with individual Enzyme Labels IgG and IgM

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with individual Enzyme Labels IgG and IgM Powered By Docstoc
					                                                   GanglioCombi
                                 with individual Enzyme Labels IgG and IgM

                                           anti-Ganglioside Autoantibodies
                                                                              ELISA
                                                 (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b, and GQ1b)




                                                                    EK-GCO-GM 2 x 96 wells
                                                              (12 patient profiles; IgG and IgM)

                                                                       Revision date:   2009-06-02

BÜHLMANN Laboratories AG                                                     English    page    2
Baselstrasse 55                                                              Deutsch    Seite   5
CH - 4124 Schönenbuch, Switzerland
Tel.: +41 61 487 1212
                                                                             Français   page    8
Fax: +41 61 487 1234                                                         Italiano   pagina 11
info@buhlmannlabs.ch                                                         Español    página 14
                              ENGLISH                                                              STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
                                                                                                        Sealed / Unopened Reagents
                                                INTENDED USE
                                      ®                                         All sealed/unopened kit components are stable at 2-8°C until the expiration
BÜHLMANN GanglioCombi ELISA, (EK-GCO-GM),                        is             date printed on the labels.
designed to quantify autoantibodies of IgG and / or IgM isotype
                                                                                                      Opened / Reconstituted Reagents
directed against the clinically most relevant gangliosides, GA1,
GM1, GM2, GD1a, GD1b and GQ1b in human serum (1-8)                                                     Return unused strips immediately to the aluminium
                                                                                                       pouch containing the desiccant packs and reseal along
using individual IgG- and IgM-conjugates (2 profiles / patient).                Microtiter Plate
                                                                                                       the entire edge of zip-seal. Store for up to 4 months at
                                                                                                       2-8°C.
                                    PRINCIPLE OF THE ASSAY                      Diluted Wash Buffer    Store for up to 4 months at 2-8°C.
BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA is based on the enzyme-                            Calibrator             Store for up to 1 month at
immunometric assay technique. Gangliosides GA1, GM1,                            Controls               2-8°C. Do not freeze!
GM2, GD1a, GD1b and GQ1b have stripwise been coated onto                        Incubation Buffer
the wells of the microtiter plate. Calibrator, controls and patient             Enzyme Labels          Store at 2-8° until expiration date printed on the labels.
sera are incubated for two hours in the microtiter wells and anti-              TMB Substrate
ganglioside autoantibodies (Ab) present in the sample bind to                   Stop Solution          Store at 18-28°C.
                                                                                                                                                             Table 2
the immobilized gangliosides. After washing off unbound
substances, horseradish-peroxidase (HRP) labeled antibodies                                                   WARNINGS AND PRECAUTIONS
against human IgG and / or IgM are added to the wells and                       Both, Calibrator (B-GCO-CA) and Controls (B-GCO-CONSET)
incubated for another two hours. Following a second washing                     of this kit contain components of human origin. Each serum
step in which unbound antibody-enzyme reagent is removed, a                     donor unit used in the preparation of the components was tested
substrate solution containing tetramethylbenzidine (TMB) is                     by an FDA approved method and found negative for HBV
added to the wells. A blue color develops in proportion to the                  surface antigen, so as for HCV and HIV1/2 antibodies. Although
amount of anti-ganglioside autoantibodies bound to the                          these methods are highly accurate, there is no guarantee that
microplate in the initial step. Color development is stopped by                 this material cannot transmit Hepatitis or AIDS. Therefore, all
adding an acidic stop solution (diluted sulfuric acid) which turns              patient specimens and kit components should be handled as if
the blue solution into yellow. The intensity of the color is                    capable of transmitting infections. All products containing human
measured at 450 nm.                                                             source material should be handled in accordance with good
The measured absorbance is proportional to the titer of anti-                   laboratory practice and using appropriate precautions.
Ganglioside-antibodies present in a given sample. The titers of
anti-ganglioside autoantibodies are expressed as % ratios of                                    MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
the calibrator and can be assigned to titer categories.                         •   Precision pipettes with disposable tips: 20 µl, 100 µl and
                                                                                    1 ml pipettes.
                 REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION                              •   Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the
                                                                                    preparation of sample dilutions.
Reagents                     Quantity     Code       Reconstitution
                                                                                •   1000 ml cylinder for the reconstitution of the wash buffer.
Microtiter Plate            2 x 12 x 8
                                          B-GCO-MP   Ready to use               •   Squeeze bottle for wash buffer or automatic microtiter plate
precoated with gangliosides wells                                                   washer.
Plate Sealer                 6 pieces                                           •   Blotting paper.
Wash Buffer Concentrate                              Dilute with 900            •   Microtiter plate shaker.
                             2 bottles
(10X)
                             100 ml
                                          B-GCO-WB   ml of deionized            •   Microtiter plate reader for measurement of absorbance at
with preservatives                                   water                          450 nm.
Incubation Buffer            2 bottles
                                          B-GCO-IB   Ready to use
with preservatives           100 ml                                                                 SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
Calibrator
                             1 vial       B-GCO-CA
                                                     Add 1.5 ml of              •   The procedure requires <0.1 ml of blood and <50 µl of
Lyophilized with
                                                     Incubation Buffer              serum, respectively.
preservatives
Negative, Low and                                                               •   Do not use grossly hemolyzed, lipemic or icteric samples.
Medium Control
                             3 vials
                                          B-GCO-     Add 1.5 ml of              •   Collect blood into plain tubes (no anti-coagulant), avoid
Lyophilized with                          CONSET     Incubation Buffer
preservatives
                                                                                    hemolysis, leave to clot for one hour, centrifuge for 10
Enzyme Label IgG                                                                    minutes at approximately 1500 x g at room temperature (18-
Anti-human IgG Ab
                             1 vial       B-GCO-
                                                                                    28°C), collect the serum.
conjugated to HRP in a                               Ready to use               •   For storage purposes we recommend preparing aliquots of
                             11 ml        ELG
protein-based buffer with
preservatives
                                                                                    patient samples in order to avoid repeated freezing/thawing.
Enzyme Label IgM                                                                •   Store serum samples at ≤ -20°C for up to 4 months. For
Anti-human IgM Ab
                             1 vial       B-GCO-                                    long-term storage we recommend -70°C (samples are
conjugated to HRP in a                               Ready to use                   stable for >1 year). Frozen samples should be thawed and
                             11 ml        ELM
protein-based buffer with
preservatives                                                                       mixed thoroughly by vortexing prior to use.
TMB Substrate
                             2 vials
TMB in citrate buffer with                B-TMB      Ready to use
                             11 ml
H2O2
Stop Solution                2 vials                 Ready to use
                                          B-STS
0.25 M sulfuric acid         11 ml                   Corrosive agent
                                                               Table 1




Revision date:   2009-06-02                                              2/20                           BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                            PROCEDURAL NOTES               8. Add 100 µl of Enzyme Label IgG or IgM to the respective
Recommendations and caveat for performance                                    wells.
Results and outcome of the assay may be influenced by many
                                                                           9. Cover the plate with a Plate Sealer and incubate for 2 hours
factors. It is important to strictly follow the protocol and the pre-
                                                                              ± 5 minutes at 2-8°C (do not shake the plate).
analytical requirements. In particular we recommend attending
to the following steps:                                                    10. Remove the Plate Sealer. Empty the wells and wash three
                                                                               times using at least 300 µl of cold Wash Buffer (2-8°C) per
• Steps 3-10: Use cold (2-8°C) reagents for all these steps and
                                                                               well. Empty the wells and strike the plate firmly onto blotting
  keep them cold while pipetting.
                                                                               paper.
• Steps 3, 7, 10: Make sure that the wells are completely
  empty after the last washing cycle.                                      Note: Let TMB Substrate Solution adjust to room
                                                                           temperature (18-28°C).
• Step 11: Adjust TMB Substrate to room temperature (18-
  28°C) before using it.                                                   11. Add 100 µl of TMB Substrate Solution to each well.

• Step 12: Shake microtiter plates during the incubation with              12. Cover the plate with a Plate Sealer, incubate the plate on a
  substrate. Depending on the plate shaker, we recommend                       plate shaker at 400-600 rpm incubate for 30 minutes ± 2
  400-600 rpm. The solution should be moved in the wells but                   minutes at 18-28°C protecting the plate from direct light.
  must not spill over.                                                     13. Add 100 µl of Stop Solution to all wells. Proceed to step 14
• If an automated washer is used, “plate mode” should be                       within 30 minutes.
  chosen so that dispensing is performed sequentially on all               14. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate reader.
  strips before aspirating.
                                         ASSAY PROCEDURE
1. Dilute all patient samples to investigate 1:50 with Incuba-                                             RESULTS AND CALCULATION
   tion Buffer (e.g. 20 µl of serum + 980 µl of Incubation                 Standardization
   Buffer). Mix by vortexing and leave diluted samples and                 The Calibrator included in this kit has been calibrated against an
   reconstituted calibrator and controls for 30 minutes at 2-8°C           internal reference material.
   prior to pipetting (refer to step 4).
                                                                           Calculation of results:
2. Prepare a plate-frame with the required number of strips to
                                                                           1. Record the absorbance (OD) at 450 nm for each well
   test the patient samples. Reseal the remaining strips in the
                                                                              (Calibrator, Controls and patient samples).
   foil pouch together with the desiccant packs immediately
                                                                           2. Average the duplicate Calibrator and Control values (if
   after usage. Store refrigerated.
                                                                              available).
Note: Use cold (2-8°C) reagents in steps 3 to 10.                          3. Results are expressed as ratio of the absorbance of samples
                                                                              and the (averaged) absorbance of the Calibrator
3. Wash the coated wells twice using at least 300 µl of cold
    Wash Buffer per well. Empty the wells and tap the plate                            absorbance of samples and Controls
                                                                           % Ratio :                                               x 100
    firmly onto blotting paper to remove remaining liquid
                                                                                       absorbance of Calibrator
    completely.
    Detection of IgG-Isotype:
4a. Calibrator: Pipet 100 µl of the Calibrator into the well A1
    (see Figure 1).
                                                                           Programs to calculate results as % ratio are available on most
4b. Controls: Pipet 100 µl of the Medium Control into well B1,
                                                                           microplate readers.
    Low Control into well A2 and Negative Control into the
    well B2 (see Figure 1).
                                                                           NOTE:
NOTE: If more than three strips per istopype are used,                     The results presented in Table 11 are examples. Calibrator and
  Calibrator and Controls can be tested in duplicates (see                 Controls must be used in each individual assay.
  Figure 1).
4c. Patient serum: Pipet 100 µl of diluted patient serum 1 into
    the wells C1 - H1 (see Figure 1).
4d.Patient serum: Pipet 100 µl of diluted patient serum 2 into
   the wells C2 - H2 (see Figure 1).
4e. Pipet 100 µl of diluted patient sera 3-12 into the
    subsequent wells (see Figure 1).
   Detection of IgM-Isotype:
5. Repeat step 4a – 4e using the subsequent wells.
6. Cover the plate with a Plate Sealer and incubate for 2
   hours ± 5 minutes at 2-8°C (do not shake the plate).
7. Remove the Plate Sealer. Empty the wells and wash three
   times using at least 300 µl of cold Wash Buffer (2-8°C) per
   well. Empty the wells and strike the plate firmly onto blotting
   paper in order to remove washing buffer completely.

Revision date:   2009-06-02                                         3/20                       BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                             QUALITY CONTROL                           EXPECTED VALUES AND CUT-OFF RATIOS
A good understanding of this instruction for use is necessary to      In co-operation with the institutions mentioned below, a cut-off of
obtain reliable results. These will be obtained only by using         50% has been established. Values < 30% have been clearly
precise laboratory techniques (current GLP guidelines) and            classified as negative. The established titer categories are based
accurately following this instruction for use.                        on n=200 blood donors1 (adult men and women between 18 to
Since there is no control serum for anti-ganglioside-antibodies       70 years of age) and n=277 pathological samples2. Sera were
commercially available, we recommend using a positive, and            assayed for each of the six gangliosides (GA1, GM1, GM2,
negative serum pool for internal quality control.                     GD1a, GD1b and GQ1b), according to the assay procedure.
All controls must be within established confidence ranges (%          Results of normal blood donors are shown in Table 15.
ratio). The confidence ranges of the Controls are lot-specific
and printed on the QC data sheet delivered with this kit.             Guidelines for the Use of Cut-off / Titer categories/ratios (%):
Performance characteristics should be within established limits.
If these characteristics are not in conformity with established            Category                    Ratio (%)
limits and repetition excludes handling failures, check the
following issues: i) Have all reagents, used in steps 3-10, been           Negative                    < 30%
kept at 2-8°C? ii) accuracy of the pipets, thermometers, and               Grey zone                   30-50%
timers, iii) settings of ELISA washer and reader, iv) expiration
date of the reagents, v) storage and incubation conditions, vi)            Cut-off                     50%
color of the TMB Substrate Solution (should be colorless), vii)
                                                                           Positive                    >50-100%
purity of the water.
                                                                           Strongly Positive           > 100 %
                       PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Intra-Assay Precision (Within-Run): 4.7 %. The intra-assay            1)
precision was calculated from results of 12 values of one serum          collected at the blood donation centre, University Hospital of
sample with IgM and IgG autoantibodies to the 6 gangliosides             Basel
                                                                      2)
sample in a single run. The assay was performed using the                received from Friedrich-Baur-Institute, Ludwig-Maximilians-
individual anti-IgG and anti-IgM Enzyme Labels (B-GCO-                   University of Munich; Department of Neurology, University of
ELG, B-GCO-ELM). The values are listed in Table 12 as %                  Basel; Department of Neurology, University of Lyon.
Ratio as described in “Results and Calculation”.
Inter-Assay Precision (Run-to-Run): 16.3 %. The inter-assay
precision has been determined by measuring two serum
samples with antibodies to the 6 gangliosides using the
individual anti-IgG and anti-IgM Enzyme Labels (B-GCO-
ELG, B-GCO-ELM) in 20 different runs. The values are
listeded in Table 13 as % Ratio as describe in “Results and
Calculation”.
Dilution Linearity: Between 30 and 200 % ratio, dilutions of
tested serum samples result in a continuous reduction of the %
ratio.
Specificity: Different human serum samples containing
specific anti-ganglioside IgM and/or IgG autoantibodies were
incubate over night with the corresponding soluble antigen and
subsequently tested in the BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA
according to the assay procedure. A 50 % inactivation for a
specific ganglioside autoantibody has been observed at an
antigen concentration between 10 and 100 µg/ml of specific
antigen (data not shown).
Analytical Sensitivity: 12 Incubation Buffer replicates were
assayed in a single run for anti-IgG and anti-IgM Enzyme
Labels (B-GCO-ELG, B-GCO-ELM). The detection limit,
expressed as the % Ratio of the calibrator was calculated to be
6.4 % (mean + 2 SD). The results are displayed in Table 14.




