regresi untuk minyak tanpa kuenser adalah kd/kr. Nilai kd dalam
pelarut metilen klorida adalah 1,1 x 104 M-1 s-1 (Young et al., 1971). Oleh karena itu, laju
oksidasi oksigen singlet (kr) asam linoleat adalah kd/slope, kr = 1,1 x 104/0,0561 = 1,96 x
105 M-1s-1 dalam pelarut metilen klorida. Lee et al (1997) melaporkan laju oksigen singlet
untuk metil linoleat adalah 1,6 x 10-5 M-1s-1 dalam pelarut benzena-metanol (4:1).

        Rasio slope/intersep dari plot untuk konsentrasi katekin 0 ; 0,75 x 10-3; 1,5 x 10-3
dan 2,5 x 10-3 M yang dihitung dari Gambar 9 berturut-turut adalah 0,0561; 0,0637;
0,0723 dan 0.0989. Nilai rata-rata r untuk garis regresi adalah 0,9645.
        Untuk menentukan laju kuensing oksigen singlet (kq + kox – Q) dari katekin, rasio
slope/intersep lawan [ketekin] yang diplotkan dari Gambar 10. Persamaan garis linear
dari rasio plot/intersep lawan [katekin] pada Gambar 10 adalah y = 16,924x + 0,0527,
dan koefisien korelasinya (r) adalah 0,9693. Foote (1979) melaporkan bahwa slope dari
plot rasio slope/intersep lawan [Q] adalah kq + kox – Q / kr. Selanjutnya nilai total konstanta
laju kuensing oksigen singlet (kq + kox   – Q)   dari katekin adalah slope dari kr karena slope
dari plot untuk katekin (Gambar 5.18) adalah 16,924 sedangkan nilai kd dalam pelarut
metilen klorida adalah 1,1 x 104. Garis regresi dari slope/intersep untuk katekin (0 ppm)
adalah 0,0651 (kd/kr = 0,0561). Jadi konstanta laju reaksi asam linoleat dengan oksigen
singlet (kr) = 1,1 x 104/0.0561 = 1,96 x 105 M-1s-1. Dengan demikian konstanta laju
kuensing oksigen singlet total (kq + kox – Q) dari katekin = 1,96 x 105 x 16,924 = 3,32 x
106 M-1s-1.




                                                                                            18
                0,12
                              y = 16,924x + 0,0527
                    0,1            R = 0,9693

                0,08

                0,06

                0,04

                0,02

                     0
                          0    0,0005     0,001      0,0015      0,002   0,0025     0,003




Gambar 10. Plot antara slope/intersep (1/peroksida lawan 1/M asam linoleat) lawan
           [katekin]




4.6. Formulasi kombinasi anti-fotooksidan

       Karakteristik dari hasil pemurnian minyak kacang tanah disajikan pada Tabel 2.
Adapun tujuan dari pemurnian ini adalah untuk mendapat minyak kacang tanah yang
telah terbebas dari senyawa-senyawa prooksidan maupun antioksidan yang terdapat
dalam minyak kacang tanah. Minyak kacang tanah yang dimurnikan dengan teknik
kolom kromatografi efektif dapat menurunkan asam lemak bebas, angka peroksida, -
tokoferol, -karoten dan pigmen (klorofil) secara signifikan. Walaupun beberapa produk
minor antioksidan primer dan sekunder seperti -karoten (1,29 ppm) dan -tokoferol
(0,09 ppm) masih terdapat di dalam minyak kacang tanah murni.


