División Celular Bacteriana y Resistencia a Antibióticos / Bacterial Cell Division and Antibiotics Resistance
Jefe de Línea / Group Leader: Juan Alfonso Ayala Serrano e-mail: jayala@cbm.uam.es
Becarios Predoctorales / Graduate Students: Guillermo Cobas Pupo Daniel Edgar Vega Mendoza
Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Susana Dominguez Santos Carmen Panadero Alvarez Nuria Salas
Estudiantes/Students Ana Rosa Villaroya Moreno Rachel Ruíz Fernando López Gallego Amelie Borges Ingrid Dunn-Stanley
Científicos Visitantes / Visiting Scientist: Vanina Romanello, Universidad de Rosario, Argentina Juan Francisco Almenares, Universidad de Oriente, CEBI, Cuba
Prof. Jean van Heijenoort, Universite de Paris-Sud, Francia Dr. Gabriel Guntkind, Universidad Buenos Aires, Argentina Dr. Kuvat T. Momynaliev, Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow, Russia
Resumen de Investigación Los objetivos de nuestro grupo son el estudio desde un punto de vista molecular del proceso de crecimiento y división bacteriana y de los diversos mecanismos de resistencia a los antibióticos -lactámicos, que se han desarrollado por los microorganismos patógenos de origen clínico La mayor parte de los enzimas implicados en el proceso de división bacteria se encuentran agrupados en el cluster dcw (division and cell wall), muy conservado en la evolución y donde se incluyen, entre otros, los genes pbpB, ftsW y ftsZ. El estudio de la funcionalidad de FtsW en Escherichia coli ha sido uno de los aspectos que hemos desarrollado en este periodo. Los mecanismos de resistencia a los antibióticos desarrollados por las bacterias patógenas son muy complejos y incluyen entre otros, transmisión horizontal de determinantes de resistencia, modificación de la permeabilidad de la membrana y expresión de bombas de eflujo. En este periodo hemos caracterizado una nueva -lactamasa (CTX-M-2) transmisible en un nuevo integrón, así como la influencia de la longitud de cadena del antígeno-O en la invasividad de Shigella flexneri. Además, estamos caracterizando las proteínas de membrana externa de Pseudomonas aeruginosa de origen clínico. Tras la publicación de la secuencia completa del genoma de Salmonella Typhi se ha hecho patente la presencia de genes parálogos para las PBPs no previamente identificados por estudios bioquímicos. Dos de estos genes codifican para parálogos cromosomales de pbpA y pbpB, que no están presente en Escherichia coli. Estamos analizando estas proteínas desde el punto de vista genético, enzimático y fisiológico, y encontrando evidencias de su implicación en los procesos de invasión y proliferación intracelular. El peptidoglicano lateral durante la elongación bacteriana se sintetiza esencialmente por la proteína PBP1b. Esta proteína presenta una actividad transpeptidasa (crosslinking) asociada al dominio C-terminal, y una actividad transglicosilasa (elongación de cadena) en el dominio Nterminal. A pesar de los esfuerzos de varios grupos para la cristalización y determinación de la estructura de esta proteína, aun no se han conseguido resultados positivos. No obstante
hemos avanzado en el conocimiento de la interacción con el antibiótico inhibidor de la transglicosilación, moenomicina A, y en la funcionalidad de cada dominio de la proteína. La proteína FtsZ es un componente esencial del anillo septal para la división bacteriana. Este anillo, con estructura que presenta analogías al citoesqueleto eucariota, parece ser un componente universal para el mecanismo de división. Dado que Mycoplasma hominis tiene todas las características de la célula procariota mínima y algunos de los procesos de las bacterias con envoltura, es un modelo prometedor para el estudio de los principios básicos del proceso de división. En este periodo hemos iniciado el estudio de esta proteína en este microorganismo y en mutantes de origen clínico. Los logros esenciales en los dos últimos años han sido: 1.-Estudio de la distribución de cadenas de antígeno O durante el crecimiento exponencial e intracelular de Shigella flexneri, 2.- La caraterización topológica en la membrana para la proteína esencial FtsW implicada en división celular en Escherichia coli, 3.- Descripción de un nuevo integrón de Clase 1 (InS21) portador del gen de resistencia blaCTX-M-2 en Salmonella enterica Serovar Infantis. 4.- Análisis por Resonancia de Plasma Superficial (SPR) de la interacción entre el antibiótico Moenomicina A con la Penicillin-Binding Protein 1b de Escherichia coli, 5.- Caracterización del gen ftsZ de Mycoplasma hominis y la variabilidad de secuencia en mutantes clínicos de Mycoplasma.
Research Summary The objectives of our group is the analysis under diverse molecular approaches of the bacterial growth and cell division, and to study the mechanisms of resistance to the -lactam antibiotics, that have been developed by pathogens of clinical origin. Most of the gene coding for the enzymes involved on cell division processes are grouped in the dcw cluster (division and cell wall), highly conserved during evolution and including, among others, the genes pbpB, ftsW and ftsZ. The study of functional characterization of the FtsW protein has been developed during this period.