Revision date:   2009-06-02                                    4/20                            BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                               DEUTSCH                                                      LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN
                                 ANWENDUNGSZWECK                                                             Ungeöffnete Reagenzien
Der BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA dient zur quantitativen                           Zu verwenden bis zum Verfallsdatum angegeben auf der Packungsetikette.
Bestimmung von Autoantikörpern vom Isotyp IgG- und / oder                          Lagerung bei 2-8°C.
IgM gegen die wichtigsten Ganglioside GA1, GM1, GM2,                                                   Geöffnete / Rekonstituierte Reagenzien
GD1a, GD1b und GQ1b in humanem Serum (1-8) in einem
                                                                                                       Ungebrauchte Streifen sofort in die mit Dessikator versetzte
Assay (2 Profile/Patient).                                                         Microtiter-Platte   Aluminiumpackung zurückbringen. Packung völlig
                                                                                                       schliessen. Bis zu 4 Monate bei 2-8°C haltbar.
                                     PRINZIP DER METHODE
                                                                                                       Zu verwenden bis 4 Monate nach der Rekonstitution. Bei 2-
Der vorliegende BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA Test ist                              Waschpuffer
                                                                                                       8°C lagern.
ein     enzym-immunometrischer        Festphasenassay.      Die                    Kalibrator          Zu verwenden bis 1 Monat nach der Rekonstitution.
Mikrotiterplatte wurde streifenweise mit den Gangliosiden GA1,                     Kontrollen          Bei 2-8°C lagern. Nicht einfrieren!
GM1, GM2, GD1a, GD1b und GQ1b beschichtet. Der                                     Inkubationspuffer
                                                                                                       Zu verwenden bis zum Verfallsdatum.
Kalibrator, die Kontrollen und Serumproben werden in den                           Enzymmarker
                                                                                                       Bei 2-8°C lagern.
Mikroküvetten der Mikrotiterplatte 2 Stunden inkubiert und die                     TMB Substrat
vorhandenen Anti-Gangliosid-Autoantikörper binden an die                                               Zu verwenden bis zum Verfallsdatum.
                                                                                   Stopp-Lösung
                                                                                                       Bei 18-28°C lagern.
immobilisierten Ganglioside. Durch Waschschritte werden die
                                                                                                                                                             Table 4
ungebundenen Substanzen entfernt. Danach wird ein Konjugat
von anti-human-IgG und / oder anti-human-IgM Antikörpern                                           WARNUNG UND VORSICHTSMASSNAHMEN
(Ak) zugegeben, die mit Meerrettichperoxidase (HRP)                                Kalibrator (B-GCO-CA) und Kontrollen (B-GCO-CONSET)
konjugiert sind und weitere 2 Stunden inkubiert. Danach                            enthalten Komponenten humaner Herkunft. Jedes einzelne
werden die ungebundenen Enzymkonjugat-Antikörper durch                             Spenderserum wurde durch von der FDA genehmigte Methoden
Waschen entfernt. Die Substratlösung, die Tetramethylbenzidin                      auf HBV Oberflächen Antigen, HCV und HIV1/2 Antikörper
(TMB) enthält, wird zugegeben und für 30 Minuten inkubiert.                        getestet, und als negativ freigegeben. Trotz hoher Genauigkeit
Durch die Enzymreaktion entsteht eine Blaufärbung, die durch                       dieser Methoden kann nicht garantiert werden, dass die
Zugabe der sauren Stopplösung (verdünnte Schwefelsäure)                            Materialien nicht Hepatitis oder AIDS übertragen können. Aus
beendet wird und einen Farbumschlag (gelb) bewirkt. Die bei                        diesem Grunde müssen diese Kit Komponenten, sowie die
einer Wellenlänge von 450 nm gemessene optische Dichte der                         Patientenproben als potentiell infektiös betrachtet werden. Alle
Lösung, ist proportional zur Konzentration der Autoantikörper in                   Produkte, die humanes Material enthalten, müssen mit größter
den Proben. Die Konzentration der anti-Gangliosid-Antikörper                       Vorsicht und nach den Vorgaben der guten Labor Praxis (GLP)
wird quantitativ als Verhältnis von der Probe zum Kalibrator                       verarbeitet werden.
angegeben (% Ratio).
                                                                                      ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL
         GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG                                    • Präzisionspipetten für 20 µl, 100 µl und 1 ml.
Reagenz                        Inhalt       Art.-Nr.    Rekonstitution             • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Mikrotiter-Platte              2 x 8 x 12                                            Vorbereitung der Verdünnungsproben.
                                            B-GCO-MP    Gebrauchsfertig
Beschichtet mit Gangliosiden   Küvetten
Abdeckfolien                   6 Stück                                             • 1000 ml Zylinder zur Verdünnung des Waschpuffers.
Waschpuffer Konzentrat
                               2 Flaschen
                                                        Mit 900 ml                 • Mikrotiter-Platten-Waschgerät      oder    Spritzflasche  für
(10x)                                     B-GCO-WB      deionisiertem                Waschpuffer.
                               100 ml
Mit Konservierungsmitteln                               Wasser verdünnen
Inkubationspuffer              2 Flaschen
                                                                                   • Saugfähiges Papier
Mit Konservierungsmitteln      100 ml
                                          B-GCO-IB      Gebrauchsfertig            • Mikrotiter-Platten-Schüttler.
Kalibrator                                              Mit 1.5 ml                 • Mikrotiter-Platten-Photometer mit optischem Filter (450 nm).
lyophilisiert mit              1 Flasche    B-GCO-CA    Inkubationspuffer
Konservierungsmitteln                                   versetzen                              UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG
Kontrollen Negativ, Tief und                            Mit 1.5 ml                 •   Dieser Test benötigt <0.1 ml Blut oder <50 µl Serum.
                                          B-GCO-
Mittel; lyophilisiert mit      3 Flaschen               Inkubationspuffer
Konservierungsmitteln
                                          CONSET
                                                        versetzen                  •   Hämolytische lipämische oder ikterische Proben können
Enzymmarker-IgG                                                                        nicht verwendet werden.
Anti-human-IgG AK, gekoppelt
                               1 Flasche                                           •   Blutproben in den entsprechenden Röhrchen sammeln
mit HRP in einem Protein-                   B-GCO-ELG Gebrauchsfertig
basierten Puffer mit
                               11 ml                                                   (ohne Antikoagulanzien). Hämolyse vermeiden. Eine
Konservierungsmitteln                                                                  Stunde lang bei RT (18-28°C) gerinnen lassen. 10 Minuten
Enzymmarker-IgM                                                                        lang bei RT und ca. 1500 x g zentrifugieren, danach das
Anti-human-IgM AK, gekoppelt                                                           Serum abgiessen.
                               1 Flasche
mit HRP in einem Protein-                   B-GCO-ELM Gebrauchsfertig
basierten Puffer mit
                               11 ml                                               •   Für die Probenlagerung empfehlen wir die Herstellung von
Konservierungsmitteln                                                                  Aliquots um wiederholte Einfrier-/Auftauzyklen zu
TMB-Substrat
                               2 Flaschen
                                                                                       vermeiden. Für bis zu 4 Monate können die Serumproben
in Zitrat-gepufferter H2O2-               B-TMB         Gebrauchsfertig                bei ≤ -20°C gelagert werden. Für die längerfristige Lagerung
                               11 ml
Lösung
Stopp-Lösung                   2 Flaschen               Gebrauchsfertig
                                                                                       empfehlen         wir        die        Lagerung          bei
                                          B-STS                                        -70°C (Probenstabilität >1 Jahr). Proben sollten vor dem
0.25 M Schwefelsäure           11 ml                    Korrosiv
                                                                  Table 3              Gebrauch aufgetaut und durch gründliches Vortexen gut
                                                                                       gemischt werden.




Revision date:   2009-06-02                                                 5/20                           BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                TECHNISCHE HINWEISE                    Bestimmung des IgM Isotyps:
Empfehlung für die Test Durchführung                                5. Die Schritte 4a – 4e unter Verwendung der nachfolgenden
Die Testresultate und deren Auswertung kann durch                      Mikroküvetten wiederholen.
verschiedene Faktoren beeinflusst werden. Die strikte
Einhaltung der vorgeschriebenen Testdurchführung und der            6. Mikrotiterplatte mit einer Abdeckfolie abdecken und 2
Präanalytik, insbesondere der folgenden Schritte wird                  Stunden ± 5 Minuten bei 2-8°C inkubieren (ohne Benutzung
empfohlen:                                                             eines Plattenschüttlers).
• Schritt 3-10: Auf 2-8°C gekühlte Reagenzien sollen in allen       7. Abdeckfolie entfernen, die Mikroküvetten entleeren und
  diesen Schritten verwendet werden und sie sollen während             dreimal mit jeweils ≥300 µl kaltem Waschpuffer waschen.
  des Pipettierens kalt gehalten werden.                               Platte durch Ausschlagen auf saugfähigem Papier sorgfältig
                                                                       trocknen, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen.
• Schritte 3, 7, 10: Die Kavitäten müssen nach dem letzten
  Waschzyklus vollständig entleert werden.                          8. 100 µl Enzymkonjugatlösung zu jeder Mikroküvette
                                                                       zugeben.
• Schritt 11: Das verwendete TMB Substrat muss auf Raum-
  temperatur (18-28°C) gebracht werden.                             9. Mikrotiterplatte mit einer Abdeckfolie abdecken und
                                                                       2 Stunden ± 5 Minuten bei 2-8°C inkubieren. Die Inkubation
• Schritt 12: Während der Substratinkubation muss die Platte           soll nicht auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler erfolgen.
  geschüttelt werden. Die angegebenen rpm (400-600) können
  nicht direkt auf jeden Schüttler übertragen werden. Die           10. Abdeckfolie entfernen, die Mikroküvetten entleeren und
  Lösung in den Kavitäten soll in Bewegung gebracht werden,             dreimal mit jeweils ≥300 µl kaltem Waschpuffer waschen.
  darf aber nicht überschwappen.                                        Platte durch Ausschlagen auf saugfähigem Papier sorgfältig
                                                                        trocknen.
• Wird ein Waschautomat eingesetzt, soll der sogenannte
  „Platten-Modus“ gewählt werden. Das heisst, dass das              Wichtig: TMB-Substratlösung auf 18-28°C äquilibrieren.
  Einfüllen des Waschpuffers erst über die gesamte Platte           11. 100 µl TMB-Substratlösung zu jeder Mikroküvette zugeben.
  ausgeführt wird, bevor das Absaugen gestartet wird.
                                                                    12. Mikrotiterplatte mit Abdeckfolie abdecken und 30 ± 2
                                       ARBEITSANLEITUNG                 Minuten bei 18-28°C auf einem Mikrotiterplattenschüttler
1. Patientenproben mit Inkubationspuffer 1:50 verdünnen                 bei 400-600 rpm inkubieren. Platte vor direktem Licht
   (z.B. 20 µl Serum + 980 µl Inkubationspuffer), mit dem               schützen.
   Vortexer gut mischen und anschliessend, vor dem
   Pipettierschritt 4, die verdünnten Proben, den                   13. 100 µl Stopp-Lösung zu jeder Mikroküvette zugeben und
   rekonstituierten Kalibrator und die Kontrollen 30 Minuten            Luftblässchen mit Pipettenspitzen entfernen.
   lang bei 2-8° C äquilibrieren.                                   14. Messen der optischen Dichte bei 450 nm innerhalb der
2. Eine Mikrotiterplatte mit ausreichend Streifen für das               nächsten 30 Minuten.
   Testen der gewünschten Proben bestücken. Ungebrauchte                                                             RESULTATE
   Streifen vom Halter entfernen und sofort mit dem                 Standardisierung
   Trockenmittel verpacken und gekühlt lagern.                      Kalibrator und Kontrollen von BÜHLMANN GanglioCombi®
Wichtig: In den Schritten 3 bis 10 gekühlte (2-8°C)                 ELISA sind gegen ein internes Referenzmaterial kalibriert.
   Lösungen benutzen.
                                                                    Auswertung:
3. Mikroküvetten zweimal mit jeweils ≥300 µl kaltem                 1. Optische Dichte aller Mikroküvetten (Kalibrator, Kontrollen
   Waschpuffer waschen. Waschpuffer dekantieren und                    und Patientenproben) bei 450 nm messen.
   Platte durch Ausschlagen auf saugfähigem Papier                  2. Mittelwert aus den Doppelmessungen kalkulieren (falls
   sorgfältig                                                          möglich).
   trocknen, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen.           3. Resultate werden als Verhältnis zwischen der Absorption der
Bestimmung des IgG Isotyps:                                            gemessenen Proben und Kontrollen und der Absorption des
                                                                       Kalibrators (Mittelwert) angegeben
4a. 100 µl Kalibrator in die Mikroküvette A1 pipettieren.
                                                                               Absorbtion der Proben, Kontrollen
4b. 100 µl Kontrolle Medium in die Mikroküvette B1, 100 µl
    Kontrolle Low in die Mikroküvette A2 und 100 µl Kontrolle       % Ratio:                                         x 100
    Negative in B2 pipettieren (siehe Figure 1).                               Absorption des Kalibrators
HINWEIS: Falls mehr als drei Streifen pro Isotyp benutzt
   werden, können Kalibrator und         Kontrollen als
   Doppelwert in die übrigbleibenden Mikroküvetten der              Ein Auswerteprogramm zur Ermittlung der % Ratios ist auf den
   Reihen A und B pipettiert werden.                                meisten Mikrotiterplatten–Readern vorhanden.
4c. 100 µl Serumprobe 1 in die Mikroküvetten C1-H1
    pipettieren (siehe Figure 1).                                   Table 11 zeigt typische Messwerte für den BÜHLMANN
4d. 100 µl Serumprobe 2 in die Mikroküvetten C2-H2 pipettieren      GanglioCombi® ELISA. Die Daten dienen nur als Beispiel. Die
    (siehe Figure 1).                                               Absorptionswerte des Kalibrators und der Kontrollen müssen bei
                                                                    jeder Testdurchführung neu ermittelt werden.
4e. 100 µl Serumproben 3-12 in die nächsten Mikroküvetten
    pipettieren, so wie es in Figure 1 dargestellt ist.




