Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras

Document Sample
Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras Powered By Docstoc
					Diversidad Funcional y Ecofisiología de las
Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
 Aplicación a la Gestión de un Sistema de
    Humedales de Tratamiento (EDAR-
              Empuriabrava).

             REN2003-02185
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




            Datos generales del proyecto
Investigador Principal:                                Dr. L.J. García-Gil
Organismo:                                      Universidad de Girona
Centro:         Inst. de Ecología Acuática (Microbiología)
Subvención concedida:                                                 80.900 €
  Personal:                                                                        --
  Otros gastos:                                                                    --
Fecha de Inicio:                                          Diciembre 2003
Fecha de finalización:                                    Diciembre 2006
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                            Participantes
Entidades públicas: Universidad de Girona
Entidades Privadas (EPO):
      Consorcio de la Costa Brava
      Servicio de Control de Mosquitos
      SEARSA- Roses
      Parque Natural dels Aiguamolls de l’Empordà


Investigadores:         Dr. L.J. García-Gil, Dr. L. Bañeras Vives

      Dra. A. Martínez-Planells                J. Llansó Pascual
                L. Calvó Perxas                O. Ruiz Rueda
             X. Fuentes García                 N. Poblet Mas
        Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                 Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                               Empuriabrava). REN2003-02185




      Descripción del Proyecto y Objetivos
El proyecto se centra en el estudio de las poblaciones de
bacterias nitrificantes y desnitrificantes en el sedimento de un
sistema de humedales para el tratamiento de aguas residuales
urbanas (SHT). La eliminación efectiva de amonio y nitrato ha
sido la principal preocupación de los organismos gestores en una
zona altamente turística. Se desarrollan métodos moleculares
para el estudio de la diversidad y actividad de bacterias
nitrificantes y desnitrificantes, con la finalidad de ampliar los
datos disponibles para la gestión del SHT estudiado.

 • Análisis de la estructura y composición de las poblaciones
   nitrificantes y desnitrificantes.
 • Determinación de actividades potenciales de
   nitrificación/desnitrificación.
 • Determinación de actividad in situ.
 • Utilización de resultados en programas de gestión.
        Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                 Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                               Empuriabrava). REN2003-02185




          Tareas y Acciones del Proyecto

Tarea                                      1er año         2º año         3er año
1. Muestreo.
2. Métodos moleculares
3. Análisis genes funcionales
4. Aislamiento y cultivo
5. Construcción de sistemas
experimentales
6. Construcción sistemas
experimentales in situ
7. Análisis Químicos y cinéticos
8. Modelización
        Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                 Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                               Empuriabrava). REN2003-02185




          Tareas y Acciones del Proyecto

Tarea                                      1er año         2º año         3er año
1. Muestreo.
2. Métodos moleculares
3. Análisis genes funcionales
4. Aislamiento y cultivo
5. Construcción de sistemas
experimentales
6. Construcción sistemas
experimentales in situ
7. Análisis Químicos y cinéticos
8. Modelización
        Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                 Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                               Empuriabrava). REN2003-02185




          Tareas y Acciones del Proyecto

Tarea                                      1er año         2º año         3er año
1. Muestreo.
2. Métodos moleculares
3. Análisis genes funcionales
4. Aislamiento y cultivo
5. Construcción de sistemas
experimentales
6. Construcción sistemas
experimentales in situ
7. Análisis Químicos y cinéticos
8. Modelización
      Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
               Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                             Empuriabrava). REN2003-02185




                Desarrollo del Proyecto

1. Toma de muestras: Muestreos en las celdas de
  tratamiento de los SHT.
                                                                      <7ppm NH4+
 Serie temporal 2004-06                                     EDAR-Empuriabrava
 Mayo 2004
 Marzo 2005
 Mayo 2005                                                                    SHT
 Febrero 2006
 Junio 2006
 Octubre 2006                         Celda 1



                                       Celda 2
        Sedimento libre
                                                                      Laguna
                                        Celda 3
                                                                         Europa
        Sed. vegetación
      Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
               Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                             Empuriabrava). REN2003-02185




                Desarrollo del Proyecto

1. Toma de muestras: Muestreos semestrales en las celdas
  de tratamiento de los SHT.
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                 Desarrollo del Proyecto

