UJI MOLEKULER (POLYMERASE CHAIN REACTION) PADA OTITIS MEDIA by dou12761

VIEWS: 1,695 PAGES: 19

									   UJI MOLEKULER (POLYMERASE CHAIN REACTION) PADA OTITIS ]
           MEDIA SUPURATIFA KRONIK BENIGNA AKTIF

   Anton Christanto*, Soepomo Soekardono*, Novi Primadewi*, Agus Surono*,
                               Jaka Widada**.
   *
    Departemen THT-KL, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada/RS Dr Sardjito, Yogyakarta
            **
               Laboratorium Program Studi Bioteknologi Pasca Sarjana UGM, Yogyakarta

ABSTRAK

Latar Belakang
         Kasus Otitis Media Supuratif Kronik Benigna Aktif (OMSKBA) yang
membandel terhadap pengobatan yang diberikan dan dengan kesembuhan yang tidak
sempurna bahkan gagal sama sekali harus dicari causanya.
         Selama ini pemeriksaan mikrobiologi dengan media kultur digunakan untuk
mengidentifikasi kuman penyebab. Dengan media kultur dan uji biokima, dilakukan
isolasi, identifikasi dan diferensiasi kuman. Kelemahan dari metode ini, pembiakan tidak
berhasil dengan baik atau sulit tumbuh dalam medium pembiakan secara in vitro dan
kuman yang tidak tumbuh pada media kultur tidak dapat diidentifikasi sehingga
memerlukan metode pemeriksaan yang lain yang lebih akurat, mudah, sensitive dan
spesifik.
         Dengan kemajuan dibidang biologimolekuler dan tehnik pemeriksaan
bakteriologik, seluruh DNA kuman dari suatu spesimen dapat diekstraksi dan dengan
teknik PCR (RISA), dapat dilakukan identifikasi kuman dari specimen tersebut dan
sekaligus dapat membedakan jenis kuman antar spesies atau strain dari satu spesies.

Tujuan
       Tujuan dari penelitian ini adalah melihat gambaran pola kuman dan mengidentifikasi
jumlah kuman penyebab dari hasil isolasi sekret telinga OMSKBA dengan pendekatan PCR-
(RISA) dibandingkan dengan pemeriksaan dengan media kultur.

Metodologi
        Penelitian ini merupakan Cross Sectional study dan merupakan preelimenary
study.
        Spesimen/discharge telinga penderita OMSKBA diambil secara steril dan
dimasukkan ke dalam: 1. tabung media transport (berisi media kultur) yang berukuran
12 cm panjangnya dan bergaristengah 1,5cm. Tabung lalu ditutup kapas steril. 2. Tabung
ependof yang berisi etanol
        Tabung media transport yang berisi media kultur dan spesimen dikirim ke Lab
Mikrobiologi FK UGM untuk di isolasi di media kultur (agar darah) dan diidentifikasi
jenis kumannya.
        Ependof yang beisi spesimen dan etanol selanjutnya dikirim ke Lab PAU-
BIOTEKNOLOGI Pasca Sarjana UGM untuk dilakukan ekstraksi DNA dan
diidentifikasi dengan teknik PCR-RISA
        Plate (media kultur) yang beisi isolasi bakteri yang telah tumbuh koloninya (dari
Lab Mikrobiologi FK-UGM) kemudian dikirim ke Lab PS-BIOTEKNOLOGI UGM
untuk dilakukan ekstraksi DNA dan diidentifikasi dengan teknik PCR-RISA
Hasil Penelitian
        Pada penelitian ini hanya satu jenis bakteri yang dapat diidentifikasi
menggunakan media kultur darah yaitu genus Pseudomonas sp sedangkan dengan
menggunakan metode PCR-RISA dapat diidentifikasi lebih dari satu jenis bakteri
sehingga pada penggunaan metode RISA yang berdasarkan pada tehnik PCR, DNA
bakteri yang jumlahnya sangat sedikit tetap dapat teridentifikasi.
        Dengan pendekatan biologi molekuler yaitu PCR-RISA dapat dibedakan beberapa
strain/spesies Pseudomonas dari cairan telinga penderita Otitis Media Supuratif Kronik
Benigna Aktif, sedangkan dengan pendekatan tradisional yaitu pembiakan pada medium
agar darah, bakteri yang diperoleh hanya dapat dibedakan menjadi 2 macam bakteri yaitu
Pseudomonas sp dan P. Aeroginosa.

Kata Kunci : OMSKBA, PCR, Ribosomal Intergenic Spacer Analysis(RISA), Media
             kultur bakteri.