Revision date:   2009-06-02                                  6/20                      BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                    QUALITÄTSKONTROLLE                                 ERWARTETE WERTE UND CUT-OFF RATIO
Ein vollständiges Verständnis dieser Packungsbeilage ist für         In Zusammenarbeit mit den unten aufgeführten Institutionen
den erfolgreichen Gebrauch des Produktes notwendig.                  wurde der klinische Cut-Off auf 50% gesetzt. Werte < 30% sind
Zuverlässige Resultate werden nur durch die Anwendung                als sicher negativ einzustufen.
„Guter Laborpraxis“ (aktuelle GLP Richtlinien) und die               Die Werte wurden auf Grundlage einer Auswertung von n=200
Einhaltung der Arbeitsanleitung erreicht.                            Blutspendern1 (Männer und Frauen zwischen 18 und 70 Jahren)
Da es keine kommerziell erhältlichen Kontrollen für Anti-            und n=277 Proben von Patienten mit pathologischen Befunden2
Gangliosid-Autoantikörper gibt, wird empfohlen, positive             ermittelt. Die Seren wurden auf jedes der 6 Gangliosid-
Serumproben als interne Qualitätskontrolle anzuwenden.               Antikörper (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b und GQ1b)
Alle Kontrollen müssen im etablierten Vertrauensbereich (%           entsprechend der Arbeitsvorschrift analysiert. Die Resultate der
Ratio) liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind Lot-       Blutspender sind in Table 15 dargestellt.
spezifisch und auf dem zusätzlichen Kontrollblatt angegeben.
Falls die Leistungsmerkmale des Tests nicht in den                   Richtwerte für die Beurteilung der Ergebnisse:
angegebenen Bereichen liegen und Wiederholungs-
messungen ein technisches Problem ausschliessen, sind                     Kategorie                   Ratio (%)
folgende Bedingungen zu überprüfen: i) Wurden alle
Reagenzien in Schritt 3-10 bei 2-8°C verarbeitet? ii) Pipetten,           Negativ                     < 30%
Temperatur- und Zeitmessende Geräte, iii) Photometer                      Grauzone                    30-50%
Eichung, iv) Verfallsdaten der Reagenzien, v) Lagerung- und
Inkubations-Bedingungen, vi) die TMB Substratlösung sollte                Cut-off                     50%
farblos sein, vii) Wasserreinheit.
                                                                          Positiv                     >50-100%
                                 LEISTUNGSMERKMALE                        Stark positiv               >100%
Intra-Assay-Präzision (Within-Run): 4.7 %. Die Intra-Assay-
Präzision wurde aus 12 Werten einer Probe mit anti-
Gangliosid- IgM und/oder IgG- Autoantikörpern im gleichen            1)
Ansatz, unter Verwendung der individuellen Enzymkonjugate                 Erhalten vom Blutspendezentrum der Universität Basel
                                                                     2)
für anti-IgG und anti-IgM (B-GCO-ELG, B-GCO-EL M),                        Erhalten vom Friedrich-Baur-Institut, der Ludwig-Maximilians-
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Table 12 als % Ratio                     Universität München, Neurologie der Universität Basel und von
angegeben.                                                                der Neurologischen Klinik, Universität Lyon.

Inter-Assay-Präzision (Run-to-Run): 16.3 %. Die Inter-Assay-
Präzision wurde durch die Messung von zwei positiven                 Übersetzung der Legende von Table 15 auf Seite 17:
Serumproben mit anti-Gangliosid- IgM und/oder IgG-
Autoantikörpern, unter Verwendung der Enzymkonjugate IgG             Häufigkeit (%) der individuellen Anti-Gangliosid-Autoantikörper
und IgM (B-GCO-ELG, B-GCO-EL M), in 20 verschiedenen                 bestimmt mit EK-GCO-GM und klassifiziert in Titerkategorien:
Ansätzen bestimmt. Die ermittelten Werte sind in Table 13 als
% Ratio angegeben.                                                   Anti-Gangliosid-Autoantikörper vom Typ IgG:

Verdünnungslinearität: Eine Verdünnung der getesteten                        Negativ: ≥94.6 % der Blutspender
Serumproben führt in einem Bereich zwischen 30 und 200 %                     Grauzone : < 3.5 % der Blutspender für alle Anti-
Ratio zu einer kontinuierlichen Abnahme der % Ratio.                         Gangliosid-Autoantikörper
                                                                             Positiv: < 3.5 % der Blutspender für alle Anti-Gangliosid-
Spezifität: Verschiedene Patientenseren mit spezifischen anti-               Autoantikörper
Gangliosid- IgM und/oder IgG- Autoantikörpern wurden über                    Stark positiv: < 1.5 % der Blutspender für alle Anti-
Nacht mit dem entsprechenden gelösten Antigen inkubiert und                  Gangliosid-Autoantikörper
danach im BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA getestet. Bei
einer spezifischen Antigenkonzentration zwischen 10 und 100          Anti-Gangliosid-Autoantikörper vom Typ IgM:
μg/ml konnte eine 50% Inaktivierung der entsprechenden                       Negativ: ≥92.7 % der Blutspender
Autoantikörper beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).                      Grauzone : < 7.0 % für GA1 und <4.1 % für alle anderen
Analytische Sensitivität: Zwölf Replikate mit Inkubations-                   Anti-Gangliosid-Autoantikörper
Puffer wurden im gleichen Ansatz für jeweils mit IgG und IgM                 Positiv: < 2.5 % der Blutspender für alle Anti-Gangliosid-
Konjugat (B-GCO-ELG, B-GCO-EL M) angesetzt. Die                              Autoantikörper
Nachweisgrenze, ausgerückt als % Ratio zum Kalibrator,                       Stark positiv: < 0 % der Blutspender für alle Anti-Gangliosid-
wurde aus dem Mittelwert + 2 Standardabweichungen der                        Autoantikörper
gemessenen Werte berechnet, und liegt bei 6.4 %. Die
Ergebnisse sind in Table 14 dargestellt.




Revision date:   2009-06-02                                   7/20                          BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                             FRANCAIS                                                                   STOCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS
                                                                                                           Réactifs non ouverts / non entamés
                                  DOMAINE D’UTILISATION
La trousse BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA a été conçue                                   Stables à 2-8°C jusqu’à la date de péremption imprimée sur l’étiquette.
pour est conçue pour quantifier les taux sériques d’auto-                                                     Réactifs ouverts / reconstitués
anticorps IgG et IgM humaines dirigés contre les gangliosides
                                                                                                                Replacer immédiatement les barrettes non utilisées
plus important GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b et GQ1b (1-8) (2                                                       dans le sachet en aluminium contenant le
profils/patient).                                                                      Microplaque
                                                                                                                dessiccateur puis le refermer soigneusement. Stable
                                                                                                                pendant 4 mois à 2-8°C.
                                       PRINCIPE DU DOSAGE                              Tampon de lavage         Stable durant 4 mois à 2-8°C.
Le test de dosage BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA est                                     Calibrateur              Stable durant 1 mois à 2-8°C. Ne pas congeler!
basé sur une méthode immuno-métrique de type “sandwich”                                Contrôles                Stables durant 1 mois à 2-8°C. Ne pas congeler!
amplifiée par une réaction enzymatique. Les gangliosides GA1,                          Tampon d’incubation
                                                                                       Marqueurs
GM1, GM2, GD1a, GD1b et GQ1b ont été coatés                                            enzymatiques
                                                                                                                Stable à 2-8°C jusqu’à la date de péremption
successivement sur une microplaque. Les échantillons                                                            imprimée sur l’étiquette
                                                                                       Substrat TMB
sériques à tester ainsi que le calibrateur et les contrôles sont
                                                                                                                Stable à 18-28°C jusqu’à la date de péremption
incubés dans la microplaque durant deux heures. Les auto-                              Solution Stop
                                                                                                                imprimée sur l’étiquette
anticorps anti-gangliosides présents sont liés aux gangliosides                                                                                         Table 6
coatés. Après l’élimination par lavage des molécules non-liées,
d’anticorps (Ac) dirigés contre les IgG ou IgM humaines
conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) est ajouté aux puits                                 RECOMMANDATIONS ET PRECAUTION D’EMPLOI
et la microplaque est incubée une nouvelle fois durant deux                           Le calibrateur (B-GCO-CA) et les contrôles de cette trousse (B-
heures. Après un second lavage, ayant pour but d’éliminer les                         GCO-CONSET) contiennent des composants d’origine
anticorps     marqués       non-liés,   le     substrat    TMB                        humaine. Chaque unité sérique de donneur utilisée dans la
(tétraméthylbenzidine) est ajouté, induisant une coloration                           préparation des réactifs de la trousse a été testée par une
bleue dont l’intensité est proportionnelle à la quantité                              méthode approuvée par la FDA et a été séronégative pour
d’anticorps anti-gangliosides initialement liés. La réaction de                       l’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) et pour les
coloration est arrêtée par l’ajout d’une solution stop acide                          anticorps anti-VIH1/2. Cependant, bien que ces méthodes soient
faisant passer la couleur du bleu au jaune. L’intensité de la                         très fiables, il ne peut être garanti que ce matériel ne puisse
coloration est déterminée par la mesure de l’absorption à 450                         transmettre une hépatite B ou le SIDA.
nm. L’absorbance mesurée est proportionnelle à la                                     En conséquence, tous les échantillons ainsi que les réactifs
concentration d’anticorps anti-gangliosides présents dans les                         doivent être manipulés comme s’ils étaient infectieux. Tous les
échantillons. Les taux d’anticorps anti-gangliosides sont                             produits contenant du matériel d’origine humaine doivent être
exprimés quantitativement à l’aide d’un calibrateur.                                  manipulés conformément aux bonnes pratiques de laboratoire et
                                                                                      en respectant les précautions d’usage.