3.1. Métodos moleculares: Análisis de la estructura de la
  comunidad nitrificante (PCR-DGGE).

Planificado período (2004-2005)                                 Realizado
Personal: JGG, LCP                                           JGG, LCP, ORR
Desarrollo de cebadores amoB                                 Completado
Diversidad gen amoB (librerías génicas)                      No iniciado
Diversidad en muestras naturales (DGGE)                      Muestras 2004
Diversidad gen amoA                                               Iniciado
Diversidad gen 16S rRNA                                           Iniciado
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                 Desarrollo del Proyecto

2.1. Métodos moleculares: Análisis de la estructura de la
  comunidad nitrificante (PCR-DGGE).
 Bacterias oxidadoras de
 amonio

   NH3
          amoABC
  NH2OH
          hao
   HNO2
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                 Desarrollo del Proyecto

2.1. Métodos moleculares: Análisis de la estructura de la
  comunidad nitrificante (PCR-DGGE).
 Bacterias oxidadoras de
 amonio

   NH3
          amoABC
  NH2OH
          hao
   HNO2
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                 Desarrollo del Proyecto

3.2. Métodos moleculares: Análisis de la estructura de la
  comunidad desnitrificante (PCR-TRFLP).
Planificado período (2004-2005)                                 Realizado
Personal: LBV, ORR, NPM                                      LBV, ORR, NPM
Desarrollo de protocolos de T-RFLP (nirS)                    Completado
Diversidad gen nirS (librerías génicas)                      Completado
Diversidad en muestras 2004-2005                             Completado
Diversidad gen nirK                                            Iniciado
Diversidad gen nosZ                                            Iniciado
Diversidad gen nirT                                          No iniciado
         Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                  Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                                Empuriabrava). REN2003-02185




                   Desarrollo del Proyecto

2.2. Métodos moleculares: Desnitrificantes
   NO3–                                                         30

                                                                                  Sample A




                                     predicted number of OTUs
                nar                                             25                Sample B
                                                                                  Sample C
                                                                                  Sample D
   NO2–                                                         20




              nirS,K                                            15



                                                                10
   NO
              norBC
                                                                 5



                                                                 0

   N 2O                                                              0   5   10     15   20   25   30   35   40   45   50   55   60   65   70

                                                                                    number of clones screened
               nosZ
    N2
         Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                  Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                                Empuriabrava). REN2003-02185




                   Desarrollo del Proyecto

2.2. Métodos moleculares: Desnitrificantes
                                                                  nirF P. aeruginosa (D50473)
                                                                                                                nirN P. aeruginosa (D84475)
                                                                                                      50                          Paracoccus denitrificans (U05002)
                                                                                                                               CloneB28



                                                              I
                                                                                                                           99
                                                                                                                              Clone C11+ 1 C
                                                                                                                        80
                                                                                                                            CloneA10
                                                                                                                      97
                                                                                                                            CloneB4
                                                                                                                       59   Clone C7 + 1 C
                                                                                                                  40        CloneA22


   NO3   –
                                                                                                                           CloneA67
                                                                                                                     45    Clone C39, 1 A, 1 B, 2 C

                                                                                                                     81


                                                                                                                          44    28 Clone A, 27 B, 20 C, 3 D
                                                                                                 63




                nar
                                                                                                                52



                                                                                                                                  Clone A7 + 2 B
                                                                                                       44                      99      Clone B45, 2 B, 1 A
                                                                                                                                        CloneC9
                                                                                                           77        95                 Azoarcus tolulyticus (AY078272.1)
                                                                                                                                   CloneD5
                                                                                                                                    CloneA20
                                                                                                                                          CloneD11


   NO2–
                                                                                                                   96

                                                                                                          44                              CloneA51
                                                                                                                                  99
                                                                                                                                          CloneA36
                                                                                                                                         CloneA18
                                                                                                                                        CloneB17
                                                                                                                     78
                                                                                                                               99
                                                                                                                                  CloneD15
                                                                                                 51         56 75
                                                                                                                                     Clone D12 + 1 B
                                                                                                                            99
                                                                                                                                       CloneA72


              nirS,K
                                                                                                              63
                                                                                                                                      CloneA61
                                                                                                                                     99
                                                                                                                                         Clone D6 + 2 B
                                                                                       89
                                                                                                                    98
                                                                                                                               99      Clone C38, 4 B, 3 A, 1 D
                                                                                                                                             P. fluoresecens (AF114792)
                                                                                                                    96                   Burkholderia cepacia (AB092344.2)
                                                                                                                                     99
                                                                                                                                         P. aeruginosa (X16452)
                                                                                                                                     CloneD14
                                                                                                              89                         CloneA48
                                                                                                                                             CloneA40