PENDAHULUAN

        Pada mukosa cavum timpani penderita Otitis Media Supuratif Kronik Benigna
Aktif (OMSKBA), telah terjadi banyak perubahan-perubahan yang menetap, sehingga
resolusi spontan sangat sulit terjadi dan biasanya ada gangguan vaskularisasi di telinga
tengah, sehingga antibiotika sistemik sukar mencapai sasaran dengan optimal sehingga
diperlukan antibiotika topikal. Kronisitas dengan fase aktif dan fase tenang yang timbul
bergantian dapat terjadi sepanjang umur sehingga diperlukan antibiotika pada setiap fase
aktif. Tidak jarang kasus kasus OMSKBA membandel terhadap pengobatan yang
diberikan dengan kesembuhan yang tidak sempurna bahkan gagal sama sekali.
        Antibotika yang diberikan adalah atas dasar hasil uji kepekaan in vitro terhadap
bakteri aerob. Pada pemeriksaan bakteriologik (mikrobiologik), penemuan jenis kuman
yang sama pada media kultur, sering kali didapatkan hasil uji kepekaan yang berbeda.
        Pada akhir-akhir ini terlihat kecenderungan terjadinya perubahan dalam jenis
kuman penyebab penyakit infeksi serta respon kuman terhadap antibiotika.1
        Akibat perkembangan terapi antibiotika, insidensi dan prevalensi OMSK
menurun, tetapi penurunan ini tidak sebaik penyakit infeksi lainnya terutama pada kasus
anak. Seperti dimaklumi hilangnya fokus infeksi ditelinga tengah penting untuk
penyembuhan spontan dari kerusakan yang ditimbulkan oleh penyakit infeksi tersebut.2,3
        Pada umumnya pemberian antibiotika untuk OMSKBA didasarkan pada
“educated guess” yaitu berdasarkan laporan terakhir mengenai bakteri yang paling sering
ditemukan pada OMSKBA.4
        Pemeriksaan bakteriologik OMSKBA selama ini dilakukan melalui pemeriksaan
isolasi dengan media kultur. Identifikasi kuman didapatkan dengan melihat morfologi
koloni kuman dalam media kultur dalam sebuah plate dan uji biokima. Dari hasil
pemeriksaan bakteriologik tersebut kuman yang sering ditemukan pada OMSK
bervariasi. Pada umumnya ditemukan Pseudomonas spp, dengan persentasi antara 16%-
100%, Stphylococcus aureus 9%-32%, Enterobacter spp 3%-30%, H influenzae 12%,
Streptococcus 15% dan kuman lain kadang-kadang ditemukan dalam prosentase
kecil.5,1,6,7 Temuan kuman anaerob meningkat dengan adanya perbaikan teknik
pemeriksaan bakteriologik dari 1% menjadi 43%.8
         Selama ini pemeriksaan mikrobiologi dengan media kultur digunakan untuk
mengidentifikasi kuman penyebab. Dengan media kultur dan uji biokima, dilakukan
isolasi, identifikasi dan diferensiasi kuman. Kelemahan dari metode ini, pembiakan tidak
berhasil dengan baik atau sulit tumbuh dalam medium pembiakan secara in vitro dan
kuman yang tidak tumbuh pada media kultur tidak dapat diidentifikasi sehingga
memerlukan metode pemeriksaan yang lain yang lebih akurat, mudah, sensitive dan
spesifik
         Secara taxonomy term (klasifikasi) pemeriksaan bakteriologik dengan media kultur
tersebut hanya bisa mengidentifikasi jenis kuman setingkat genus maupun spesies. Pemeriksaan
bakteriologik dengan media kultur tidak bisa membedakan jenis kuman yang masih dalam satu
spesies..
       Dengan kemajuan dibidang biologimolekuler dan tehnik pemeriksaan
bakteriologik, seluruh DNA kuman dari suatu spesimen dapat diekstraksi dan dengan
teknik PCR (RISA), dapat dilakukan identifikasi kuman dari specimen tersebut dan
sekaligus dapat membedakan jenis kuman antar spesies atau strain dari satu spesies.9,10
        Tujuan dari penelitian ini adalah melihat gambaran pola kuman dan
mengidentifikasi jumlah kuman penyebab dari hasil isolasi sekret telinga OMSKBA dengan
pendekatan PCR-(RISA) dibandingkan dengan pemeriksaan dengan media kultur.


TINJAUAN PUSTAKA

Otitis Media Supuratif Kronik Benigna Aktif (OMSKBA).
       Otorea kronis adalah keluarnya cairan dari telinga lebih dari 2 bulan. Selanjutnya
dengan otoskopi dibedakan ada tidaknya perforasi pada membrane timpani. Apabila
membran timpani perforasi, diagnosis mengarah pada OMSK.
       Definisi OMSK adalah radang kronis telinga tengah dengan perforasi membran
timpani dan riwayat keluarnya sekret dari telinga (otorea) lebih dari 2 bulan, baik terus
menerus atau hilang timbul. Sekret mungkin sereus, mukus atau purulen.11 Pada OMSK
yang tanpa disertai komplikasi dinilai apakah ada kolesteatom atau tidak. Tanpa
kolesteatom OMSK disebut sebagai OMSK Benigna atau tipe mukosa dan yang disertai
kolesteatom disebut sebagai OMSK maligna atau bahaya.12
       OMSK benigna dibagi menjadi fase tenang dan aktif. Fase tenang jika OMSK
tersebut adalah OMSK tipe mukosa dalam keadaan kering. Jika ada discharge maka
disebut fase aktif. (OMSKBA).

Kekerapan
       Diseluruh dunia prevalensi OMSK 65330 juta jiwa, dimana 60% (39200 juta
jiwa) mengalami gangguan pendengaran yang sangat bermakna secara klinis.
Diperkirakan 28000 mengalami kematian dan <2juta yang mengalami kecacatan. 94%
terdapat pada Negara berkembang.13 Prevalensi OMSK di Indonesia secara umum adalah
3,8%.12 Pasien OMSK merupakan 25% dari pasien-pasien yang berobat di poliklinik THT
rumah sakit Dr Sardjito Yogyakarta tahun 2004.
Gambaran bakteriologik pada OMSKBA.
        Beberapa penulis melaporkan bahwa P.aeruginosa merupakan bakteri aerob yang
paling sering ditemukan, walaupun laporan persentasenya berbeda-beda.1,14,15,16,17,18
        Friedman (1952) seperti yang dikutip oleh Shenoi7 menemukan S.Aureus sebesar
32,7% dari 318 kasus dan 41% resisten dengan penisilin, Proteus 27%, Pseudomonas
aeruginosa 16%, E.Coli 10,7%.
        Jonsson (1986)1,6 menemukan 32% Pseudomonas spp, dengan spesies tersering
adalah Pseudomonas aeruginosa. Staphylococus aureus sebesar 30%, dan batang gram
negatif lain 32%. Spesipen diambil dari telinga tengah.
        Fliss16 mendapatkan Pseudomonas spp sebesar 100% dari 77 spesimen yang
diperiksa, enteric gram negatif (E.colli, enterobacter spp, proteus mirabilis, lain lain)
sebesar 33%, Staphylococus 25%. Tidak dilakukan pemeriksaan terhadap kuman anaerob
        Papastavros17 melaporkan ditemukannya bakteri aerob pada 84,03% spesimen,
dengan Pseudomonas sp sebesar 50,67%, S.aureus 36,00%.
        Amadasun18 melaporkan Pseudomonas sp sebesar 65%, proteus sp 26%,
Streptococcus sp 15%, Staphylococcus sp 12%.
        Leibermen14 pada penelitian kuman aerob pada OMSKBA mendapatkan
Pseudomonas spp pada semua kasus (100%), Enteric gram negatif bacilli 33%,
Staphylococcus 25%, Haemophylus influenzae 12%.
        Kenna5 pada tahun 1986 melaporkan hasil pemeriksaan mikrobiologik pada 51
biakan dari 36 penderita (anak) OMSKBA yang terdiri dari 23 spesies, antara lain
P.aeruginosa sebesar 67% dan merupakan kultur murni pada 31% kasus(16 telinga).
Pada 15 anak dengan OMSK bilateral, 73% mengandung kuman yang sama pada kedua
telinga tengahnya. S.auerus (beta laktamase positive spesies) sebesar 9,3%, Diphteroids
9,3%, S. Epidermidis 6,4%.
        Hariasri19 pada penelitian kuman OMSKBA dengan pengambilan spesimen
dengan menggunakan lidi kapas mendapatkan Pseudomonas sebesar 59,01%,
Staphylococcus 31,14%, Difteroid 16,39% dan Proteus 9,84%.