                         REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION                                                   MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
 Réactifs                        Quantité    Code        Reconstitution               • Pipettes de précision de 20 µl, 100 µl et 1 ml avec pointes
 Microplaque                     2 x 12 x 8
                                                                                        jetables.
                                            B-GCO-MP     Prête à l’emploi             • Tubes en polystyrène ou polypropylène jetables, pour la
 Coatée (gangliosides)           puits
 Film adhésif                    6 pièces                                               préparation des dilutions.
 Tampon de lavage,                                       A reconstituer avec          • Eprouvette graduée de 1000 ml pour la préparation de la
                                 2 flacons
 Concentré (10x)
                                 100 ml
                                             B-GCO-WB    900 ml d’eau                   dilution du tampon de lavage.
 avec agents de conservation                             déionisée                    • Laveur automatique de microplaques ou pissette pour le
 Tampon d’incubation             2 flacons                                              tampon de lavage.
                                             B-GCO-IB    Prêt à l’emploi
 avec agents de conservation     100 ml
                                                                                      • Papier absorbant.
 Calibrateur                                             A reconstituer avec
 lyophilisé et avec agents de    1 flacon    B-GCO-CA    1.5 ml de tampon             • Agitateur de microplaques.
 conservation                                            d'incubation                 • Lecteur de microplaques pour la mesure de l’absorbance à
 Contrôles négatif, bas,
                                                         A reconstituer avec            450 nm.
 moyen                                       B-GCO-
                                 3 flacons               1.5 ml de tampon
 lyophilisés et avec agents de               CONSET                                    PRELEVEMENT, PREPARATION ET CONSERVATION DES
                                                         d'incubation
 conservation
 Marqueur enzymatique
                                                                                                                                     ECHANTILLONS
 Ac anti-IgG humaines                                                                 • La procédure requiert <0.1 ml de sang ou <50 µl de sérum.
                                 1 flacon
 conjugués à HRP dans un
                                 11 ml
                                             B-GCO-ELG Prêt à l’emploi                • Ne pas utiliser d’échantillons hémolytiques ou ictériques.
 tampon protéique avec agents
 de conservation
                                                                                      • Prélever le sang dans des tubes prévus à cet usage en
 Marqueur enzymatique                                                                    évitant l’hémolyse, laisser coaguler à température ambiante
 Ac anti-IgM humaines                                                                    (18-28°C) pendant 1 heure, centrifuger à environ 1500 x g à
                                 1 flacon
 conjugués à HRP dans un
                                 11 ml
                                             B-GCO-ELM Prêt à l’emploi                   température ambiante et recueillir le sérum.
 tampon protéique avec agents
 de conservation
                                                                                      • Nous recommandons d’aliquoter les échantillons des
 Substrat TMB                                                                            patients avant de les stocker afin d’éviter les cycles répétés
                                 2 flacons
 TMB dans un tampon citrate
                                 11 ml
                                             B-TMB       Prêt à l’emploi                 de congélation/décongélation. Conserver les échantillons de
 avec H2O2                                                                               sérum à ≤–20°C durant 4 mois. Nous recommandons -70°C
 Solution Stop                   2 flacons               Prête à l’emploi                pour la conservation à long terme (échantillons dont la
                                             B-STS
 acide sulfurique 0.25 M         11 ml                   Corrosif
                                                                                         stabilité est >1 année).
                                                                       Table 5
                                                                                      • Les échantillons congelés doivent être décongelés et
                                                                                         homogénéisés par agitation ou par inversion avant leur
                                                                                         utilisation.



Revision date:    2009-06-02                                                   8/20                           BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                                                            Détermination de l’isotype IgM
                                 REMARQUES TECHNIQUES                    5. Répéter les étapes 4a-e en utilisant les barrettes suivantes.
Recommandations et Mises en garde                                        6. Couvrir la plaque à l’aide du film adhésif fourni et incuber à
Les résultats et le devenir de l’expérience peuvent être                    2-8°C pendant 2 heures ± 5 minutes. Il n’est pas nécessaire
influencés par plusieurs facteurs. Il est recommandé de                     d’agiter la microplaque.
respecter strictement le protocole et ses aspects pré-
analytiques. En particulier, nous recommandons de suivre les             7. Retirer et jeter le film adhésif. Vider puis laver 3 fois chaque
étapes suivantes:                                                           puits avec ≥300 µl de tampon de lavage réfrigéré. Vider les
                                                                            puits et les sécher en tapant la microplaque sur du papier
• Etapes 3-10: Utiliser des réactifs réfrigérés (2-8°C) pour                absorbant afin d’éliminer complètement le tampon de
  toutes ces étapes et les conserver réfrigérés durant le                   lavage.
  pipetage.
                                                                         8. Ajouter 100 µl de marqueur enzymatique dans chaque
• Etapes 3, 7, 10: S’assurer de vider les puits complètement                puits.
  après le dernier cycle de lavage.
                                                                         9. Recouvrir la plaque à l’aide d’un nouveau film adhésif et
• Etape 11: S’assurer d’utiliser du substrat TMB porté à                    incuber à 2-8°C pendant 2 heures ± 5 minutes. Il n’est pas
  température ambiante (18-28°C).                                           nécessaire d’agiter la microplaque.
• Etape 12: Bien agiter les microplaques durant l’incubation             10. Retirer et jeter le film adhésif. Vider puis laver 3 fois chaque
  avec le substrat. Les rpms données (400-600) ne s’appliquent               puits avec ≥300 µl de tampon de lavage froid. Vider les
  pas à tous les agitateurs de microplaques. La solution doit                puits et les sécher en tapant la microplaque sur du papier
  s’agiter dans les puits mais sans déborder.                                absorbant.
• Pour les laveurs automatiques, BÜHLMANN utilise le mode                Important: Laisser la solution de substrat atteindre une
  “plate mode” i.e. chaque étape du processus (distribution ou           température de 18-28°C.
  “dispense“) est réalisée séquentiellement pour toutes les
  barrettes, avant de procéder à l’étape suivante du processus           11. Ajouter 100 µl de solution de substrat dans chaque puits.
  (aspiration).                                                          12. Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif puis
                                                   PROCEDURE                 l’incuber sur un agitateur de microplaque à 400-600 rpm à
1. Effectuer une dilution au 1:50 des échantillons de patient                18-28°C durant 30 ± 2 minutes. Protéger la microplaque de
   avec le tampon d’incubation (ex. 20 µl de sérum + 980 µl de               la lumière directe.
   tampon d’incubation). Mélanger avec soin (vortex) et laisser          13. Ajouter 100 µl de solution stop dans chaque puits en
   reposer les échantillons dilués, le calibrateur et les contrôles          éliminant les bulles d’air à l’aide de pointes de pipettes.
   reconstitués 30 minutes à 2-8 °C (pour atteindre l’équilibre)             Passer à l’étape 14 dans les 30 minutes suivantes.
   avant de passer au pipetage de l’étape 4.
                                                                         14. Lire l’absorbance à 450 nm dans à l’aide d’un lecteur de
2. Préparer une microplaque avec suffisamment de barrettes                   microplaques.
   pour tester le nombre désiré d’échantillons. Retirer les
   barrettes en trop du support et les remettre immédiatement                                                          RESULTATS
   au froid dans le sachet prévu à cet effet et contenant le             Standardisation
   dessiccateur.                                                         Le calibrateur de la trousse BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA
                                                                         des LABORATOIRES BÜHLMANN a été calibré à l’aide d’un
Important: N’utiliser que des réactifs réfrigérés (2-8° C)               matériau référence interne.
pour les étapes 3 à 10.
3. Laver chaque puits de la microplaque 2 fois avec ≥300 µl de           Calculation des resultats :
   tampon de lavage froid. Vider les puits et taper la micro-            1. Mesure de l’absorbance (OD) de chaque puits à 450 nm
   plaque sur du papier absorbant afin d’éliminer                           (contrôles et échantillons de patient).
   complètement le tampon de lavage.                                     2. Calcul de la moyenne des deux valeurs obtenues (si les
                                                                            mesures sont réalisées en duplicata).
   Détermination de l’isotype IgG                                        3. Les résultats sont exprimés en pourcentage de
                                                                             l’absorbance de l’échantillon et contrôles par rapport à
4a. Distribuer 100 µl de calibrateur dans le puits A1 (voir Figure
                                                                             l’absorbance moyenne du calibrateur:
    1).
4b. Distribuer 100 µl de contrôle moyen dans le puits B1, 100 µl                         absorbance des échantillons, contrôles
                                                                         Rapport (%) :                                          × 100
    de contrôle bas dans le puits A2 et 100 µl de contrôle                                   absorbance du calibrateur
    négatif dans le puits B2 (voir Figure 1).
REMARQUE: Si plus de trois barrettes sont utilisées par
  isotype, distribuer calibrateur et contrôles en double                 La programmation de cette formule est réalisable sur la plupart
  dans les puits de contrôle restants aux rangées A et B.                des lecteurs de microplaque.
  (voir Figure 1).
4c. Distribuer 100 µl de sérum dilué du patient No. 1 dans les
    puits C1 à H1 (voir Figure 1).                                       REMARQUE:
                                                                         Pour un exemple de résultats, voir Table 11. Ces résultats sont
4d. Distribuer 100 µl de sérum dilué du patient No. 2 dans les           donnés à titre d’exemple uniquement. Les valeurs d’absorbance
    puits C2 à H2 (voir Figure 1).                                       du calibrateur et des contrôles doivent être déterminées pour
4e. Distribuer 100 µl de sérum dilué du patient No. 3 à 12 dans          chaque série d’échantillons mesurée.
    les puits suivants (voir Figure 1).

Revision date:   2009-06-02                                       9/20                       BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                           CONTROL QUALITE               VALEURS DES REFERENCES ET RAPPORTS (%)
Une lecture exhaustive de ce manuel est recommandée pour                 En accord avec les institutions mentionnées ci-dessous, nous
l’utilisation correcte de ce produit. Des résultats fiables ne           avons établi un « cut off » (valeur seuil) clinique de 50 %. Les
seront obtenus que par un travail en laboratoire précis (bonnes          valeurs inférieures à 30 % doivent clairement être considérées
pratiques de laboratoire usuelles) et en suivant fidèlement les          comme négatives. Les valeurs des rapports ont été obtenues
recommandations de cette brochure.                                       à partir des résultats de n=200 échantillons de donneurs de
Comme il n’existe pas de sérum de référence pour les                     sang normaux asymptomatiques (adultes de sexe masculin
anticorps anti-ganglioside commercialement disponible, nous              et féminin, âges compris entre 18 et 70 ans) 1) et n= 277
recommandons l’utilisation d’un pool de sérums positifs comme            échantillons pathologiques2). Les sérums ont été testés pour
référence de contrôle de qualité interne.                                chacun des six gangliosides (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b et
Tous les contrôles doivent avoir une valeur comprises entre les          GQ1b), conformément à la procédure d’utilisation du test. Les
limites de confiance établies. Les limites de confiance des              résultats des donneurs de sang sont présentés dans la Table
contrôles sont spécifiques à chaque lot et sont indiquées sur la         15.
feuille de contrôle contenue dans chaque trousse.
Les caractéristiques de performance devraient être comprise              Guide d’interprétatíon des rapports :
sentre les limites d’acceptabilité propres à chaque laboratoire.
Si les caractéristiques ne correspondent pas aux limites                      Catégorie                   Rapport (%)
établies et que les répétitions excluent toute erreur technique, il
est recommandé de contrôler les paramètres suivants: i) Avez-                 Négatif                     < 30 %
vous utilisé des réactifs réfrigérés (2-8°C) pour les étapes 3 à              Zone grise                  30 – 50 %
10 ? ii) pipetage, appareils de mesure de température et de
temps, iii) calibrage des instruments, iv) date de péremption                 Cut-off                     50 %
des réactifs, v) conditions de stockage et d’incubation, vi) la
                                                                              Positif                     > 50-100 %
solution de substrat TMB devrait être incolore, vii) pureté de
l’eau.                                                                        Fortement positif           > 100 %
                  CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE                        1)
Précision Intra-essai (Within-Run): 4.7 %. Elle a été calculée              Recueillis au centre de dons du sang, Hôpital Universitaire
à partir des résultats de 12 valeurs de 1 échantillon contenant             de Bâle.
                                                                         2)
auto-anticorps anti-ganglioside lors d’un même essai en                     Fournis par l’Institut Friedrich Baur de l’Université Ludwig-
utilisant les marqueurs enzymatiques anti-IgG et anti-IgM (B-               Maximilian de Munich; le Département de Neurologie de
GCO-ELG, B-GCO-EL M). Les résultats sont reportés dans la                   l’Université de Bâle et le Département Neurologique de
Table 12 sous forme de rapport (%) d’après la formule citée                 l’Université de Lyon.
plus haut.
                                                                         Traduction de la légende de la Table 15 en page 17 :
Précision Inter-essais (Run-to-Run): 16.3 %. Elle a été                  Donneurs de sang :
déterminée en mesurant deux échantillons contenant auto-                 Fréquence des auto-anticorps anti-ganglioside (exprimés en
anticorps anti-ganglioside au cours de 20 essais différents en           %) quantifiés avec EK-GCO-GM et classifiés en catégories de
utilisant les marqueurs enzymatiques anti-IgG et anti-IgM (B-            taux :
GCO-ELG, B-GCO-ELM). Les résultats sont reportés dans la
Table 13 sous forme de rapport (%) d’après la formule citée              Auto-anticorps anti-ganglioside de l’isotype IgG
plus haut.                                                                 Négatif :    ≥94.6     %     de     donneurs  de   sang.
Linéarité de la dilution: Les dilutions des échantillons sériques          Zone grise : <3.5 % pour touts les auto-anticorps anti-
testés présentèrent une diminution constante des % de                      gangliosides.
rapports obtenus entre 30 et 200 %.                                        Positif: <1.5 % des donneurs de sang pour tous les auto-
                                                                           anticorps anti-gangliosides.
Spécificité: Différents échantillons sériques de patients                  Fortement positif: <0.5 % des donneurs de sang pour tous
présentant des auto-anticorps anti-ganglioside spécifiques, IgM            les auto-anticorps anti-gangliosides.
et/ou IgG furent incubés durant une nuit avec l’antigène soluble
correspondant et analysés ensuite au moyen de la procédure               Auto-anticorps anti-ganglioside de l’isotype IgM
BÜHLMANN GanglioCombi® -GM ELISA. Une inactivation de                      Négatif :    ≥92.7     %     de     donneurs      de   sang.
50 % pour un auto-anticorps spécifique fut observée pour des               Zone grise : <7.0 % pour GA1 et < 3.5 % pour touts les
concentrations comprises entre 10 et 100 µg/ml d’antigène                  autres auto-anticorps anti-gangliosides.
spécifique (données non reportées).                                        Positif: <2.5 % des donneurs de sang pour tous les auto-
Sensibilité analytique: 12 réplicats de tampon d’incubation                anticorps anti-gangliosides.
furent mesurés au cours d’un même essai en utilisant les                   Fortement positif: <0.0 % des donneurs de sang pour tous
marqueurs enzymatiques anti-IgG et anti-IgM (B-GCO-ELG,                    les auto-anticorps anti-gangliosides dans cette group.
B-GCO-ELM). La limite de détection exprimée en % par
rapport au calibrateur se trouve à 6.4 % en ajoutant 2
déviations standards à la moyenne des 12 valeurs obtenues.
Les résultats sont reportés dans la Table 14.




