NMR-Nuclear Magnetic Resonance

Document Sample
NMR-Nuclear Magnetic Resonance Powered By Docstoc
					NMR‐ Nuclear Magnetic Resonance
Gives dynamic information on a protein that a crystal doesn t
Gives dynamic information on a protein that a crystal doesn’t

Certain nuclei possess a property known as spin

Spin refers to the nuclear spin angular momentum which is purely quantum 
mechanical property that has no classical analog.  It’s represented by I = spin quantum 
number

3 classes of nuclei:

1. Nuclei with odd mass number have ½ integral spin
2. Nuclei with even mass numbers and an even charge have no spin.
        12C, NMR inactive



3. Nuclei with even mass numbers and odd charge have integral spin.
        14N, broad lines



Category 1 is the most used in NMR because I = ½ and can use 1H, 13C, 15N
What does I = ½ mean?
It means that such a nucleus can orient itself in 2I  + 1 ways when placed in a 
                                                            y       p
magnetic field

          2I + 1,  I = ½ = 2

2 nuclear orientations so 2 possible nuclear energy states

 f               h                               h                 h       h
If we represent these orientations as vectors what we can say is that in the 
absence of any external force or field, these 2 orientations are identical and 
have the same energy – you can’t tell them apart.

But what happens if you introduce an external magnetic field? Of  size Bo?

                                                         Energy states 
                                                         Energy states
                                                 β       separate out with 
      E
                                        ΔE               introduction of 
                                                         external magnetic
                                                         external magnetic 
                                                 α
                                                         field
                         No field
The energy difference Δ E =  h ν   (normal spectroscopy)
        ‐can flip between states at different energy levels

We can see that the stronger Bo (ext field) then the further apart these energy 
levels so ΔE  α Bo.  The larger the field the larger the separation.
                                                h = planck’s constant
                   ΔE h B
                   ΔE = h γ Bo                   γ = some constant
                                                Bo = magnetic field

  = magnetogyric ratio – tells you have receptive a nuclear type is compared to 
γ = magnetogyric ratio tells you have receptive a nuclear type is compared to
another

So  essentially if we could cause a transition between the state, this would be 
So – essentially if we could cause a transition between the state, this would be
some sort of spectroscopy

The frequency required to induce such transitions is in the MHz range radio‐
       q     y q                                                   g
frequency – referred to as RF

From a basic standpoint – if you put in RF at the appropriate MHz frequency 
then you will induce such a transition

This is the basic unit of NMR phenomenon!
                                                         γH = 4
Sensitivity also depends on natural abundance
1H vs 13C = 100:1                                        γC
 H vs.  C  100:1
                                                         γH = ‐10
So you would imagine H vs. 13C is 400 times better at 
                                                         γN
natural abundance and 10 times better than 15N
It turns out for a variety of complex reasons that NMR is not like other types of 
spectroscopy (ex. UV)
spectroscopy (ex UV)

If you fire in a photon with the right RF frequency to cause a transition from
                                    β


                                    α

then this states lifetime is so short that we can’t see it

The upshot of this is that we can’t get an NMR signal from just one nucleus.

We need BILLIONS though.

We measure coherence.
The billions of nuclei all act together when we put in a RF pulse

Setting up what is essentially a COHERENT effect between the α and β states.

                     β

                           Billions – this coherence (like constructive interference)
                     α                oscillates at the frequency between the 2
                                     ‐oscillates at the frequency between the 2
                                      levels and last for seconds

So  we put a  billion nuclei into a magnetic field, separate the nuclear energy
So – we put a “billion” nuclei into a magnetic field, separate the nuclear energy 
states and cause a coherence to be set up that we can detect at the specific 
frequency between those 2 levels.

Any problem? YES
The levels are very close in energy ~ 1 in 105 nuclei prefer to go in α rather 
than β
                  β

              ΔE
                   α

The distribution of population between the α and β states is given by the
The distribution of population between the α and β states is given by the 
Boltzmann equation.




ΔE  α Bo

Therefore, more go into α state as the external field gets bigger.  Makes 
experiment more sensitive.  But it’s still small  very sensitive technique
Make our protein – express, purify, search for conditions –

Then put it in a magnet.  Let’s just think about 1H nuclei for now.