Pemeriksaan bakeriologik dengan media kultur pada OMSKBA
         Pengambilan discharge dari telinga harus diperhatikan sterilitas. Discharge
diusahakan agar tidak ada kontaminasi dari kulit canalis auditorius externus dengan
teknik sebagai berikut: kulit dibersihkan dengan jodium dan alkohol 70%, dan
kontaminasi dari udara luar, dengan meletakkan lampu spiritus di depan lobang botol
steril yang berisi media transport waktu memasukkan spesimen kedalamnya.
         Pengambilan discharge menggunakan jarum no 20 yang dihubungkan dengan
semprit ukuran 1 atau 2,5 ml.2 Setelah discharge diambil, segera dimasukkan tabung yang
berisi media transport yaitu media setengah padat yang tersusun oleh:
         - Medium Carry dan blair (BBL) 2,5 gram
         - Solutio CaCl 1%                  1,8 ml
         - Solutio Rezasurin                0,1 gram
         - L Cysstein HcL                   0,1 gram
         - Destilated water                198 ml
         Selanjutnya tabung dikirim segera ke bagian mikrobiologi. Setiap bahan akan
ditanam di dalam media agar darah. Kemudian koloni yang tumbuh dilakukan isolasi dan
identifikasi dengan tehnik pure culture (kultur murni). Identifikasi kuman didasarkan
pada bentuk morfologi dari koloni kuman yang tumbuh pada media kultur (agar darah)
dan uji biokimia. Identitifikasi adanya bakteriologi dalam tubuh manusia (dalam hal ini
discharge telinga pada penderita OMSKBA) masih mengandalkan teknik kultur murni.

Polymerase Chain Reaction (PCR)
        Kemajuan teknologi dibidang rekayasa genetic dirasakan sangat maju dan
berkembang pesat. Teknik pengujian dengan DNA probe yang sudah dikenal sangat
sensitif dan spesifik, masih ada kelemahannya karena membutuhkan jumlah sel, jaringan
atau cairan tubuh lainnya dalam jumlah tertentu agar dapat terdeteksi. Bilamana bahan
pemeriksaan yang didapat jumlahnya sangat sedikit, maka dilakukan pembiakan terlebih
dahulu. Tetapi seringkali pembiakan tidak berhasil dengan baik atau sulit tumbuh dalam
medium pembiakan secara in vitro sehingga memerlukan metode pemeriksaan yang lain
yang lebih akurat, mudah, sensitive dan spesifik.
        PCR merupakan suatu metode untuk memperbanyak segmen DNA yang spesifik
secara enzimatik dan cepat dalam in vitro. Setiap kali melakukan satu siklus PCR, DNA
akan memperbanyak diri menjadi 2 kali lipat. Dengan demikian bila dilakukan
pemindahan 20 kali siklus, maka DNA yang diperoleh menjadi sebesar dua pangkat 20
atau sama dengan sejuta kali lipat.
        Pada dasarnya PCR merupakan suatu prosedur siklus biokimia untuk
memperbanyak segmen DNA secara enzimatik. Pemeriksaan ini menggunakan enzim
DNA polymerase yang stabil pada suhu tinggi. Hingga saat ini enzim yang sering
digunakan adalah Taq polymerase dan Vent polymerase.
        Bahan bahan yang diperlukan dalam suatu siklus PCR yaitu: Segmen DNA yang
spesifik, enzim polymerase, primer yang terdiri dari oligonukleotida dan bahan-bahan
pembangun DNA (dNTP).
        Tiap proses siklus PCR terdiri dari tiga tahapan yaitu: tahap I adalah
denaturasi/pemisahan yang memerlukan suhu yang tinggi sekitar 94-950C, untuk
memisahkan untaian rangkap DNA. Tahap II yaitu tahap renaturasi atau primer
annealing dimana terjadi pendinginan. Suhu yang dibutuhkan sekitar 37-600C selama
beberapa puluh detik, dan terjadi penempelan primer pada ujung 5’ atau 3’ DNA yang
akan diperbanyak. Setiap primer akan merupakan oligonukleotida yang terdiri dari
untaian tunggal dan urutan nukleotida. Primer dapat menempel pada DNA karena telah
dibuat khusus, sehingga urutan basa-basanya merupakan urutan basa yang komplementer
terhadap ujung bagian DNA yang akan diperbanyak. Tahap III yaitu pemanjangan atau
primer extension. Dalam tahap ini perlu pemanjangan primer agar dapat terbentuk DNA
untai ganda yang lengkap (Gambar 1). Pada proses ini memerlukan suhu yang tinggi
sekitar 720C, bila memakai T.aquaticus Taq DNA Polymerase, sedangkan untuk enzim
yang berasal dari E Coli hanya memerlukan suhu 370C selama beberapa menit.20.21,22
                                Gambar 1: Skema Kerja PCR


        Tiap proses satu siklus PCR berlangsung membutuhkan waktu sekitar 3-6 menit
dan menghasilkan DNA dua kali lipat jumlahnya. Bila melakukan sejumlah X kali siklus
PCR maka akan mendapatkan dua pangkat X kali lipat, sehingga dalam beberapa jam
saja akan mendapatkan hasil jutaan kali lipat DNA spesifik. Tetapi tidak dianjurkan
melakukan perbanyakan lebih dari 40 kali siklus, karena akan terjadi efek pendaratan
(plauteau). Pada keadaan tersebut meskipun kita menambahkan siklus PCR, tidak akan
menghasilkan DNA yang efektif seperti semua.
        Untuk mengetahui berhasil tidaknya reaksi PCR, maka dapat dipakai berbagai
metode, antara lain bila hasil amplifikasi DNA cukup banyak dipakai metoda
elektroforesis dengan pewarnaaan etidium bromida. Metode ini yang paling sering
digunakan.
        Hasil elektroforesis dapat diamati dengan menggunakan sinar ultraviolet. Proses
PCR berhasil baik bila terlihat pita atau bintik DNA seperti pada hasil penelitian dibawah
ini.




