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ESTRAZIONE RNA_ _QIAGEN_

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ESTRAZIONE RNA_ _QIAGEN_ Powered By Docstoc
					C1. ESTRAZIONE RNA: (QIAGEN)

    1. Risospendere il pellet cellulare in 100l lisozima, vortex 10’’ e 5’ a Temperatura ambiente
        nel termomix a 750 RPM
    2. 350l buffer RLT+-mercaptoetanolo, vortex 10’’
    3. 250l etanolo assoluto, mix pipettando
    4. trasferire tutti i 700l nella colonnina, centrifugare 30’’ a 12000 RPM; scartare il liquido
    5. 350l buffer RW1, centrifugare 30’’ a 12000 RPM; scartare il liquido
    6. 80l DNasi (10l DNasi +70l buffer RDD) direttamente sulla membrana e 15’ a T amb
    7. 350l buffer RW1, centrifugare 30’’ a 12000 RPM; scartare il liquido
    8. trasferire la colonnina in un nuovo tubo da 2 ml e 500l buffer RPE(+etanolo), centrifugare
        30’’a 12000 RPM, scartare il liquido
    9. 500l RPE(+etanolo), centrifugare 2’ a 12000 RPM
    10. trasferire la colonnina in un’eppendorf da 1,5 ml, 50l H2O RNase-free, centrifugare 1’ a
        12000 RPM
    11. 50 l H2O RNase-free, centrifugare 1’ a 12000 RPM


Lisozima (1mg/ml):

       2l lisozima (50mg/ml)
    100l TE 1X
    

Buffers:

RLT+-mercaptoetanolo:             10l -mercaptoetanolo
                                    1ml buffer RLT
C2 Valutazione qualitativa e quantitativa dell’RNA C1 mediante EGAg
Gli RNA totali estratti in C1 saranno frazionati mediante EFGAg 1% in TAE pH 8.3 e colorazione
con Bromuro di etidio 0.5 g/ml.

Campioni per elettroforesi:   Marcatori di peso molecolare*:
5 μl RNA                      1- Low 100 bp ladder 5 μl
1 μl Loading Dye



C3 Valutazione qualitativa e quantitativa dell’RNA C1 mediante mediante
spettrofotometria: lettura OD260/280


Effettuare una diluizione x10 della preparazione di RNA ponendo 10 l di RNA in 90 l di H2O.
Mescolare accuratamente.
Trasferire la diluzione in cuvetta da spettrofotometro
Leggere OD260 e OD280
Calcolare la concentrazione dell’RNA tenendo conto che una soluzione di RNA con una
concentrazione di 40 g/ml presenta una OD260 di 1.

Valutare in grado di purezza dell’RNA tenendo conto che una preparazione pura ha un rapporto
OD260/280 di 1.9-2.1 a pH 7.5.




gruppo             OD260      OD280       OD260/280 g/ml      /ml
                                                    diluizione finale
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Trattamento con DNasiI:

     x l RNA (ca. 2g)
     2l 10X buffer
     1l DNasi I
     H2O a 20 l

    20 l totale

        Incubare 15’ a 37°C
        Aggiungere 2l EDTA 25mM
        Inattivare l’enzima per 10’ a 65°C

				
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posted:3/12/2010
language:Italian
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