      Tabel 2. Karateristik minyak kacang tanah sebelum dan setelah pemurnian
    Karakteristik                             Sebelum dimurnikan           Setelah dimurnikan
    Asam lemak bebas (%)                             0,77  0,02                  0,29  0,01
    Angka peroksida (meq/kg)                         30,11  0,99                 1,15  0,52
    Klorofil (λ = 668 nm)                             0,02  0                        0
    -karoten (mg/kg)                                5,96  0,05                  1,29  0,11
    -tokoferol (mg/kg)                              53,88  0,01                 0,09  0,01
  Keterangan : Data dinyatakan dalam rata-rata  SD dari 2 ulangan



                                                                                                19
       Berdasarkan penelitian di atas diketahui bahwa ekstrak pinang pada level 500
ppm memiliki efek penghambatan peningkatan angka peroksida yang lebih efektif
dibandingkan pada kadar yang lebih tinggi lagi. Demikian pula penggunaan vitamin C
(asam askorbat) menunjukkan efek penghambatan angka peroksida pada level sekitar
250 ppm. Asam sitrat dipilih berdasarkan kemampuannya untuk mengikat senyawa
logam terutama yang bisa mengkatalisis degradasi hidroperoksida yang terbentuk. Hasil
optimasi formula antifotooksidan eksktrak buah pinang menunjukkan bahwa ekstrak biji
pinang 500 ppm terbukti paling efektif menekan angka peroksida (Tabel 3). Hasil
kombinasinya dengan vistamin C dan asam sitrat tidak memberikan efek yang berbeda
nyata pada α = 5%.


       Tabel 3. Hasil formulasi ekstrak pinang pada minyak kacang tanah murni

           Formulasi                     Angka peroksida (miliekivalen/kg minyak)
                                               (rerata ± standard deviasi)
           1. C500+S500                                  8 ± 1,39
           2. E1000+C250                               8,15 ± 1,66
           3. C500                                     9,55 ± 1,16
           4. S500                                    12,0 5± 1,18
           5. E1000+C500+S500                          7,25 ± 0,70
           6. E500+C500+S250                            8,5 ± 1,39
           7. C250+S250                                  8 ± 0,92
           8. E500+C250+S500                           9,25 ± 1,76
           9. Kontrol                                 17,35 ± 0,75
           10. E1000+S250                               12 ± 2,05
           11. E1000+C500+S250                         8,65 ± 1,21
           12. E500+C500                               8,45 ± 0,47
           14. E500                                     9,3 ± 1,31
           15. E1000+C250+S500                        10,85 ± 1,45
           16. C250                                   12,15 ± 1,23

  Keterangan :
  E : ekstrak pinang 500 atau 1000 ppm
  C : vitamin C 250 atau 500 ppm
  S : asam sitrat 250 atau 500 ppm




                                                                                    20
                                    5. KESIMPULAN


       Ekstrak etanol biji buah pinang telah diuji dalam sistem reaksi foto-oksidasi dan
menunjukkan kemampuan mampu menghambat reaksi foto-oksidasi pada minyak
kacang tanah yang dimurnikan dan disensitasi oleh eritrosin. Ekstrak etanol difraksinasi
dan dilakukan identifikasi terhadap ekstrak tersebut menggunakan LC-MS dan diketahui
komponen penyusunnya terdiri dari katekin (BM 291), Procyanidin (BM 563), dan
Robinetinidol (BM 866). Mekanisme quenching dari katekin adalah bereaksi dengan
oksigen singlet dan tidak bereaksi dengan sensitiser yang tereksitasi. Konstanta laju
kuensing oksigen singlet total (kq + kox – Q) oleh katekin adalah 3,32 x 106 M-1s-1. Hasil
optimasi formula anti-fotooksidan menunjukkan bahwa ekstrak biji pinang sendiri
memiliki kemampuan menghambat foto-oksidiasi yang efektif. Jika ekstrak biji buah
pinang 500 ppm dikombinasikan dengan asam askorbat 500 ppm, dengan atau tanpa
asam sitrat 250 ppm ternyata memberikan efek penghambatan foto-oksidasi yang tidak
berbeda nyata. Dengan kata lain singlet oxygen quenching pada ekstrak biji pinang tidak
bersinergi dengan vitamin C maupun asam sitrat.




Daftar Pustaka


AOCS. 1980. Official and Tentative Methods. American Oil Chemists Society;
      Champaign, IL.

Carpenter, A.P.,Jr. 1979. Determination of tocopherols in vegetable oils. J. Oil Chem.
        Soc. 56:668-670.