Gambar 2 :
Penampakan hasil PCR pada agarosa elektroforesa. Dengan pemberian zat etidium bromida. Pita DNA
akan terlihat berwarna merah kecoklatan dibawah sinar ultraviolet pada agarosa. Bagian kiri dan kanan
adalah marker (petanda) dengan panjang gelombang yang telah diketahui.
       Metode elektroforesa tidak dapat menentukan identifikasi bila jumlah target pada
awal urutan sangat kecil. Keadaan seperti ini mungkin masih dapat diperbanyak dari
beberapa urutan-urutan nucleotida yang tidak spesifik dan menghasilkan DNA spesifik
yang sangat sedikit untuk dapat dilihat. Oleh karena itu deteksi akhir hanya
mengandalkan hibridisasi perbanyakan DNA, terdapat DNA sintetik prob.

Penerapan PCR (RISA) pada OMSKBA
        Pada umumnya penerapan PCR di bidang kedokteran dapat dibagi 3 bidang,
yaitu: 1. Penyakit genetik. 2. Penyakit infeksi yang disebabkan oleh
mikroorganismepatogen seperti bakteri, virus jamur dan parasit 3. Keganasan.
        PCR sering dipakai untuk mendiagnosa penyakit yang disebabkan oleh
mikroorganisme dalam jumlah yang sangat sedikit, sehingga mendapat kesulitan dalam
pembiakan, maka digunakan PCR untuk mendeteksinya. Dengan cara PCR, DNA
kuman, virus dan parasit akan diperbanyak sehingga dapat terdeteksi.
        Diantara penyakit infeksi yang sering menggunakan PCR untuk mrndeteksi
penyebabnya adalah penyakit Acquired Immunodeficiency Syndrome yang disebabkan
virus HIV, Flu Burung dsb.
        Terlepas dari itu PCR mempunyai kemampuan yang tinggi dalam mempelajari
patogenesa penyakit, karena punya kesanggupan untuk mendeteksi sekuen DNA spesifik
yang sesuai dengan definisi keadaan patologik. Selain itu PCR juga dapat
mengidentifikasi sekuen dari virus papilloma pada keganasan konjungtiva dan kornea
serta penyakit infeksi virus yang laten23
        Kemajuan dibidang biologi molekuler telah dapat mengembangkan komunitas
bakterial dengan menggunakan metode DNA fingerprinting sehingga dapat memonitor
kompleks komunitas bakteri pada lingkungan alimiah tanpa kita melakukan isolasi.
        Metode ini melibatkan ekstraksi DNA insitu dari komunitas bakterial, dengan
mengunakan amplifikasi sekuens PCR sehingga kita dapatkan informasi genetik yang
lebih detail. Sekuens yang digunakan sebagai tanda dari komunitas bakterial ini adalah
gen dari ribosomal operon
        rRNA Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (RISA) adalah metode analisis
mikrobiologi komunitas yang dapat memperkirakan keaneka ragaman agen mikrobiologi
dalam komposisi komunitas tanpa melihat bias yang dihasilkan dari pendekatan metode
kultur. Metode ini melibatkan penggunaan amplifikasi PCR berdasarkan panjang
poliphorphisme dari sekuen intergenic spacer (IGS) dari regio kecil (16s) dan yang besar
(23s) dari gen subunit rRNA dalam rRNA operon, dengan target primer oligonukleotida
dalam regio 16s dan 23s. region intergenic 16s-23s, yang mengkode tRNAs tergantung
dari macam species bakterial, yang diketahui dari heterogenitas panjangnya dan sekuens
nukleotida
        Metode RISA merupakan metode ekologi molekuler9 yang dapat digunakan untuk
mengamati ekologi bakteria pada lingkungan alamiah. Metode RISA memiliki prospek
kedepan dalam kegunaannya untuk mempelajari komposisi komunitas mikrobia baik
untuk identifikasi genus, spesies atau pengelompokkan phylogenetik dan mengamati
perubahan lingkungan yang terjadi.9
        RISA merupakan metode yang sangat baik untuk mengamati struktur dan
dinamisasi komunitas bakteri yang sangat kompleks melalui perubahan pita-pita DNA.
RISA dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi yang terjadi dalam suatu
komunitas.9
       RISA merupakan analisis polimorfis dari bagian yang memisahkan gen rrs dan rrl
IGS (intergenic spacer) yang memiliki variasi ukuran dari 50bs sampai 1,5 kb.
       Rangkaian beberapa pita DNA dapat menunjukkan secara spesifik keberadaan
populasi dalam suatu komunitas. Variasi bagian teramplifikasi dari IGS dapat dengan
langsung dipisahkan atas dasar ukurannya menggunakan gel poliakrilamid. Variabilitas
ukuran yang tinggi menunjukkan adanya variabilitas yang tinggi dalam struktur genetik
komunitas.9




          Gambar 3 menunjukkan: Panjang daerah distribusi IGS antara gen rrs dan rrl pada kelompok
eubakteria & menunjukkan rata-rata panjang daerah IGS untuk tiap filum.
Kelompok       α-proteobacteria,    terdiri    atas:   Hyphomicrobium,    Blastobacter,    Rhodobacter,
Rhodopseudomonas, Bartonella, Nitrobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Rhizobium, Bradyrhizobium,
Candidatus, Zy-momonas,Gluconobacter, Acetobacter, Ochrobactrum, Brucella, Caulobacter, and
Ehrlichia; β-proteobacteria, terdiri atas: Acidithiobacillus, Thiobacillus, Ralstonia, Nitrosospira,
Nitrosomonas, Burkholderia, Xylophilus, Nitrosolobus, Neisseria, and Microvirgula; γ-proteobacteria,
terdiri atas: Yersinia, Photorhabdus, Azotobacter, Haemophilus, Enterobacter,Citrobacter, Xanthomonas,
Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Aeromonas, Klebsiella, Escherichia, Salmonella, Pasteurella,
Actinobacillus, Thiobacillus, Dichelobacter,Piscirickettsia, Xylella, Erwinia, and Pectobacterium; ε-
proteobacteria, terdiri atas: Campylobacter; high-GC-content gram-positive bacteria, terdiri atas:
Streptomyces, Rhodococcus, Frankia, Arthrobacter, Brevibacterium, Microbispora, Bifidobacterium,
Corynebacterium, Staphylococcus, Mycobacterium, Renibacterium, Tropheryma, Thermonospora,
Spirillospora, Excellospora, Actinocorallia, and Actinomadura; low-GC-content gram-positive bacteria,
terdiri atas: Bacillus, Lactobacillus, Clostridium, Leuconostoc, Streptococcus, Achole-
plasma,Anaeroplasma, Listeria, Enterococcus, Mycoplasma, Ureaplasma, Phytoplasma, Lactococcus,
Pectinatus, Zymophilus, and Planococcus; chlamydiae, terdiri atas: Chlamydia,Chlamydophila, Simkania,
Parachlamydia, and Waddlia; cyanobacteria, terdiri atas: Microcystis, Spirulina, Trichodesmium,
Arthrospira, and Anacystis; spirochetes, terdiri atas: Leptonema and Treponema; and cytophagales,
Prevotella, Rhodothermus, and Flavobacterium.9