Magnet
Place current in coil and then cool.  The electrons move forever because 
    d              d ti       i b k i t             t     t 4 K l i Th
made a super conductive wire by keeping temperature at 4 Kelvin.  There 
is no resistance in the wire.
So, RF gets delivered and hits the nuclei – coherence is set up and detected

If there was only 1 nuclear type then – 1 signal at one frequency – easy to see
If there was only 1 nuclear type then – 1 signal at one frequency – easy to see

                                             H1‐outside
H2‐hydrophobic core
H2 hydrophobic core

 H3‐cavity                          3 types – different electronic environments

The different electronic environments shield them to different extents from 
the main Bo field.
    So, if they have different Bo responses then they have different ΔE’s and so 
    different frequencies
                 q

    3 different frequencies from 3 different environments

    All superimposed – not easy to see
                                                             10 Hz
                                     30 Hz
                                              20 Hz
H1 = 10Hz
H2 = 20 Hz
H3 = 30 Hz




           p    p              y
     All superimposed – not easy to see
     More shielded proton the lower the frequency
Take the oscillating waves – Fourier transform them – get their frequencies

               30               20           10


                    Chemical Shift Differences
                    Ch i l Shif Diff

So each 1H in a different environment has a different chemical shift – property a 
nucleus possesses which is dependent on its electron environment.  More 
nucleus possesses which is dependent on its electron environment More
electrons the more shielded from main field so will have different chemical shift 
then a lesser shielded electron.  Normally measured in PPM




We also notice some fine structure here.
What’s that?
Electrons from HA HB and vice versa so HA knows about HB and knows if it’s 
in it’s α or β state – can be either so HA sees HαB  and HβB
             β


Produces 2 lines at HA frequency
Similarly HB sees HαA and HβA    2 lines at HB
The two lines split by same amount and next to each in protein structure



               J             J

                                                 J = Scalar Coupling in Hz
              HA                 HB
                                                 Why lines are split 
                                                    y           p
                                                 Thru bond interactions
Example of coupling in a chemical shift
Scalar Coupling is through bond interaction

So if we see scalar coupling we know that 2 nuclei are next to each other 
through bonds.
          Chemical shift – structure info –different positions on a molecule
          Scalar coupling – structure info – through bond connections

There is one other type of interaction that is very, very important

                                                      Not close in bonds (no
                  HA                HB                scalar coupling) But close
                                                      in space < 5A
                                                      in space < 5A



They can sense each other’s presence as the molecule tumbles.
Their dipoles are coupled
Dipolar coupling – through space interaction
                  > 5 Angstroms apart
  This thru space dipolar coupling interaction produces an effect 
  known as the Nuclear Overhauser Enhancement (NOE)
  k          th N l      O h          E h          t (NOE)
           ‐ used to accurately determine distance

  Which allows us to very accurately monitor and calculate thru space 
  Which allows us to very accurately monitor and calculate thru space
  distances.

                 H

                      NOE @ a fixed distance. Use this as a reference
                 H


More often we classify them as –

Weak                        Medium                    Strong
~5A                         4 ‐ 3/2 A                 1 ‐ 2 A
                           J / NOE
Helix (cis)            H                  H


J small – close in 
J    ll l       i      C                  C
space and attached 
by bonds
NOE                                                       d
                                              Use NOE and J to 
                                              determine structural 
                                              position of protein

Sheet (trans)          H

J big  distance >5A
J big – distance >5A         J / No NOE
Attached by bonds      C                  C
NO NOE

                                          H
So we can see different environments from chemical shifts, adjacent thru 
bond connections from scalar couplings and thru space interactions from 
b d          ti    f       l     li      d th         i t     ti   f
dipolar couplings/ NOE




Depending on the structure…
look @ all these possible
thru space connections


                     For a helix
What about helices next to each other?


                                                             i    i + 4 / 3



What about β‐strands / sheets?                              interhelix


                                                 NOE between N‐H and N‐H 
                                                 across strand  dNN

                                                 No NOE between adjacent 
                                                 residues because too far

                                                 NOE between adjacent reidues 
                                                 H‐H  dα
No d ’s on same residue
N dαN’               id
No sequential dNN’s – if you see, there are interstrand
                    And turns….




Adjacent residues


Cross‐strand
So we can connect things accurately thru space to define different strands, 
sheets, helices and turns and their 3D position with respect to each other.

Thru BOND scalar coupling connections are used to identify different amino acids.  
Each has a pretty unique coupling network.



Will generate clearly different patterns
Will generate clearly different patterns




So – 1. identify amino acids using chemical shifts and scalar coupling patterns

    2. (i) sequentially and (ii) 3 dimensionally arrange those amino acids by using 
NOE’s

This is called (i) sequential assignment
              (ii) structure generation
Sequential NOE’s will have unique scalar coupling


                         1 amino acid



                                                         Peptide backbone




                                       No J between neighboring amino 
                                       acids because no through bond 
                                       protons present
So if you say link 3 together – you can find that run in the primary sequence and 
assign each resonance / peak to a specific proton in the protein.