Chang, S.S., Ostric-Matijasevic, B., Huang, C-L., and Hsieh, A-L. 1976. Method of
      producing an antioxidant composition from rosemary and sage. US Patent
      number 3,950,266.

Edi Suryanto, dan J.A Rorong. 2001, Isolasi Antioksidan Fenolik dari Oleoresin Buah
        Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.). Eugenia (88-92) : 1-6

Edi Suryanto, H. Sastrohamidjojo, Sri Raharjo, and Tranggono. 2004a. Antiradical
       activity of andaliman (Zanthoxylum achanthopodium DC) fruit extracts.
       Indonesian Food and Nutrition Progress. 2004, 11: 15-19

Edi Suryanto, H. Sastrohamidjojo, Sri Raharjo, and Tranggono. 2004b. Singlet oxygen
       quenching effect of andaliman (Zanthoxylum achanthopodium DC) extracts in
       light-induced lipid oxidation. Indonesian Food and Nutrition Progress. 11: 48-55


                                                                                       21
Foote, C.S. and Denny, R.W. 1968. Chemistry of singlet oxygen quenching by beta-
        carotene. J. Am. Chem. Soc. 90:6232-6238.

Lee, S.H. and Min, D.B. 1990. Effects, quenching mechanisms and kinetics of
        carotenoids in chlorophyll-sensitized photooxidation of soybean oil. J. Agric.
        Food Chem. 38:1630-1634.

Lydia N. Lestario, Sri Raharjo, Suparmo, Pudji Hastuti, and Tranggono. 2004.
       Fractionation and identification of Java Plum (Syzygium cumini) extracts.
       Indonesian Food and Nutrition Progress. 11: 41-47.

Posma Sibuea, Suparmo, Umar Santoso, Zuheid Noord, Mary Astuti, and Sri Raharjo.
      2004a. Quenching mechanisms and kinetics of quercetin in inhibition of
      photosensitized oxidation of palm oil and linoleic acid. Indonesian Food and
      Nutrition Progress. 11: 56-64


Posman Sibuea, Umar Santoso, Zuheid Noor, and Sri Raharjo. 2004b. Singlet oxygen
     quenching effect of quercetin in erythrosine-sensitized photooxidation of oil-in-
     water emulsion. Indonesian Food and Nutrition Progress. 11: 72-82

Proctor, A. and Snyder, H.E. 1987. Adsorption of lutein from soybean oil on silicic acid.
         J. Am. Oil Chem. Soc. 64:1163-1166.

Rawls, H.R. and Van Santen, P.J. 1970. Possible role of singlet oxidation in the
        initiation of fatty acid autoxidation. J. Am. Oil Chem. Soc. 47:121-125.

Sri Raharjo and Edi Suryanto Anti-Autooxidative and Anti-Photooxidative Effects of
       Lemon Grass Extract (Cymbopogon citratus). Indonesian Food and Nutrition
       Progress. 2005, Vol.12: 21-26

Yohana S. Kusuma Dewi,; Tranggono; Sri Raharjo and Puji Hastuti. 2005. Isolation and
      Identification of Antiradical and Anti-photooxidant Component of Aloe vera
      chinensis. Indonesian Food and Nutrition Progress. 12:1-8




                                                                                      22
SUSUNAN TIM PENELITI


Ketua Tim Peneliti   : Prof.Dr. Sri Raharjo
Unit Kerja           : Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil Pertanian
                       Fakultas Teknologi Pertanian
                       Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Bidang ilmu          : Ilmu pangan
Bidang penelitian    : Antioksidan Pangan
Telp / Fax           : 0274-549650
Email                : sraharjo_ugm@yahoo.com



Anggota Tim Peneliti : Dr. Edi Suryanto Msi.
Unit Kerja           : Jurusan Kimia
                       Fakultas MIPA
                       Universitas Sam Ratulangi, Manado
Bidang Ilmu          : Kimia
Bidang Penelitian    : Isolasi dan identifikasi bahan alam




                                                                      23

								
To top