The molecular mechanisms that have been developed by pathogens are very complex, including, horizontal transmission of resistance determinants, change of membrane permeability and expression of efflux pumps. In this period we have characterize a new lactamase (CTX-M-2) transmissible by a new integron InS21, and also the influence of Oantigen length on virulence of Shigella flexneri. We are also characterizing the outer membrane proteins in clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa. After the complexion of the Salmonella Typhi genome sequence, it has become apparent that some paralogous PBP genes have not been identified previously by the biochemical methods. Two of these genes code for chromosomal pbpA and pbpB paralogues, which are not present in Escherichia coli. We are analyzing these proteins from the genetic, enzymatic and physiological point of view, and we have found evidence for involvement on the cellular invasion and proliferation processes. Lateral peptidoglycan during cell elongation is synthesized mainly by the penicillin-binding protein PBP1b. This protein holds the transpeptidase activity (crosslinking) in the C-terminal domain, and the transglycosylase activity (chain elongation) in the N-terminal domain. In spite of the big effort of several groups to crystallize and to determine the 3D structure of this protein, there are no positive results. However, we have advanced on the knowledge of the interaction with the transglycosylase-inhibitor antibiotic moenomycin and the functionality of each domain of the protein. The FtsZ protein is an essential component of the bacterial cell division ring. This cytoskeletonlike ring is believed to be the universal way of bacterial division. Mycoplasma hominis possesses all features of the minimal cell and some traits of cell-wall bacteria and seems to be a promising object for study of basic principles of the bacterial division process. In this period we have started the analysis of this protein in this model microorganism, and variant forms of clinical origin. Our main achievements in the last two years were: 1.- O-antigen chain length distribution during exponential and intracellular growth of Shigella flexneri, 2.- Topological characterization of the
essential Escherichia coli cell division protein FtsW, 3.- Description of a novel Class 1 integron (InS21) carrying the blaCTX-M-2 in Salmonella enterica Serovar Infantis, 4.- Surface Plasmon Resonance Analysis of the Interaction between the Antibiotic Moenomycin A with PenicillinBinding Protein 1b of Escherichia coli, and 5.- Characterization of the Mycoplasma hominis ftsZ Gene and Its Sequence Variability in the Mycoplasma Clinical Isolates.
Publicaciones / Publications: Varela, G., Schelotto, F., diConza, J., Ayala, J. A. (2001) Analysis of the O-antigen chain length distribution during exponential and intracellular growth of Shigella flexneri. Microbial Pathogenesis 31, 21-27
Lara, B., Ayala, J.A. (2002) Topological characterization of the essential Escherichia coli cell division protein FtsW. FEMS Microbiology Letters 216, 23-32
Stembera, K., Buchynskyy, A., Vogel, S., Knoll, D., Osman, A. A., Ayala, J.A., Welzel, P. (2002) Moenomycin-mediated affinity purification of penicillin-binding protein 1b. ChemBioChem. 3, 332-340
Di Conza, J., Ayala, J.A., Power, P., Mollerach, M., Gutkind, G. (2002) Novel Class 1 integron (InS21) carrying the blaCTX-M-2 in Salmonella enterica Serovar Infantis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46, 2257-2261
Stembera, K., Vogel, S., Buchynskyy, A., Ayala, J.A., Welzel, P. (2002) A Surface Plasmon Resonance Analysis of the Interaction between the Antibiotic Moenomycin A with Penicillin-Binding Protein 1b. ChemBioChem. 3, 559-565
Momynaliev, K. T., Smirnova, O. V., Lazyrev, V. N., Akopian, T. A., Chelysheva, V. V., Ayala, J.A., Simankova, A. N., Borchsenius, S. N., Govorun, V. M. (2002) Characterization of the Mycoplasma hominis ftsZ Gene and Its Sequence Variability in the Mycoplasma Clinical Isolates..Biochem. Biophys. Research Comm. 293, 155-162
Di Conza, J., Mollerach, M., Ayala, J.A., Gutkind, G. (2002) Estudio de integrones clase 1 en Salmonella aisladas en Santa Fe, Argentina. Revista FABICIB 6, 163-169
Figura 1.- Topología de FtsW en la membrana interna de Escherichia coli, derivada de la actividad AP y la resistencia a -lactámicos de fusiones génicas. La secuencia aminoacídica se muestra con el código de una letra y rodeadas por círculos, cuadrados o rombos. Se muestran las posiciones conservadas en al menos 60% (cuadrados) o en mas de 90% (rombos) de los homólogos a FtsW. Las posiciones de las fusiones PhoA y Bla están colocadas en el modelo (caracteres blancos) de acuerdo con la actividad AP o resistencia a Bla, con fondo oscuro (activas o resistentes) o fondo gris (inactivas o sensibles). Los residuos conservados entre las secuencias de FtsW de E. coli y S. pneumonia están resaltados por una línea gruesa y fondo blanco. PER, periplasma. CM, membrana citoplásmica, CYT, citoplasma.
Figure 1.- Membrane topology model of FtsW from Escherichia coli derived from AP activity and -lactam resistance of fusion proteins. The primary amino acid sequence is given in the single-letter code and in black characters surrounded by a circle, a square or a diamond. Conserved position in at least 60% (squares) or in more than 90% (diamonds) of the FtsW homologues are indicated. The positions of the PhoA and BlaM fusions are superimposed to the model (in white characters) according to the AP activity or Bla resistance as black (active or resistant) or grey (inactive or sensitive) background. Conserved residues among the sequence
of FtsW from E. coli and S. pneumonia are highlighted by a bold line and white background. PER, periplasm. CM, cytoplasmic membrane, CYT, cytoplasm.