Revision date:   2009-06-02                                      10/20                            BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
ITALIANO
                                                            USO                                     CONSERVAZIONE ED EMIVITA DEI REAGENTI
Il BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA, EK-GCO-GM, è un test                                                              Reagenti sigillati
diagnostico in vitro per la determinazione degli autoanticorpi più                 Tutti i componenti del kit non utilizzati sono stabili a 2-8°C fino alla data di
importante IgG ed / o IgM presenti nel siero umano diretti verso                   scadenza stampata sulle etichette.
GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b e GQ1b (1-8).                                                                    Reagenti Aperti/ Ricostituiti
Il è concepito per la quantificazione degli anticorpi isotipi IgG                                            Riporre immediatamente le strip non utilizzate nella
                                                                                   Micropiastra              busta di alluminio che contiene essiccante e
ed / o IgM (coniugato individuale IgG ed IgM; 2 profili per                                                  risigillarle. Conservare fino a 4 mesi a 2-8°C.
paziente).                                                                         Tampone di lavaggio       Conservare fino a 4 mesi a 2-8°C.
                                                                                   Calibratore               Conservare fino ad 1 mese a
                                      PRINCIPIO DEL DOSAGGIO                                                 2-8°C. Non congelare!
Il dosaggio BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA utilizza la                               Controlli
tecnica degli immunodosaggi di tipo sandwich amplificati                           Tampone di
enzimaticamente. Per ogni strip i gangliosidi GA1, GM1, GM2,                       incubazione               Conservare a 2-8° fino alla data di scadenza indicata
GD1a, GD1b e GQ1b sono singolarmente precoattati in ogni                           Marcati enzimatici        sulle etichette.
pozzetto. Il calibratore, i controlli ed i sieri dei pazienti vengono              Substrato di TMB
incubati per due ore nei pozzetti della micropiastra e gli                                                   Conservare a 18-28°C fino alla data di scadenza
                                                                                   Soluzione bloccante
                                                                                                             indicata sulla etichetta.
autoanticorpi antiganglioside (Ab) presenti vengono legati dai                                                                                          Table 8
gangliosidi adesi. Dopo lavaggio delle sostanze non legate
mercato enzimatico d’anticorpi coniugati con perossidasi di                                                          AVVERTENZE E PRECAUZIONI
rafano (HRP) vs gli anticorpi IgG ed / o IgM viene aggiunta ai                     Il calibratore (B-GCO-CA) ed i controlli di questo kit (B-GCO-
pozzetti ed incubata per altre due ore. A seguito di un secondo                    CONSET) contengono componenti di origine umana. Ciascun
lavaggio per eliminare il reagente anticorpo-enzima non legato,                    siero utilizzato nella preparazione dei componenti del kit è stato
viene aggiunta una soluzione di substrato contenente                               testato con un metodo approvato dall’FDA e trovato negativo per
tetrametilbenzidina (TMB) ai pozzetti. Si sviluppa una                             l’antigene di superficie dell’HBV, dell’HCV e per gli anticorpi anti-
colorazione blu in proporzione al quantitativo di autoanticorpi                    HIV1/2. Benché questi metodi siano altamente precisi, non vi
antiganglioside legati nello step iniziale. Lo sviluppo della                      sono garanzie che questo materiale non possa trasmettere
colorazione viene bloccato aggiungendo una soluzione                               l’epatite o l’AIDS. Quindi, tutti i campioni ed i componenti del kit
bloccante a base di acido che trasforma la colorazione blu in                      devono essere manipolati come se potessero trasmettere agenti
gialla. L’intensità dell’assorbanza del colore è misurata a 450                    infettivi. Tutti i prodotti contenenti materiale d’origine umana
nm. L’assorbanza misurata è direttamente proporzionale alla                        devono essere manipolati secondo quanto previsto dalle buone
concentrazione di anticorpi antigangliosidi presenti in un dato                    pratiche di laboratorio e adottando idonee precauzioni.
campione. I titoli degli autoanticorpi antigangliosidi sono
espressi come rapporto di un calibratore di riferimento (rapporto                  MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
percentuale).                                                                      • Pipette di precisione con puntali monouso: 20 µl, 100 µl e 1
                                                                                      ml.
                            REAGENTI FORNITI E PREPARAZIONE                        • Provette di polistirene o polipropilene monouso per la
Reagenti                        Quantità     Codice      Ricostituzione               preparazione di diluizioni del campione.
Micropiastra                    2 x 12 x 8                                         • Beute da 1000 ml per la ricostituzione del tampone di
                                             B-GCO-MP    Pronta all’uso               lavaggio.
Precoattata con gangliosidi     pozzetti
                                                                                   • Dispositivo manuale o automatico per il lavaggio /
Foglio per sigillare la piastra 6 fogli                                               aspirazione della micropiastra.
Tampone di lavaggio
                                                                                   • Carta blottante.
concentrato (10x)
                                2 flaconi
                                             B-GCO-WB
                                                         Diluire con 900 ml di     • Agitatore per micropiastra.
                                100 ml                   acqua deionizzata
Con conservanti                                                                    • Lettore per micropiastra per le misurazioni dell’assorbanza a
Tampone di incubazione          2 flaconi
                                             B-GCO-IB    Pronto all’uso
                                                                                      450 nm.
Con conservanti                 100 ml
                                                         Aggiungere 1.5 ml                       PRELIEVO DEI CAMPIONI E CONSERVAZIONE
Calibratore                     1 flacone
Liofilo con conservanti
                                             B-GCO-CA    di tampone di             •   La procedura richiede <0.1 ml di sangue e <50 µl di siero,
                                                         incubazione                   rispettivamente.
Controllo negativo, basso                                Aggiungere 1.5 ml
ed medio; Liofilo con           3 flaconi
                                             B-GCO-
                                                         di tampone di             •   Non utilizzare campioni grossolanamente emolizzati,
                                             CONSET                                    lipemici o itterici.
conservanti                                              incubazione
Marcato enzimatico                                                                 •   Prelevare il sangue in provette semplici (senza
Anticorpi Anti- IgG umane                                                              anticoagulanti), evitare l’emolisi, lasciare che coaguli per
                                1 flacone
coniugati con HRP in un                      B-GCO-ELG Pronto all’uso
tampone a base proteica con
                                11 ml                                                  un’ora, centrifugare per 10 minuti a circa 1500 x g e
conservanti                                                                            prelevare il siero.
Marcato enzimatico                                                                 •   BÜHLMANN raccomanda di aliquotare i campioni per
Anticorpi Anti- IgM umane                                                              evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento. I
                                1 flacone
coniugati con HRP in un                      B-GCO-ELM Pronto all’uso
tampone a base proteica con
                                11 ml                                                  campioni tenuti a ≤ -20°C sono stabili fino ad 4 mesi. Per
conservanti                                                                            periodi di conservazione più lunghi, (più di un anno) tenere i
Substrato di TMB                2 flaconi                                              campioni a -70°C.
                                             B-TMB       Pronto all’uso
in tampone citrato con H2O2     11 ml                                              •   I campioni congelati devono essere scongelati
Soluzione bloccante             2 flaconi
                                             B-STS
                                                         Pronto all’uso                completamente, quindi vortexati prima dell’utilizzo.
0.25 M di acido solforico       11 ml                    agente corrosivo
                                                                     Table 7




Revision date:      2009-06-02                                             11/20                           BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                         NOTE PROCEDURALI                7. Togliere ed eliminare il foglio protettivo. Svuotare i pozzetti e
Raccomandazioni e pozzetti per la procedura                                 lavarli tre volte utilizzando almeno 300 µl di tampone di
Risulati del dosaggio sono influenzati da molti fattori. È                  lavaggio refriggerato per pozzetto. Svuotare i pozzetti e
raccomandato seguire severamente il protocollo e fattori                    blottarli su carta assorbente assicurandosi che i pozzeti
preanalitici. In particolare raccomandiamo di seguire seguenti              siano completamente vuoti.
punti:                                                                   8. Aggiungere 100 µl di marcato enzimatico a tutti i pozzetti.
• Punto 3-10: Utilizzare reagenti refriggerati (2-8°C) durante il
  dispensamento.                                                         9. Coprire la piastra con il foglio protettivo ed incubare per 2
• Punto 3, 7, 10: Dopo l`ultimo ciclo di lavaggio delle strip,              ore ± 5 minuti a 2-8°C. (Non occorre utilizzare agitatore per
  assicurarsi che i pozzetti siano completamente vuoti.                     micropiastra).

• Punto 11: Assicurrarsi prima dell`uso che il substrato TMB             10. Togliere ed eliminare il foglio protettivo. Svuotare i pozzetti e
  raggiunga 18-28°C.                                                         lavarli tre volte utilizzando almeno 300 µl di tampone di
                                                                             lavaggio refrigerato per pozzetto. Svuotare i pozzetti e
• Punto 12: Mixare la micropiastra durante l`incubazione con il              blottarli su carta assorbente.
  Substrato TMB bene. Il settagio consigliato di 400-600 rpm
  non è adattabile per tutti i agitatori. La soluzione deve              Importante: Lasciare che il Substrato di TMB raggiunga 18-
  muoversi nei pozzetti ma non spruzzare fuori.                          28°C.

• Usando dispositivi automatici per lavaggio/ aspirazione                11. Aggiungere 100 µl del substrato di TMB ad ogni pozzetto.
  della micropiastra, BÜHLMANN usa “plate mode” in ogni                  12. Sigillare la piastra con un foglio protettivo, collocare la
  passo del lavaggio il dispesamento viene eseguito in ogni                  piastra su un mixer settato a 400-600 rpm, proteggere la
  strip sequenzialmente prima di procedere al prossimo                       piastra dalla luce diretta ed incubare per 30 ± 2 minuti a 18-
  passaggio d’aspirazione.                                                   28°C.
                                 PROCEDURA DEL DOSAGGIO                  13. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante ai pozzetti.
1. Diluire tutti i campioni 1:50 con il tampone di incubazione               Procedere al punto 14. entro 30 minuti.
   (ad es.: 20 µl di siero + 980 µl di tampone di incubazione).
                                                                         14. Leggere l’assorbanza a 450 nm in un lettore per
   Mescolare completamente vortexando e lasciare i campioni,
                                                                             micropiastra.
   il calibratore e i controlli per l`equilibrazione 30 minuti a 2-
   8°C prima di dispensare al punto 4.                                                                             RISULTATI E CALCOLO
2. Preparare una piastra con strip a sufficienza per effettuare il       Standardizzazione
   test del numero desiderato di campioni. Eliminare le strip in         Il controllo alto del kit BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA è
   eccedenza dal supporto e risigillarle immediatamente nella            stato calibrato verso un material di riferimento interno.
   busta insieme all’essiccante. Conservare refrigerato.
                                                                         Calcolazione dei resultati:
 Importante: Utilizzare reagenti refriggerati (2-8° C)                   1. Annotare l’assorbanza (OD) a 450 nm per ciascun pozzetto
 solamente dal punto 3. al punto 10.                                        (calibratore, controlli e campioni).
3. Lavare due volte i pozzetti coattati utilizzando almeno               2. Media dei controlli in duplicato (se disponibili).
                                                                         3. I risultati sono espressi come rapporto tra l’assorbanza dei
   300 µl di tampone di lavaggio refriggerati per pozzetto.                 campioni e controlli e l’assorbanza (media) del calibratore
   Svuotare i pozzetti e blottare la piastra su carta assorbente
   assicurandosi che i pozzeti siano completamente vuoti.                                assorbanza del Campione, Controlli
                                                                         % Rapporto :                                                 x 100
   Determinazione del isotype IgG                                                          assorbanza del Calibratore

4a. Dispensare 100 µl del calibratore nel pozzetto A1 (vedi
    illustrazione di cui di seguito).
                                                                         Programmi che calcolano diretamente I risutati in rapporto
4b. Dispensare 100 µl del controllo medio nel pozzetto B1,               percentuale, sono presenti su molti lettori per piastra.
    dispensare 100 µl del controllo basso nel pozzetto A2 e 100
    µl del controllo negativo nel pozzetto B2 (Vedi Figure 1).           NOTA:
NOTA: Se vengono usati più di tre strip per isotype,                     Per un esempio dei risultati vedi
  dispensare calibratore ed controlli in duplicato nei                   Table 11. I risultati sono forniti a solo scopo dimostrativo. I valori
  rimanenti pozzetti dei controlli nella fila A e B (Vedi                dell’assorbanza del calibratore e dei controlli devono essere
  Figure 1).                                                             generati per ciascun set di campioni da dosare.