Ex. Amide of ALA32
    βH of Leu 86 etc.

If you have every peak assigned, then you can connect them all via NOE’s – 3D 
structure

Scalar coupling – use to ID the amino acids
NOE’s – use for sequential ordering

Problem…
The bigger the protein…the more protons

‐OVERLAP
  These experiments can also be made to disperse the information into 2 
  dimensions.
  di     i



Movement of frequencies goes both ways
   HA                HB
                                                                           HB
   C                 C



Establishes connectivities through bonds                                   HA

2D Correlated Spectroscopy = COSY experiment          HA            HB

                    p ,       g
Connects scalar coupled, through bond 
connected nuclei in 2 frequency dimensions.
 We have a lot of overlap in 1D spectra
        ‐ only one dimension to disperse info into

                HA               HB

                C                C

Wouldn’t it be great if we could transfer the magnetization of one nucleus, 
HA to HB (and vice verse)?

So that in a spectrum we would have a peak HA and a peak HB

But also a peak     HA ‐>  HB
         a peak   HB ‐> HA

Use the scalar coupling to transfer magnetization – can we do this?
Use the scalar coupling to transfer magnetization can we do this?

Yes we can – there are NMR experiments that can do this
          HB




          HA

HA   HB
2 dimensions gives you more 
resolution

Each cross peak represents a 
connection thru bonds 

2D Cosy

Can’t jump over C O bond
Can t jump over C‐O bond 
(must have neighboring 
amino acids) because no 
protons to go thru
protons to go thru
Examples of COSY patterns 
E       l    f COSY
for amino acids.  The strong 
resonances of the diagonal 
(large circles) give chemical 
(large circles) give chemical
shifts of indicated H atoms.  
Cross peaks give thru bond 
interactions.
Can you do this with dipolar thru 
space couplings? Send 
magnetization from one proton 
to another thru space?

2D NOESY

Each cross peak represents a 
Each cross peak represents a
thru space connections from 
one proton to another (< 5A)

Amount of peaks in line tells 
amount of stuff in a shell around 
a proton
  p

Closer to the stronger  1A
Furthere apart the weaker  5A
We talked about only protons –
In proteins 12C  is dominant (99%)  and 14N too (approx 99.9%)

Both these are INACTIVE NMR WISE – useless

13C and 15N have I = ½ but have very low natural abundance –      can we do anything 
 b     h ?
about that?

Yes – when you grow your proteins – introduce 15N via ammonium sulphate/chloride 
via glucose
via glucose

In growth medium
        ‐‐ 100% incorporation of 13C and/or 15N
           100% incorporation of  C and/or 
                                                                  Isotopically labeled 
                                                                  and now NMR active 
       O         H          H             O              H        except O

                                                                  We can pass 
     ‐‐13C‐‐‐‐‐‐‐13C‐‐‐‐‐‐‐‐15N‐‐‐‐‐‐‐‐13C‐‐‐‐‐‐‐‐13C‐‐‐‐‐‐15N…   magnetization 
                                                                       h     i    l
                                                                  anywhere via scalar 
               13R                                   13R
                                                                  coupling
Fig.*: 15N TROSY of full length D55N Spo0A 1mM pH 6.5 20mM Tris, 150mM KCl, 1mM EDTA, 0.02% NaN3
Fig.*: Assigned NH correlation NMR spectrum of VanU.
  Methyl



      β


          α



So in a C‐ H group we can pass magnetization  H    C

Looks fabulous but bigger proteins even make there 2D spectra look messy
Looks fabulous – but bigger proteins even make there 2D spectra look messy 
and overcrowded with peaks because more nuclei present

1D 
1D    2D
2D    3D?
  A peak belongs to what?
  The amide proton shifts about the same.  But what if Nitrogens had different 
  shifts?  
  Could pull it apart.


                                                                     Step 3.
                                                                     Pull apart




Step 2.
Proton – N chemical shift




                                         Step 1.  NOSY
                                         Grey, black, and white dots – 3 separate 
                                         residue peaks
Thru Bond
      p
Thru space
                           3D HNCA
                           3D HNCA
                           1 peak that connect                                   α   C
                           every NH and α C 
                           group
                                                                             N
                                                            H
Eventual goal using all these 3D experiments is to
Eventual goal using all these 3D experiments is to …

Assign every peak in every spectrum to a specific atom in the protein

Know which peak is which proton 1H
       ex. β‐ proton of Ser 38
           NH proton of Leu 94 etc.
               p

The use NOE’s between pairs, to determine distance – input this data in a 
program

3D Structure