       Metode RISA ini berdasar pada panjang sekuen Spacer intergenic yang berbeda
diantara gen penyandi sub-unit rRNA kecil (16S) dan besar (23S) yang diamplifikasi
dengan primer universal untuk eubakteria.
        Pendekatan molekuler (PCR-RISA) lebih dapat membedakan bakteri-bakteri yang
diisolasi dari sekret/discharge telinga penderita Otitis Media Supuratif Kronik Benigna
Aktif (OMSKBA) dibandingkan dengan pendekatan tradisional (yaitu yang didasarkan
pada pengamatan morfologi kultur/koloni bakteri pada media kultur / pure culture).
        Dengan PCR-RISA juga memungkinkan kita membedakan bakteri-bakteri
patogen dari penyakit infeksi di telinga (OMSKBA) pada aras spesies bahkan pada aras
intra spesies.


METODOLOGI PENELITIAN

A. Rancangan Penelitian
       Penelitian ini merupakan Cross Sectional study dan merupakan preelimenary
study.

B. Populasi Penelitian
       Populasi target adalah pasien yang didiagnosis OMSKBA
        Populasi terjangkau adalah pasien yang didiagnosis OMSKBA di Poliklinik THT
        RS Dr. Sardjito Yogyakarta pada bulan April 2005..
Kriteria inklusi:
    - Penderita dengan OMSK benigna aktif
    - Pada pemeriksaan otoskopi, didapatkan perforasi subtotal atau total
Kriteria eksklusi:
    - Penderita menggunakan antimikroba sistemik atau topikal paling sedikit 7 hari
      sebelum pemeriksaan
    - Menderita penyakit berat atau infeksi lain
    - Penderita otitis eksterna
    - Menolak ikut serta dalam penelitian.


C. Sampel
   Sampel penelitian adalah penderita OMSK benigna aktif di Poliklinik THT RS
Dr.Sardjito Yogyakarta pada bulan April 2005 yang memenuhi kriteria inklusi dan
eksklusi.
Besar sample: 5 pasien


D. Tempat dan Waktu Penelitian
        Penelitian ini dilakukan di Poliklinik THT RS Dr. Sardjito Yogyakarta, di
Laboratorium Mikrobiologi FK-UGM dan Laboratorium Pusat Studi-Bioteknologi UGM
dari tanggal 1 Maret 2005 sampai 31 Mei 2005.
E. Cara Penelitian
    A. Pemilihan sampel
          a. tempat : Di Rumah Sakit Dr sardjito unit THT FK UGM
          b. Waktu : bulan April 2005
          c. Bahan. : discharge diambil dari 5 penderita yang di diagnosa OMSKBA.
               Yang dimaksud OMSKBA seperti yang sudah diterangkan di dalam
               pendahuluan.

         Pada pemilihan sampel sesuai kriteria inklusi dan ekslusi dan tidak dilakukan
         pembatasan umur, jenis kelamin dari penderita serta telinga yang kanan atau
         yang kiri.
         Setiap pasien hanya diambil dischargenya pada satu telinga saja.
         Pasien harus bebas antibiotika. Paling sedikit 7 hari sebelum pemeriksaan
   B. Pengambilan Sampel
      Sampel/spesimen diambil dengan cara sebagai berikut :
                   1. Sebelum mengambil spesimen, pada permulaan supaya
                       diperhatikan sterilitas.
                   2. Spesimen diusahakan sejauh mungkin harus steril dengan
                       melakukan desinfeksi (alkohol) didaerah kulit pada canalis
                       auditoris externus.sehingga menghindari kontaminasi kuman
                       didaerah tersebut dengan spesimen..
                   3. Spesimen diambil segera.
                   4. Alat yang dipergunakan untuk mengambil material sekret berupa
                       kateter intra vena ukuran 20G dan spuit 1cc.
                   5. Proses pengambilan spesimen harus steril, memakai sarung
                       tangan steril.Spesimen selanjutnya dimasukkan di dalam tabung
                       media transport (6) dan ependof (7).
                   6. Spesimen dimasukkan ke dalam tabung media transport (berisi
                       media kultur) yang berukuran 12 cm panjangnya dan
                       bergaristengah 1,5cm tabung lalu ditutup kapas steril.
                   7. Spesimen dimasukkan ke dalam tabung ependof yang berisi
                       etanol
                   8. Tabung media transport yang berisi media kultur dan spesimen
                       dikirim ke Lab Mikrobiologi FK UGM untuk di isolasi di media
                       kultur (agar darah) dan diidentifikasi jenis kumannya.
                   9. Ependof yang beisi spesimen dan etanol selanjutnya dikirim ke
                       Lab PAU-BIOTEKNOLOGI Pasca Sarjana UGM untuk
                       dilakukan ekstraksi DNA dan diidentifikasi dengan teknik PCR-
                       RISA
                   10. Plate (media kultur) yang beisi isolasi bakteri yang telah tumbuh
                       koloninya (dari Lab Mikrobiologi FK-UGM) kemudian dikirim
                       ke Lab PS-BIOTEKNOLOGI UGM untuk dilakukan ekstraksi
                       DNA dan diidentifikasi dengan teknik PCR-RISA
                   11. Pengiriman spesimen dengan disertai formulir yang memuat
                       catatan :
                         nama penderita, alamat penderita, umur dan jenis kelamin
                         penderita, jenis spesimen yang dikirim, tanggal
                         pengambilan specimen, gejala-gejala penyakit/diagnosa
                         penyakit.