4c. Dispensare 100 µl del siero diluito del paziente 1 nei
    pozzetti C1 - H1 (Vedi Figure 1).
4d. Dispensare 100 µl del siero diluito del paziente 2 nei
    pozzetti C2 - H2 (Vedi Figure 1).
4e. Dispensare 100 µl del siero diluito del paziente 3-12 nei
    pozzetti successivi come illustrato in Figure 1.
   Determinazione del isotype IgM
5. Repetire i punti 4a-4e utilizzante i pozzetti successivi.
6. Coprire la piastra con un foglio protettivo e incubare per 2
   ore ± 5 minuti a 2-8°C. (Non occorre utilizzare agitatore per
   micropiastra).
Revision date:   2009-06-02                                      12/20                        BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                        CONTROLLO DI QUALITA’                                                          Rapporto Percentuale
La piena comprensione di questa metodica è necessaria per un                In cooperazione con le istituzioni indicate, abbiamo stabilito un
uso ottimale del prodotto. Risultati affidabili potranno essere             cut-off clinico del 50%. Valori <30% si possono classificare come
ottenuti solo utilizzando tecniche di laboratorio precise (odierne          decisamente negativi. Il rapporto percentuale dei titoli sono stati
linee guida GLP) e seguendo accuratamente le istruzioni                     stabiliti su n= 200 donatori volontari1 (uomini e donne adulti, tra i
contenute in questa metodica. Poiché non vi è nessun siero di               18 e 70 anni) e n=277 sieri patologici2. I sieri sono stati dosati in
controllo per gli anticorpi antigangliosidi, disponibili in                 ogni singolo ganglioside (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b e
commercio, raccomandiamo l’utilizzo di un pool di siero positivo            GQ1b), secondo la procedura del test. I risultati dei donatori di
per i controlli di qualità interni. Tutti i controlli devono cadere         sangue sono presentati in Table 15.
entro i limiti di confidenza stabiliti. I limiti di confidenza per il
calibratore ed i controlli sono lotto specifici e stampati sul foglio       Linee guida per l'utilizzo di cut-off / titolo rapporti:
di lavoro addizionale.
Le prestazioni del dossagio dovrebbero essere dentro i limiti                   Categoria                  Titolo rapporti
stabiliti e l’accettabilità del laboratorio. Se le prestazioni non
correlano con i limiti stabiliti e la ripetizione esclude errori nella          Negativo                   < 30 %
tecnica, verificare quanto segue:                                               Zona grigia                30 – 50 %
i) Avete utilizzato reagenti refriggerati (2-8°C) durante il
dispensamento? ii) Dispensazione, controllo della temperatura e                 Cut-off                    50 %
dei dispositivi; iii) Settaggi del lettore ELISA; iv) Data di
                                                                                Positivo                   >50-100 %
scadenza dei reagenti; v) Conservazione e condizioni di
incubazione; vi) La soluzione di Substrato TMB deve essere                      Altamente positivo         > 100 %
incolore; vii) Purezza dell’acqua.
                                                                            1
                                PRESTAZIONI DEL DOSAGGIO                        Raccolti presso il centro di donazione di sangue, l'ospedale
                                                                                universitario di Basilea.
                                                                            2
Precisione intradosaggio: 3.5 %. La precisione del dosaggio                     Ricevuto da Friedrich-Baur-Istituto Ludwig-Maximilians-
è stata calcolata dai risultati di 12 valori di un campione positivo            University di Monaco; Dipartimento di Neurologia, Università di
contenenti autoanticorpi specifici antiganglioside IgM ed IgG in                Basilea; Neurologique, Università di Lyon.
un’unica seduta utilizzante i marcati enzimatici anti-IgG ed anti-
IgM (B-GCO-ELG, B-GCO-ELM). I valori sono forniti in Table                  Traduzione della pagina 17 Table 15:
12 come rapporto percentuale, (vei sopra).                                  Donatori di sangue:
                                                                            Distribuzione degli anticorpi antiganglioside (%) determinati con
Precisione interdosaggio (Da seduta-a-Seduta): 16.3 %. La                   EK-GCO-GM classificati nelle seguenti categogorie:
precisione interdosaggio è stata determinata misurando due
campioni di siero contenenti autoanticorpi specifici                        Autoanticorpi antiganglioside del isotype IgG
antiganglioside con BÜHLMANN GanglioCombi® in 20 sedute
diverse utilizzante i marcati enzimatici anti-IgG ed anti-IgM (B-               Negativo: ≥ 94.6% dei donatori di sangue.
GCO-ELG, B-GCO-EL M). I valori sono presentati in Table 13                      Zona grigia: <3.5% pour touts les auto-anticorps anti-
come rapporto percentuale, (vei sopra).                                         gangliosides.
Linearità di diluizione: Diluizione dei campioni di siero testato               Positivo: <3.5% dei donatori di sangue mostrano anticorpi
in una riduzione continua del rapporto percentuale tra 30 e 200                 antiganglioside.
rapporto percentuale.
                                                                                Altamente positivo: <1.5% dei donatori di sangue mostrano
Specificità: Diversi campioni di siero contenenti autoanticorpi                 per tutti gli autoanticorpi antiganglioside.
specifici antiganglioside IgM e/o IgG sono stati incubati durante
la notte con l’antigene solubile corrispondente e
successivamente        testati  nel   dosaggio      BÜHLMANN
GanglioCombi® -ELISA secondo quanto previsto dal dosaggio.                  Autoanticorpi antiganglioside del isotype IgM
Si può osservare un 50% di inattivazione per un autoanticorpo                   Negativo: ≥ 92.7% dei donatori di sangue.
specifico ganglioside ad una concentrazione di antigene
specifico da 10 a 100 µg/ml (dati non presenti).                                Zona grigia: <7.0% per GA1 ed <4.1% per tutti gli altri
                                                                                anticorpi antiganglioside.
Sensibilità analitica: Sono stati dosati 12 replicati in un’unica
seduta utilizzante i marcati enzimatici anti-IgG ed anti-IgM (B-                Positivo: <2.5% dei donatori di sangue mostrano anticorpi
GCO-ELG, B-GCO-EL M). Il limite di rilevazione espresso                         antiganglioside.
come rapporto percentuale del calibratore è stato calcolato a                   Altamente positivo: < 0.0% dei donatori di sangue mostrano
6.4% aggiungendo due deviazioni standard della media dei                        per tutti gli autoanticorpi antiganglioside.
replicati del tampone di incubazione. I risultati per i singoli
gangliosidi sono presentati in Table 14.




Revision date:   2009-06-02                                         13/20                         BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                              ESPAÑOL                                                   ALMACENAMIENTO Y DURACIÓN DE LOS REACTIVOS
                                                                                                                 Reactivos sin abrir
                                              USO PREVISTO                          Todos los componentes del kit sin abrir son estables a 2-8°C hasta la fecha de
El enzimoinmunoanálisis BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA                                caducidad impresa en la etiqueta.
ha sido diseñado para realizar la cuantitativa determinación                                           Reactivos abiertos / reconstituidos
diagnóstica in vitro de los mas relevantes autoanticuerpos IgG                                          Guarde inmediatamente las tiras que no ha utilizado en
e / o IgM de suero humano dirigidos contra GA1, GM1, GM2,                                               la bolsa de aluminio que contiene los sacos desecantes
                                                                                    Microplaca
GD1a, GD1b y GQ1b (1-8).                                                                                y vuelva a cerrarla completamente por toda la
                                                                                                        cremallera. Almacénese hasta 4 meses a 2-8°C.
                          PRINCIPIOS BÁSICOS DEL ENSAYO                             Tampón de lavado Almacénese hasta 4 meses a 2-8°C.
El enzimoinmunoanálisis BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA                                Calibrador
                                                                                                        Almacénese hasta 1 mes a 2-8°C. ¡ No lo congele!
utiliza la técnica de inmunoanálisis intercalado con                                Controles
amplificación enzimática. Se ha recubierto previamente una                          Tampón de
                                                                                    incubación
placa de microtitulación con gangliósidos GA1, GM1, GM2,                            Marcadores de       Almacénese a 2-8°C hasta la fecha de caducidad
GD1a, GD1b y GQ1b. El calibrador, los controles y sueros de                         enzima              impresa en las etiquetas
los pacientes se incuban durante dos horas en los pocillos de                       Solución substrato
microtitulación y los autoanticuerpos antigangliósidos                              Solución de          Almacénese a 18-28°C C hasta la fecha de caducidad
presentes se unen a los gangliósidos inmovilizados. Después                         interrupción         impresa en la etiqueta.
de eliminar con el lavado las sustancias no unidas, se añade a                                                                                          Table 10
los pocillos anticuerpos contra IgG e / o IgM humanas
                                                                                                             ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
marcados con peroxidasa de rábano (HRP) y se incuba
                                                                                    El calibrador (B-GCO-CA) y los controles de este kit (B-GCO-
durante dos horas más. Tras un segundo lavado para eliminar
                                                                                    CONSET) contienen componentes de origen humano. Todas
el reactivo anticuerpo-enzima no unido, se añade a los pocillos                     las unidades donadas de suero usadas en la preparación de los
una solución substrato que contenga tetrametilbenzidina                             componentes del kit han sido analizadas por un método
(TMB). Se desarrolla una coloración azul proporcional a la                          aprobado por la FDA, dando resultados negativos para el
cantidad de autoanticuerpos antigangliósidos unidos en el paso                      antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, y para los
inicial. El desarrollo del color se detiene con la adición de una                   anticuerpos del virus de la hepatitis C y VIH1/2 (virus de
solución de interrupción ácida que vira la solución de color azul                   inmunodeficiencia humana 1/2). Aunque estos métodos son
a amarillo. La intensidad de la absorbancia del color se mide a                     extremadamente exactos, no se garantiza que este material no
450 nm.                                                                             pueda transmitir hepatitis o SIDA. Por consiguiente, todas las
La absorbancia medida es directamente proporcional a la                             muestras de pacientes y todos los componentes del kit deben
concentración de autoanticuerpos antigangliósidos presentes                         ser manipulados como si fueran susceptibles de transmitir
en una muestra determinada. Las titulaciones de                                     infecciones. Todos los productos que contengan material de
autoanticuerpos antigangliósidos se expresan como cocientes                         origen humano deben ser manipulados de acuerdo con las
de un calibrador (% cociente).                                                      buenas prácticas de laboratorio y tomando las precauciones
BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA (EK-GCO-GM) ha sido                                    adecuadas.
diseñado para la cuantificar autoanticuerpos de isotipos IgG e /                                      MATERIALES NECESARIOS NO INCLUIDOS
o IgM (conjugato individual IgG e IgM ; 2 perfiles por paciente).
                                                                                    •   Pipetas de precisión con puntas desechables: pipetas de 20
                                                                                        µl, 100 µl y 1 ml.
                      REACTIVOS INCLUIDOS Y PREPARACIÓN                             •   Tubos desechables de poliestireno o polipropileno para la
Reactivos                        Cantidad     Código      Reconstitución                preparación de las diluciones de muestra.
Microplaca                                                                          •   Cilindro de 1000 ml para la reconstitución del tampón de
                                 2 x 12 x 8                                             lavado.
cubierta previamente con                      B-GCO-MP    Listo para usar
                                 pocillos
gangliósidos                                                                        •   Botella flexible para el tampón de lavado o dispositivo
Sellador de placas               6 unidades
                                                                                        automático de lavado y aspiración de placas de
                                                                                        microtitulación.
Tampón de lavado concentrado 2 botellas
                                                          Diluir con 900 ml         •   Papel secante.
con conservantes             100 ml
                                              B-GCO-WB    de agua                   •   Agitador de placas de microtitulación.
                                                          desionizada
                                                                                    •   Lector de placas de microtitulación para la medición de la
Tampón de incubación             2 botellas
con conservantes                 100 ml
                                              B-GCO-IB    Listo para usar               absorbancia a 450 nm.
                                                          Añadir 1,5 ml de                    RECOGIDA Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS
Calibrador; liofilizado con
                                 1 vial       B-GCO-CA    tampón de
conservantes
                                                          incubación                •   El procedimiento requiere <0,1 ml de sangre y <50 µl de
                                                          Añadir 1,5 ml de              suero.
Control negativo, bajo y medio                B-GCO-
Liofilizados con conservantes
                                 3 viales
                                              CONSET
                                                          tampón de                 •   No utilice muestras excesivamente hemolizadas o lipémicas
                                                          incubación                    ni muestras ictéricas. Recoja la sangre en tubos limpios,
Marcador de enzima
Anticuerpo anti-IgG humana       1 vial                   Listo para usar               evite la hemólisis, deje coagular durante una hora,
                                              B-GCO-ELG                                 centrifugue durante 10 minutos a unos 1500 x g y recoja el
conjugado con HRP en un tampón   11 ml                    Solución verde
de proteínas con conservantes                                                           suero.
Marcador de enzima                                                                  •   Para l’almacenaje recomendamos preparar partes alícuotas
Anticuerpo anti-IgM humana       1 vial                   Listo para usar
conjugado con HRP en un tampón   11 ml
                                              B-GCO-ELM
                                                          Solución verde                de muestras para evitar ciclos repetidos de congelación-
de proteínas con conservantes                                                           descongelación. Almacene las muestras del suero en ≤ -
Substrato de TMB                 2 viales                                               20°C para a 4 meses. Para el almacenamiento de larga
                                              B-TMB       Listo para usar
TMB en tampón citrato con H2O2   11 ml                                                  duración recomendamos -70°C (muestras que exhiben la
Solución de interrupción         2 viales                 Listo para usar               estabilidad de >1 año).
                                              B- STS
Ácido sulfúrico 0,25 M           11 ml                    Agente corrosivo          •   Las muestras congeladas deben descongelarse y
                                                                   Table 9              mezclarse completamente con un agitador vortex antes de
                                                                                        su uso.