C. Pengolahan sampel
          Spesimen dalam tabung media transport diisolasi dalam media kultur agar
   darah dalam plate dan diidentifikasi dan didiferensiasi di Lab Mikrobiologi FK-
   UGM Yogyakarta..
            Spesimen dan etanol dalam ependof di bawa ke laboratorium PAU
   Bioteknologi Pasca Sarjana UGM untuk dilakukan ekstraksi DNA. Setelah itu
   dilakukan PCR-RISA. Sesudah PCR selesai, produk PCR di elektroforesis Setelah
   itu dilihat pada transiluminator u.v., dan difoto dengan menggunakan kamera
   digital. Metoda analisa yang dipakai adalah RISA. (ribosomal Intergenic Spacer
   Analisis).
           Plate (media kultur) yang berisi isolasi dan koloni kuman juga di bawa ke
   laboratorium Pusat Studi Bioteknologi UGM untuk dilakukan ekstraksi DNA.
   Setelah itu dilakukan PCR-RISA. Sesudah PCR selesai, produk PCR di
   elektroforesis Setelah itu dilihat pada transiluminator u.v., dan difoto dengan
   menggunakan kamera digital. Metoda analisa yang dipakai adalah RISA.
   (ribosomal Intergenic Spacer Analisis).
           Ektarasi DNA dan PCR dikerjakan di laboratorium mikrobiologi Pusat
   Studi Bioteknologi UGM.
   Cara/metoda pemeriksaan bakteriologik menggunakan metoda PCR-RISA

   Isolasi DNA - bahan dan cara isolasi
           Bahan: Tris-HCl, EDTA, SDS, lisosim, CTAB, NaCl, kloroform,
                    isopropanol, etanol 70 %.
           Prosedur kerja:
                  1.5 ml kultur sel dalam tabung 1.5 ml disentrifugasi dengan
                  kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Superatan dibuang, dan
                  pelet hasil senrifugasi ditambahkan 500 µl TE (100 mM ris-HCl,
                  100 mM EDTA; pH 8), vortex hingga homogen. Ditambahkan 40
                  µl lisosim (50 mg/ml) dan inkubasi pada 37oC selama 60 menit.
                  Tambahkan 200 µl SDS 10 %, 100 µl NaCl 5 M, dan 80 µl CTAB
                  lalu inkubasi pada 68oC selama 30 menit (sampel dibolak-balik
                  setiap 10 menit). Dilakukan penambahan 1:1 chloroform dan
                  senrifugasi 13.000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas diambil dan
                  tambahkan 0.6 x volume isopropanol kemudian disentrifugasi
                  kembali 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan cuci
                  pelet dengan 100 µl etanol 70 % dan kering anginkan. Tambahkan
                  20 µl TE dan homogenkan. Untuk sampel langsung tanpa
                  menggunakan teknik kultur, dilakukan prosedur yang sama dengan
                  teknik dikulturkan, hanya sampel yang digunakan langsung
                  ditambahkan 500 µl TE.
     Polymerase Chain Rection Primer, Reagen, siklus termal
           Reagen: Primer; 1406F (5’>TGYACACACCGCCCGT<3’)
                                    (universal rRNA small subunit)
                            23SR (5’>GGGTTBCCCCATTCRG<3’)
                                   (bacterial 23S rRNA large subunit)
           Ready To Go(Amersham Biosciences);
                                                2.5 unit Taq polymerase
                                                10 mM Tris HCl (pH 9)
                                                50 mM KCl
                                                1.5 mM MgCl2
                                                200 µl dNTP + stabilizer + BSA
                                              o
           Siklus PCR: denaturasi awal 94 C selama 2 menit, proses selanjutnya
                  sebanyak 25 siklus yang terdiri dari denaturasi (15 detik pada
                  suhu 94oC), penempelan primer (15 detik pada suhu 56oC),
                  elongasi (30 detik pada 72oC). Setelah akhir siklus, elongasi
                  dilanjutkan pada suhu 72oC selama 1 menit, kemudian proses
                  dihentikan dengan mengatur suhu pada 4oC dan hasilnya
                  divisualisasi dengan 1.5 % agarose.


HASIL PENELITIAN


 Krakteristik Sampel


                                         Sampel/Spesimen
                  I               II             III              IV        V
  Umur         22 th            31 th           21th              27th      5th
  Jenis       Laki laki      perempuan       perempuan       Laki laki   perempuan
 Kelamin
 Alamat        Bantul          Sleman         Sleman          Sleman      Sleman


                       Tabel 1: Karakteristik subyek penelitian
  Pemeriksaan Bakteriologis spesimen/discharge telinga OMSKBA dengan media
  kultur


                                      Sampel/Spesimen
                I              II             III            IV             V
Jenis     Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas
Kuman          Sp          Sp          Sp      Aeruginosa      Sp


  Tabel 2: Hanya di dapatkan 1 jenis genus Pseudomonas spp (sample I-V) dan 1 jenis
     spesies P.Aeruginosa (sample no IV)




                                     Gambar 4a




                                     Gambar 4b



  Gambar 4a dan 4b: Plate (media kultur/media agar darah) yang beisi isolasi bakteri
  yang telah tumbuh koloninya yang kemudian akan diambil untuk dilakukan ekstraksi
  DNA dan diidentifikasi dengan teknik PCR-RISA
Pemeriksaan Bakteriologis specimen/discharge telinga OMSKBA dengan PCR-
RISA




                           Marker (M) I     II   III IV V   sampel
    M : marker     100bp ladder            Gambar 5a




                            Marker (M) I    II   III IV V    sampel
    M : marker     100bp ladder            Gambar 5b


                 Gambar 5a dan 5b: Didapatkan > 1 kuman pada sampel/specimen I-V
Pemeriksaan Bakteriologis Plate (media kultur) yang berisi isolasi dan koloni
kuman dengan PCR-RISA




                Sampel     I   II III IV V       M
                                                 M : marker    100bp ladder
                               Gambar 6a




               Sampel      I   II III IV V       M
                                                 M : marker    100bp ladder
                               Gambar 6b

   Gambar 6a dan 6b : Tampak gambaran genus Pseudomonas yang tidak sama.
   Kemungkinan merupakan spesies/strain yang berbeda dari pseudomonas.
PEMBAHASAN