Revision date:      2009-06-02                                              14/20                          BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                                                       5. Repite los pasos 4a-4e utilisando los siguientes pocillos.
                              NOTAS DEL PROCEDIMIENTO                  6. Cubra la placa con un sellador de placa e incube durante 2
Recomendaciones y advertencias para el funcionamiento                     horas ± 5 minutos a 2-8°C. No se agitan la placa.
Los resultados y el resultado del análisis se pueden influenciar       7. Retire y deseche el sellador de placa. Vacíe los pocillos y
por muchos factores. Terminantemente el pegarse al protocolo              lávelos tres veces utilizando como mínimo 300 µl de
y a los aspectos preanaliticos se recomienda. En detalle                  tampón de lavado refrigerado por pocillo. Vacíe los pocillos
recomendamos el atender a los pasos siguientes:                           y sacuda la placa firmemente en papel secante para
• Pasos 3-10: Utilice los reactivos refrigerados (2-8°C) en todos         eliminar tampón de lavado completamente.
  estos pasos y mantienalos a 2-8°C mientras de pipetear.              8. Añada 100 µl de marcador de enzima a todos los pocillos.
• Pasos 3, 7 y 10: Cerciórese de vaciar los pocillos totalmente        9. Cubra la placa con un sellador de placa e incube durante 2
  después del ultimo ciclo que de lavado.                                 horas ± 5 minutos a 2-8°C. No se agitan la placa.
• Paso 11: Cerciórese de utilizar el substrato de TMB que fue          10. Retire y deseche el sellador de placa. Vacíe los pocillos y
  equilibrado a la temperatura ambiente (18-28°C).                         lávelos tres veces utilizando como mínimo 300 µl de
• Paso 12: Agite las placas del microtítulación bien durante la            tampón de lavado refrigerado por pocillo. Vacíe los pocillos
  incubación con el substrato. Las RPM dadas (400-600) no                  y sacuda la placa firmemente en papel secante.
  solicitan cada rotor. La solución debe moverse en pocillos –         Importante: Deje que la solución substrato de TMB alcance
  evite salpicaduras.                                                  18-28°C.
• BÜHLMANN utilize una lavadora de placa automatizada,                 11. Añada 100 µl de la solución substrato de TMB a cada
  programada en "modo supuesto de placa" es decir que cada                 pocillo.
  paso de proceso (dispense) se realiza en todas las tiras
  secuencialmente, antes de procesar al paso siguiente                 12. Cubra la placa con un sellador de placas, coloque la placa
  (aspiración).                                                            en un mezclador de placas ajustado a 400-600 rpm, proteja
                                                                           la placa de la luz directa e incube durante 30 ± 2 minutos a
                             PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO                      18-28°C.
1. Diluya todas las muestras del paciente 1:50 con el tampón
                                                                       13. Añada 100 µl de solución de interrupción a todos los
   de incubación (p.ej. 20 µl de suero + 980 µl de tampón de
                                                                           pocillos. Continúe con el paso 14 al cabo de 30 minutos
   incubación). Mezcle completamente con un agitador vortex
                                                                           como máximo.
   y deje las muestras diluidas, el calibrador y los controles
   reconstituidos a 2-8°C durante 30 minutos (para                     14. Lea la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de
   equilibración) antes de pipetear en el paso 4.                          microtitulación.
2. Prepare una placa con tiras suficientes para probar el                                               RESULTADOS Y CÁLCULOS
   número deseado de muestras de pacientes. Retire las tiras           Estandardización
   sobrantes del soporte y guárdelas en la bolsa metalizada            El control alto del kit BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA está
   junto con los sacos desecantes sin demora. Almacénelo               calibrado frente a una reserva de referencia interna.
   refrigerado.
Importante: utilice sólo reactivos frios (2-8°C) en los pasos          Computacion de los resultados:
  3 a 10.                                                              1. Registre la absorbancia (OD) a 450 nm para cada pocillo
                                                                          (Calibrador, controles y muestras de pacientes).
3. Lave dos veces los pocillos recubiertos utilizando como             2. Calcule el promedio de los valores duplicados del calibrador
   mínimo 300 µl de tampón de lavado refrigerado por                      y de los controles (si estuvieran disponibles).
   pocillo. Vacíe los pocillos y sacuda la placa firmemente en         3. Los resultados se muestran como el cociente entre la
   papel secante para eliminar tampón de lavado                           absorbancia de las muestras y de los controles y la
   completamente.                                                         absorbancia (promedio) del calibrador (% cociente):
   Determinación del isotypo IgG:                                                     absorbancia de las muestras, controles
                                                                       % Cociente :                                               x100
4a. Pipetee 100 µl del calibrador en el pocillo A1 (véase imagen                      absorbancia del calibrador
    más abajo).
4b. Pipetee 100 µl del control medio en el pocillo B1, pipetee         Un programa para calcular % cocientes es disponible en la
    100 µl del control bajo en el pocillo A2 y 100 µl del control      mayoria de los lectores de placas.
    negativo en el pocillo B2 (véase Figure 1).
NOTA: Si se usan más de tres tiras por isotypo, pipetee                NOTA:
  calibrador y controles por duplicado en los pocillos de
  control restantes de las filas A y B (véase Figure 1).               Podrá encontrar un ejemplo de los resultados enTable 11. Los
                                                                       resultados sólo se muestran a modo de ejemplo. Se deben
4c. Pipetee 100 µl del suero diluido del paciente 1 en los             generar valores de absorbancia del calibrador y los controles
    pocillos C1 - H1 (véase Figure 1).                                 para cada conjunto de muestras que se vaya a ensayar.
4d. Pipetee 100 µl del suero diluido del paciente 2 en los
    pocillos C2 – H2 (véase Figure 1).
4e. Pipetee 100 µl del suero diluido del paciente 3-12 en los
    siguientes pocillos tal como se muestra en Figure 1.
   Determinación del isotypo IgM:

Revision date:   2009-06-02                                    15/20                      BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                                                                     VALORES ESPERADOS Y PUNTO DE CORTE
                                                                      Junto con las instituciones mencionadas abajo establecimos un
                                       CONTROL DE CALIDAD
                                                                      punto de corte de 50 %. Valores < 30 % se pueden clasificar
Es necesaria una completa comprensión de este prospecto
                                                                      claramente como negativos.
para que el uso del producto dé unos resultados satisfactorios.
                                                                      El establecimiento de cocientes del título se basa en n=200
Sólo se obtendrán resultados fiables utilizando técnicas de
                                                                      donantes de sangre 1 (hombres y mujeres adultos entre 18 a 70
laboratorio precisas (guías de Buenas Prácticas de Laboratorio
                                                                      años de edad) y n=277 muestras patológicas2.
actuales) y siguiendo cuidadosamente este prospecto.
                                                                      Los sueros fueron probados para cada uno de los seis
Dado que no hay suero de control para anticuerpos
                                                                      gangliósidos (GM1, GM2, GD1a, GD1b y GQ1b), según el
antigangliósidos disponible comercialmente, recomendamos el
                                                                      procedimiento de análisis. Los resultados de los donantes de
uso de una reserva de suero positivo para los controles de
                                                                      sangre se muestran en la Table 15.
calidad internos.
Todos los controles deben encontrarse dentro de los límites de
                                                                      Línea de guía para el uso de los cocientes del atajo/título:
confianza establecidos. Los límites de confianza para los
controles son específicos del lote y están impresos en la hoja
de datos adicional.                                                       Categoria                 Cocientes del título (%)
Las características de efficiencia deben encontrarse dentro de            Negativo                  < 30 %
los límites establecidos. Si las características no se
correlacionan con los límites establecidos y la repetición                Zona gris                 30 – 50 %
excluye errores de la técnica, compruebe los siguientes                   Cut-off                   50 %
aspectos: i) los reactivos estaban utilisado refrigerado a 2-8°C
en los passos 3-9? ii) instrumentos de pipeteado, control de              Positivo                  >50-100 %
temperatura y tiempo iii) ajustes del lector de ELISA iv) fechas
                                                                          Fuertemente positivo      > 100 %
de caducidad de los reactivos v) condiciones de
almacenamiento e incubación vi) la solución substrato con             1
TMB debe ser incolora vii) pureza del agua.                             recogidos en el centro de donación de sangre, hospital de la
                                                                      Universidad de Basilea.
                        CARACTERÍSTICAS DE EFICIENCIA                 2
                                                                          recibidas del Friedrich-Baur-Institut, Ludwig-Maximilians-
Precisión intra-ensayo (dentro de la prueba): 4.7 %. La               Universität, Munich; Departamento de Neurología, Universidad
precisión intra-ensayo se calculó a partir de los resultados de       de Basilea y Departamento de la Universidad de Neurología,
12 valores de una muestra positiva a IgM y IgG en una única           Universidad Lyon.
prueba. El ensayo se realizó con los marcadores de enzima
anti-IgG y anti-IgM (B-GCO-ELG y B-GCO-ELM). Los valores              Traducción de la leyenda de Table 15 en pagina 17:
se muestran en Table 12 como un cociente %, tal como se ha            Donatores de sangre:
descrito antes.                                                       Frecuencia de los autoanticuerpos antigangliósidos (% cociente)
Precisión inter-ensayo (prueba a prueba): 16.3 %. La                  determinados con EK-GCO-GM y classicados como categorias
precisión inter-ensayo se ha determinado midiendo dos                 de títulos:
muestras con autoanticuerpos del isotipo IgG e IgM dirigidos
contra los seis gangliosidos utilisando BÜHLMANN                      Autoanticuerpos antiganglioside del isotype IgG
GanglioCombi® ELISA y los marcadores de enzima anti-IgG y
anti-IgM (B-GCO-ELG y B-GCO-ELM) en 20 pruebas                               Negativo: ≥94.6 % de los donatores de sangre
diferentes. Los valores se muestran en Table 13 como un                      Zona gris: <3.5 % de los donatores de sangre para todos
cociente %, tal como se ha descrito antes.                                   los autoanticuerpos antigangliósidos.
                                                                             Positivo: <1.5 % de los donatores de sangre para todos los
Linealidad de la dilución: Entre 30 y 200 % cociente la                      de los autoanticuerpos antigangliósidos.
dilución de las muestras de suero probadas produce una                       Fuertemente positivo: <0.5 % de los donatores de sangre
reucción continua del cociente.                                              para todos los de los autoanticuerpos antigangliósidos.
 Especificidad: Durante la noche se incubaron muestras de
suero de diferentes pacientes que contenían autoanticuerpos
específicos IgM y/o IgG anti-gangliósido con el antígeno              Autoanticuerpos antiganglioside del isotype IgM
soluble correspondiente y posteriormente se probaron en el
ensayo BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA de acuerdo con el                        Negativo: ≥92.7 % de los donatores de sangre
procedimiento del ensayo. Pudo observarse una inactivación                   Zona gris: <7.0 % de los donatores de sangre para GA1 et
del 50 % para un autoanticuerpo del gangliósido específico a                 < 3.5 % para los otros autoanticuerpos antigangliósidos.
una concentración del antígeno entre 10 y 100 µg/ml del                      Positivo: <2.5 % de los donatores de sangre para todos los
antígeno específico (datos no mostrados).                                    de los autoanticuerpos antigangliósidos.
                                                                             Fuertemente positivo: 0 % de los donatores de sangre para
Sensibilidad analítica: Se ensayaron 12 duplicados de                        todos los de los autoanticuerpos antigangliósidos en este
tampón de incubación en una única prueba. El límite de                       groupo.
detección, expresado como cocientes % del calibrador, se
calculó a 6.4 % sumando dos desviaciones estándar del
promeio de los duplicados del tampón de incubación. Los
resultados de los gangliósidos por separado se muestran en
Table 14.




Revision date:   2009-06-02                                   16/20                        BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                                                                                                                                            APPENDIX I
                                                                                                                             TABLES/ TABELLEN/ TABLES/ TABELLE/ TABLAS

    Figure 1                                       Microtiter plate set-up                                          Table 13                           Inter-Assay Precision (Run-to-Run)
                                      individual IgG and IgM conjugates                                               Ganglioside
                                                                                                                                    Enzyme label               Mean            SD                      CV
                                                                                                                                                              [% Ratio]      [% Ratio]                 [%]
                                               EK-GCO-GM                                                                                   IgG            33.3       23.1   11.6         8.5     34.8        36.8
                                                                                                                      GA1
                            IgG         IgM                                                                                                IgM            49.3       82.8     6.1        6.5     12.3         7.8
                        1         2    3        4     5       6    7    8    9     10   11   12
                              CTRL             CTRL                                                                                        IgG            24.5       37.3     4.3        7.3     17.4        19.5
       Calibrator      CAL
                              Low
                                      CAL      Low                                                 A                  GM1
       CTRL
                       CTRL
                       Med
                              CTRL
                              Neg
                                      CTRL
                                      Med
                                               CTRL
                                               Neg                                                 B                                       IgM            63.7       54.1     4.9        3.3         7.7      6.0
       GA1                                                                                         C                                       IgG            37.1       62.4   10.7        18.3     28.9        30.3
       GM1                                                                                         D
                                                                                                                      GM2
                                                                                                                                           IgM            28.1       72.4     5.0        6.7     17.9         9.0
       GM2                                                                                         E

       GD1a                                                                                         F                                      IgG            39.9       40.6     7.8        7.0     19.5        17.3
                                                                                                                      GD1a
       GD1b                                                                                        G                                       IgM                113    57.2     9.1        7.7         8.0     13.4
       GQ1b                                                                                        H
                                                                                                                                           IgG            23.4       37.1     4.7        6.9         20      18.6
                                                                                                                      GD1b
                      12 patients / Kit (2 MP / Kit)
                                                                                                                                           IgM            36.5       87.2     4.6        7.5     12.6         8.6
                      minimal load: 2 patients / run
                                                                                                                                           IgG            41.1       58.1     6.4        6.0     15.5        10.4
                                                                                                                      GQ1b
                                                                                                                                           IgM            34.3       86.3     2.4        9.7         7.0     11.1
    Table 11                                                      Example of Results                                  Mean                                                                                  16.3

                              Absorbance                      Ratio                     Category
 Enzyme label
                               (OD450)                         [%]
                                                                                                                    Table 14                                                  Analytical Sensitivity
                                                                                                                     Gangliosid     GA1           GM1           GM2         GD1a          GD1b             GQ1b
 B-GCO-ELG/              IgG          IgM             IgG         IgM            IgG          IgM                                   [% Ratio]     [% Ratio]     [% Ratio]   [% Ratio]     [% Ratio]        [% Ratio]
 B-GCO-ELM                                                                                                           B-GCO-
 Calibrator              1.789        2.576                                                                          ELG - IgG
                         1.833        2.527
 Calibrator Avg.         1.836        2.551           100              100                                           mean           6.23          7.03          6.45        6.04          6.81             6.96
                                                                                                                     SD             0.40          0.60          0.59        0.36          1.35             0.6
 Medium Control          1.267        1.743            69              68                                            Mean+2SD       7.03          8.22          7.62        6.75          9.5              8.17
                         1.237        1.764            67              69
 Me. Control Avg.        1.252        1.753            68              69
                                                                                                                     B-GCO-
 Low Control             0.557        0.938            30              37                                            ELM - IgM
                         0.584        0.942            32              37
 Low Control Avg.        0.571        0.940            31              37                                            mean           3.65          4.32          3.56        3.63          3.95             4.24
 Negative Control  0.061              0.098               3            4                                             SD             0.18          0.84          0.14        0.31          0.54             1.01
                   0.051              0.095               3            4                                             Mean+2SD       4.02          6.0           3.85        4.27          5.03             6.26
 Neg. Control Avg. 0.056              0.097               3            4
 Sample 1 GA1      0.095              1.185               5            46          Neg             Grey
                                                                                                   zone
 Sample 1 GM1            0.171        3.814               9            150
                                                                                   Neg            Strong.           Table 15                                                              Blood Donors
                                                                                                   Pos.
 Sample 1 GM2                                                                      Neg             Grey              Category              anti-Ganglioside-autoantibodies IgG (%)
                         0.116        0.095               6            37
                                                                                                   zone                                GA1           GM1            GM2     GD1a          GD1b             GQ1b
 Sample 1 GD1a           1.117        0.574            61              23          Pos.            Neg.
                                                                                                                     Negative          94.6          98.7           99.6      95.9         99.1             95.0
 Sample 1 GD1b           1.021        0.354            56              14          Pos.            Neg.
 Sample 1 GQ1b           0.378        0.208            21              8           Neg.            Neg.              Greyzone           2.3           0.5            0.0       3.2             0.5           1.4
                                                                                                                      Positive          1.8           0.5            0.5       1.8             0.5           3.2
Table 12                              Intra-Assay Precision (Within-Run)
                    Enzyme label              Mean                   SD                      CV
                                                                                                                      Strongly
   Ganglioside                                                                                                        positive          1.4           0.5            0.0       0.9             0.0           0.5
                                             [% Ratio]             [% Ratio]                 [%]
                         IgG                        95.7                     8.0                    8.4              Category              anti-Ganglioside-autoantibodies IgM (%)
   GA1
                         IgM                        92.3                     4.2                    4.6                                GA1           GM1            GM2     GD1a          GD1b             GQ1b
                         IgG                        81.6                     4.0                    4.9              Negative          92.7          93.6           100.0    100.0         98.2             99.6
   GM1
                         IgM                        69.1                     1.4                    2.0              Greyzone           6.8           4.1            0.0       0.0             1.4           0.5
                         IgG                        19.5                     1.9                    9.7               Positive          0.5           2.3            0.0       0.0             0.5           0.0
   GM2
                         IgM                        71.3                     2.2                    3.1               Strongly
                         IgG                                                                                          positive          0.0           0.0            0.0       0.0             0.0           0.0
                                                    60.3                     2.4                    4.0
   GD1a
                         IgM                        60.1                     3.7                    6.2
                         IgG                        53.9                     1.8                    3.3
   GD1b
                         IgM                        65.0                     1.5                    2.3
                         IgG                        46.5                     2.0                    4.3
   GQ1b
                         IgM                     102.0                       4.1                    4.0
   Mean                                                                                             4.7


Revision date:       2009-06-02                                                                             17/20                               BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                                                        Table description: cf. “Results and Calculations”,
Frequency of individual anti-ganglioside autoantibodies (%)             “Performance Characteristics”, and “Expected Values and Cut-
tested with EK-GCO-GM and classified into titer categories:             Off” (pages 3/4)
   anti-Ganglioside-autoantibodies of the isotype IgG:                  Tabellenbeschreibung: siehe “Resultate“, „Leistungs-
                                                                        merkmale“ und “Normalbereich und Grenzwert“ (Seite 6/7).
   Negative : ≥94.6 % of blood donors
                                                                        Explications relatives aux tableaux: voir “Résultats”,
   Grey zone: Approximately <3.5 % of blood donors for all
                                                                        “Caractéristiques de Performance” et “ Valeurs Attendue et Cut-
   anti-ganglioside autoantibodies.
                                                                        off” (page 9/10).
   Positive: <3.5 % of blood donors for all anti-ganglioside
                                                                        Descrizione tavola: cf. “Risultati e Calcolo”, “Prestazioni del
   autoantibodies.
                                                                        Dosaggio” e “Valori Attesi e Cut-off” (pagina 12/13).
   Strongly positive: <1.5 % of blood donors for all anti-
                                                                        Explicaciones relativas a las Tablas: ver “Resultados y
   ganglioside autoantibodies.
                                                                        Cálculos”, “Características de Eficiencia” y “Valores
                                                                        esperados y Punto de Corte” (página 15/16).
   anti-Ganglioside-autoantibodies of the isotype IgM:
   Negative: ≥92.7 % of blood donors
   Grey zone: Approximately < 7.0 % of blood donors for GA1
   and ≤ 4.1 % of the other anti-ganglioside autoantibodies
   Positive: <2.5 % of blood donors for all anti-ganglioside
   autoantibodies.
   Strongly positive: 0 % of blood donors for all anti-ganglioside
   autoantibodies in this group.




Revision date:   2009-06-02                                     18/20                      BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                                                                                                  APPENDIX II
                                 REFERENCES/ LITERATURREFERENZEN/ REFERENCES/ RIFERIMENTI/ REFERENCIAS


1. Willison HJ and Yuki N: Peripheral neuropathies and            5. Steck AJ and Kappos L: Changing concepts in inflammatory
   anti-glycolipid antibodies. Brain 125, 2591-2625 (2002).          and paraneoplastic neuropathies. Curr Neurol 16, 191-212
                                                                     (1996).
2. Latov N: Antibodies to glycoconjugates in neurological
   disease. Clin Aspects Autoimm 4, 18-29 (1990).                 6. Humbel RL and Schmit P: Anticorps antigangliosides et
                                                                     neuropathies peripheriques. Rev Med Liege 51, 368-375
3. Pestronk A: Invited Review: Motor neuropathies, motor             (1996).
   neuron disorders, and antiglycolipid antibodies. Muscle
   Nerve 14, 927-936 (1991).                                      7. Quarles RH and Weiss MD: Autoantibodies associated with
                                                                     peripheral neuropathy. Muscle Nerve 22, 800-822 (1999).
4. Steck AJ: Use of anti-glycoconjugate antibody assays in
   neuropathy. Workshop presentation at the Nat. Meeting Am.      8. Nobile-Orazio E: et al: How useful are anti-neural IgM
   Acad. Neurology, Seattle, May 6-13, 1995.                         antibodies in the diagnosis of chronic immune-mediated
                                                                     neuropathies? JNS 266, 156-163 (2008).




                                                                                                                 APPENDIX III
                                                                                                            SHORT PROTOCOL


                                    BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA

                                                Precoated Microtiter Plate

                                                                        wash 2 x

                                              100 µL Calibrator, Controls and
                                                  Serum Samples (1:50)

                                                                        incubate 2 hours ± 5 min at 2-8°C
                                                                        wash 3 x

                                               add 100 µL Enzyme Label(s)

                                                                        incubate 2 hours ± 5 min at 2-8°C
                                                                        wash 3 x

                                                add 100 µL TMB Substrate

                                                                        incubate 30 ± 2 min at 18-28°C
                                                                        on a plate rotator

                                                add 100 µL Stop Solution

                                     Read absorbance at 450 nm (within 30 minutes)


                                           TIME TO RESULT: 4.5 HOURS




Revision date:   2009-06-02                               19/20                     BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM
                                                                                                                                 APPENDIX IV
                                                                                  SYMBOLS/ SYMBOLE/ SYMBOLES/ SIMBOLI/ SIMBOLOS


 Symbol                    Explanation                                            Symbol              Explanation
                           Use By                                                                     Negative Control
                           Verwendbar bis                                                             Negativkontrolle
                           Utiliser jusqu’au                                      [CONTROL|-]         Contrôle négatif
                           Utilizzare entro                                                           Control negativo
                           Fecha de caducidad                                                         Control negativo
                           Catalogue number                                                           Low Control
                           Bestellnummer                                                              Kontrolle tief
 [REF]                     Référence du catalogue                                 [CONTROL|L]         Contrôle faible
                           Numero di catalogo                                                         Control bajo
                           Número de catálogo                                                         Control bajo
                           Batch code                                                                 Medium Control
                           Chargenbezeichnung                                                         Kontrolle mittel
 [LOT]                     Code du lot                                            [CONTROL|M]         Contrôle moyen
                           Codice del lotto                                                           Control medio
                           Codigo de lote                                                             Control medio
                           In Vitro Diagnostic Medical Device                                         Calibrator
                           In Vitro Diagnostikum                                                      Kalibrator
 [IVD]                     Dispositif médical de diagnostic in vitro              [CAL]               Calibrateur
                           Dispositivo medico-diagnostico in vitro                                    Calibratore
                           Producto sanitario para diagnóstico in vitro                               Calibrador
                           Temperature limitation                                                     Enzyme Label IgG
                           Zulässiger Temperaturbereich                                               Enzymmarker-IgG
                           Limites de température
                           Limiti di temperatura
                                                                                  [EL|IgG]            Marqueur enzymatique IgG
                                                                                                      Marcato enzimatico IgG
                           Limite de temperatura                                                      Marcador enzimático IgG
                           Microtiterplate                                                            Enzyme Label IgM
                           Mikrotiterplatte                                                           Enzymmarker-IgM
 [MP]                      Plaque de microtitration                               [EL|IgM]            Marqueur enzymatique IgM
                           Microplaca                                                                 Marcato enzimatico IgM
                           Microplaca                                                                 Marcador enzimático IgM
                           Wash Buffer Concentrate (10x)                                              TMB Substrate
                           Waschpuffer-konzentrat (10x)                                               TMB Substrat
[ [BUF|WASH|10X]           Concentré de tampon de lavage                          [SUBS|TMB]          Substrat TMB
                           Tampón de lavado concentrado (x10)                                         Substrato di TMB
                           Tampón de lavado concentrado (x10)                                         Substrato de TMB
                           Incubation Buffer                                                          Stop Solution
                           Inkubations-Puffer                                                         Stopp-Lösung
 [BUF|INC]                 Tampon d’incubation                                    [SOLN|STOP]         Solution stop
                           Tampón de incubación                                                       Soluzione stoppante
                           Tampón de incubación                                                       Solución de parada




                                                                                                                                  Printing Date
                                                                                                                                  2009-06-30




 BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA is a registered trademark of BÜHLMANN Laboratories AG



 Revision date:   2009-06-02                                              20/20                 BÜHLMANN GanglioCombi® ELISA IgG and IgM