       PCR merupakan suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara
eksponensial sel nukleotida tertentu secara in vitro. RISA merupakan metode yang sangat
baik untuk mengamati struktur dan dinamisasi komunitas bakteri yang sangat kompleks
melalui perubahan pita-pita DNA. RISA dapat digunakan untuk mengidentifikasi
populasi yang terjadi dalam suatu komunitas dalam hal ini komunitas bakteri penyebab
OMSKBA. Metode RISA merupakan metode dengan pendekatan biomolekuler yang
dapat digunakan untuk mengamati komunitas bakteria pada discharge penderita
OMSKBA.
       Metode RISA memiliki prospek kedepan dalam kegunaannya untuk mempelajari
komposisi komunitas bakteri penyebab OMSKBA, baik untuk identifikasi genus, spesies
atau pengelompokkan phylogenetik dan mengamati perubahan lingkungan yang terjadi.
        Pemanfaatan RISA dalam pembedaan bakteri-bakteri penyebab penyakit akan
sangat bermanfaat sekali terutama jika nantinya dikaitkan dengan ketahanan mereka
terhadap antibiotik. Dengan pemanfaatan RISA ini dalam pembedaan bakteri maka juga
kemungkinan dapat menjelaskan kepada kita mengenai resistensi bakteri terhadap suatu
antibiotik.
         Dengan metode RISA didapatkan jumlah/banyaknya bakteri yang tidak dapat
tumbuh dalam media kultur, sebagai penyebab OMSKBA. Hal ini sangat berguna bagi
etiologi dan penatalaksanaan OMSKBA untuk dimasa yang akan datang. Jenis Bakteri
akan bisa dideteksi dengan metode sequensing
       Keragaman bakteri dalam sampel yang digunakan (discharge penderita
OMSKBA) dapat dilihat dari pengamatan pada media kultur (tabel 2 dan gambar 4a/4b)
maupun jumlah pita yang didapat pada visualisasi hasil PCR menggunakan agarose 1,5%
(gambar 5a dan 5b). Dari hasil visualisasi menggunakan agarose 1,5% terlihat bahwa
pada setiap sampel yang digunakan terdapat lebih dari satu jenis bakteri.
        Pada penelitian ini hanya satu jenis bakteri yang dapat diidentifikasi
menggunakan media kultur darah yaitu genus Pseudomonas sp sedangkan dengan
menggunakan metode PCR-RISA dapat diidentifikasi lebih dari satu jenis bakteri
sehingga pada penggunaan metode RISA yang berdasarkan pada tehnik PCR, DNA
bakteri yang jumlahnya sangat sedikit tetap dapat teridentifikasi.
       Data yang diperoleh menunjukkan pita-pita dengan intensitas yang berbeda-beda.
Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan populasi dari tiap bakteri dalam sampel
yang digunakan.
        Dengan pendekatan biomelekuler PCR-RISA didapatkan jumlah bakteri yang
lebih banyak dibandingkan dnegan memakai media kultur. Hal ini disebabkan karena
tidak semua bakteri dapat tumbuh dalam media kultur.
       Dari hasil visualisasi terlihat adanya pola migrasi yang berbeda dari DNA bakteri
Pseudomonas (Gambar 6a/6b).Meskipun ada beberapa faktor yang mempengaruhi
kecepatan migrasi DNA pada agarose yaitu: 1. Konsentrasi agarose 2. Berat molekul
DNA dan 3. Struktur DNA, akan tetapi pola migrasi dari hasil PCR dengan
menggunakan primer RISA pada agarose 1,5% tersebut dapat disebabkan oleh karena
adanya perbedaan struktur DNA. Hal tersebut dapat dilihat pada hasil penelitian
pemeriksaan bakteriologis dengan PCR-RISA, tampak adanya perbedaan struktur DNA
antara hasil PCR dari sampel I sampai dengan sampel V. Hal tersebut tervisualisasi
dengan adanya perbedaan pita-pita DNA dari masing sampel.
        Selain Faktor struktur DNA perbedaan pola migrasi dari sampel DNA bakteri
yang diduga satu genus dapat pula disebabkan oleh panjang sekuens yang teramplifikasi
berbeda karena IGS sangat spesifik untuk setiap species bakteri yang berbeda, sehingga
boleh jadi genusnya (sama sama pseudomonas) tetapi spesiesnya berbeda.
        Dari hasil tersebut diatas menunjukkan bahwa dengan pendekatan biologi
molekuler yaitu PCR-RISA dapat dibedakan beberapa strain/spesies Pseudomonas dari
cairan telinga penderita Otitis Media Supuratif Kronik Benigna Aktif, sedangkan dengan
pendekatan tradisional yaitu pembiakan pada medium agar darah, bakteri yang diperoleh
hanya dapat dibedakan menjadi 2 macam bakteri yaitu Pseudomonas sp dan P.
Aeroginosa. Hasil ini mengindikasikan bahwa dengan RISA kita dapat membedakan
bakteri-bakteri lebih seksama dibandingkan dengan pendekatan tradisional. Hasil ini
sesuai dengan beberapa penelitian sebelumnya yang juga mampu membedakan spesies-
spesies dari kelompok cyanobakteria24, spesies-spesies kelompok Bacillus.25,26
        Dari beberapa penelitian ini dan penelitian sebelumnya tampak bahwa RISA
merupakan alat yang sangat bagus untuk pembedaan bakteri-bakteri hasil isolasi karena
resolusinya yang memungkinkan kita mampu membedakan pada aras spesies.
        Pendekatan ini mungkin juga sangat berguna dalam karakterisasi strain-strain
bakteri sebagaimana dapat menunjukkan variabilitas yang tinggi dalam kelompok-
kelompok bakteri yang secara taksonomi sangat dekat. .
        Karena keterbatasan dalam penelitian ini tidak dilakukan analisa sequensing
untuk mendapatkan jenis bakteri penyebab OMSKBA yang tidak tumbuh dalam media
kultur namun dapat dideteksi dengan metode PCR-RISA.
       ..

SIMPULAN

1. Pendekatan molekuler (RISA) lebih unggul/sensitif dalam membedakan bakteri-
   bakteri yang diisolasi dari sekret/discharge telinga penderita Otitis Media Supuratif
   Kronik Benigna Aktif (OMSKBA) dibandingkan dengan pendekatan tradisional
   (yaitu yang didasarkan pada pengamatan morfologi kultur/koloni bakteri pada media
   kultur / pure culture).
2. RISA merupakan metode yang sangat baik untuk mengamati struktur dan dinamisasi
   komunitas bakteri yang sangat kompleks melalui perubahan pita-pita DNA.
3. RISA dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi yang terjadi dalam suatu
   komunitas dalam hal ini komunitas bakteri penyebab OMSKBA
4. Dengan RISA memungkinkan kita membedakan bakteri-bakteri patogen dari penyakit
   infeksi di telinga (OMSKBA) pada aras spesies bahkan pada aras intra spesies.
SARAN

      Dibutuhkan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan sampel yang lebih
banyak dan sekaligus memakai analisa sequensing sehingga jenis bakteri penyebab
OMSKBA dapat teridentifikasi.



DAFTAR PUSTAKA


    1. Kenna MA, Rosane BA, Bluestone CD. Medical Management of Chronic
        Suppirative Otitis Media Without Cholesteatoma in Children-Update 1992. Am
        J of Otology. 1993: 14:469-73
    2. Papastavros T, Giamarellou H, Varledjides S. Obstaining Specimens of
        Discharge from the Middle Ear for Cultures. Laryngoscope. 1985; 95:1413-
        1414
    3. Kenna MA. Epidemiology and Natural History of Chronic Suppurative Otitis
        Media. Ann. Otol Rhinol Laryngol. 1988;95 (Suppl.131);8
    4. Istioro YH. Penggunaan Antibiotik pada Otitis Media Supuratif Kronik. In:
        Helmi eds. Pengobatan Non Operatif Otitis Media Supuratif Kronik. Jakarta.
        Balai Penerbit FKUI. 1990:7-16.
    5. Kenna MA, Bluestone CD, Reilly JS. Medical Management of Chronic
        Suppurative Otitis Media Without Cholesteatoma in Children. 1986;96:146-51.
    6. Jonsson L, Schwan A, Thomander L et al. Aerobic and Anaerobic Bacteria in
        Chronic Suppurative Otitis Media (a Quantitative study). Acta Otolaryngol .
        Stockh.1986; 102:410-414.
    7. Shenoi PM. Management of Chronic Suppurative Otitis Media. In: Kerr GA.
        Scott-Brown’s Otolaryngology (Otology). Fifth edition. Butteworths. 1987:215-
        237.
    8. Papastravos T, Giamarellou, Varlejides S. Role of Aerobic and Anaerobic
        Microorganisms in Chronic Suppurative Otitis Media. Laryngoscope. 1986;
        96:438-442.
    9. Ranjard L, Brothier E, Nazaret S. Sequencing Bands of Ribosomal Intergenic
        Spacer Analysis Fingerprints for Characterization and Microscale Distribution
        of Soil Bacterium Populations Responding to Mercury Spiking. Applied and
        Environmental Microbiology. 2000: 5334-5339.
    10. Yu Z, Mohn WW. Bacterial Diversity and Community Structure in an Aerated
        Lagoon Revealed by Ribosomal Intergenic Spacer Analyses and 16S Ribosomal
        DNA Sequencing. Applied and Environmental Microbiology. 2001. Vol. 67,
        No. 4:1565–1574
    11. Djaafar ZA. Kelainan telinga tengah. Dalam buku ajar Ilmu Kesehatan
        TelingaHidung Tenggorok Kepala Leher. Editor. Supardi E, Iskandar N.
        2001:Hal 49-62.
12. Helmi, Djaafar ZA, Sosialisman, Hafil AF, Ratna D. Panduan penatalaksanaan
    baku Otitis Media Supuratif Kronik di Indonesia. Editor. Soetjipto D,
    Mangunkusumo E, Helmi. Jakarta 2002 ; 9-10
13. WorldHealthReport,2000.http://www.who.int/whr/2001/archives/2000/en/pdf/A
    nnex4-en.pdf (last accessed 21 July 2003).
14. Leiberman A, Fliss DM, Dagan R. Medical Treatment of Chronic Suppurative
    Otitis Media without Cholesteatoma in Children-a Two Year Follow-up.
    International J of Pediatric Otorhinolaryngology. 1992:24;25-33.
15. Bluestone CD, Kenna MA. Consensus. Ann Otol Rhinol Laryngol 1988; 97
    (suplement 131):41-42.
16. Fliss DM et al. Medical Management of Chronic Suppuratives Otitis Media
    without Cholesteatoma in Children. J.Pediatrics. 1990 ;116:991-996.
17. Papastravos T, Giamarellou, Varlejides S. Role of Aerobic and anaerobic
    Microorganisms in Chronic Suppurative Otitis Media. Laryngoscope. 1986;
    96:438-442.
18. Amadasun JEO. Bacteriology of Inadequately Treated Active Chronic Otitis
    Media in Paediatric Age Group. J of Laryngol Otol 1991; 105:341-342.
19. Hariasri S. Otitis Media Supuratif Kronik : Latar belakang dan evaluasi
    pengobatan konservatif. Skripsi bagian THT FKUI. Jakarta: FKUI 1983.
20. Ausbel,F.M,R. Brent, R.E. Kingston. Current protocols in Molecular Biology.
    Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciance. 1991:15.03-15.1.7.
21. De Cresce RP, M.S Lifsitz. PCR and the future of molecular testing. Medical
    Laboratory observe. 1993, 28-33.
22. Schochetman, G., C.y.Ou, and W.K, Jones. Polymerase Chain Reaction.
    J.Inf.Dis. 1998: 158;1154-1156.
23. Adam VC, Moll M, Schimid C, Rodrigues R, Moss. Briner J. Detection and
    typing of human papillomavirus in biopsy and cytological specimen by
    polymerase chain reaction enzyme analysis: methode suitable for
    semiautomation. J Med. Virol. 1996:48:161-170
24. Boyer SL, Flechtner VR, Johansen JR. Is the 16S-23S rRNA internal
    transcribed spacer region a good tool for use in molecular systematics and
    population genetics? A case study in cyanobacteria..Mol Biol Evol. 2001
    Jun;18(6):1057-69.
25. Daffonchio D, Cherif A,1,Brusetti L,Rizzi A,Mora A,Boudabous A, Borin S.
    Nature of Polymorphisms in 16S-23S rRNA Gene Intergenic Transcribed
    Spacer Fingerprinting of Bacillus and Related Genera. Applied and
    Environmental Microbiology, September 2003, Vol. 69, No. 9, p. 5128-5137.
26. Xu, D., Cote, J.-C. (2003). Phylogenetic relationships between Bacillus species
    and related genera inferred from comparison of 3' end 16S rDNA and 5' end
    16S-23S ITS nucleotide sequences. Int J Syst Evol Microbiol 53: 695-704

								
To top