   NO
                                                                                                         81

                                                                                                                                     CloneD7
                                                                                                                         99
                                                                                                                                    CloneA33
                                                                                                                                      CloneA3
                                                                                                                                   Raltsonia eutropha (AF114789)
                                                                                                                                  R. eutropha (X91394)


                                                             II
                                                                                                                    99
                                                                                                                          99
                                                                                                                      98        Clone B48 + B56
                                                                                                                            99 Clone B19 + B29
                                                                                                                91




              norBC
                                                                                                             99
                                                                                                                                CloneA57
                                                                                                                                    CloneA58
                                                                                                                          99
                                                                                                                                    CloneA39
                                                                                                      67                      CloneB46
                                                                                                                                Azospirillium brasilense (AJ224912)
                                                                                            98
                                                                                                                             99         CloneD13
                                                                                                                                        CloneA31
                                                                                                                                   99
                                                                                                                                         CloneA25


   N 2O
                                                                                                                               95     CloneC14
                                                                                  99
                                                                                                                     98
                                                                                                                                        CloneC33
                                                                                                    87
                                                                                                                                85
                                                                                                                                        CloneA56
                                                                                                                                         CloneB37
                                                                                                                                  99
                                                                                                                                        CloneA49
                                                                                                                               99      Clone A59 + A37
                                                                                                                                 76
                                                                                                                                   96
                                                                                                                                        CloneD10
                                                                                                                         80
                                                                                                                                        Clone D3 + D4


               nosZ
                                                                                                                              55
                                                                                                                                           CloneA60
                                                                                                            98
                                                                                                                                    83
                                                                                                                                          CloneA41
                                                                                                                                           Clone A4 + 3 A
                                                                                                                                   99
                                                                                                                                         CloneA21
                                                                                                                       99
                                                                                                                                        CloneA68
                                                                                                                                          CloneA44
                                                                                                                           65
                                                                                                                                         Azoarcus envasii (AY078269)
                                                                                                               75
                                                                                                                       69                Alcaligenes faecalis (AJ224913)


    N2
                                                                                                                                     P. stutzeri (X56813)
                                                                                                                            85
                                                                                                                                         P. stutzeri (M80653)



                                                            III
                                                                                                                     99
                                                                                                                              51          CloneA38
                                                                                                                                      T. selenatis (AY078264.1)
                                                                                                                             99
                                                                                                                                95
                                                                                                                                      Acidovorax sp. (AY078273)
                                                                                                                                      Thauera aromatica (AY078257.1)
                                                                                                                                                     pA17clone
                                                                                                                     99                                      wA20clone
                                                                                                                                          99
                                                                                                                                                       CloneC8

                                                      0.2
             Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                      Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                                    Empuriabrava). REN2003-02185




                        Desarrollo del Proyecto

 2.2. Métodos moleculares
                                        May04C AluI                                           May04C MspI




30 bp                                        700 bp 30 bp                                           700 bp
        MAY04BSED02                                         MAR05BTYR01
        MAY04BSED04                                         MAR05BPHR02
        MAY04BTYR02
        MAY04BPHR02                                         MAR05BPHR01

        MAY04BSED01                                         MAR05BTYR02
        MAY04BSED03
                                                            MAR05BSED01
        MAY04BPHR01
        MAY04BTYR01                                         MAR05BSED02

                 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7                     0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
                            Distances                                             Distances
              UPGMA cluster 2004                                    UPGMA cluster 2005
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                 Desarrollo del Proyecto

4. Aislamiento y cultivo: Desarrollo de métodos para el
  aislamiento de bacterias nitrificantes y desnitrificantes.

Planificado período (2004-2005)                                 Realizado

Personal: LBV, ORR, LCP, JLP                             LBV, LCP,ORR, NPM

Aislamiento de bacterias nitrificantes                       No iniciado
Aislamiento de bacterias desnitrificantes                      46 cepas
Inicio de la caracterización genética de                     Iniciado desn.
las cepas
      Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
               Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                             Empuriabrava). REN2003-02185




                Desarrollo del Proyecto

5. Construcción de sistemas experimentales: Ensayo
  de actividades potenciales.
Planificado período (2004-2005)                                Realizado
Personal: LBV, ORR, NPM, JLP                            LBV, LCP,ORR, NPM
Desarrollo de sistemas experimentales                       Completado
Desarrollo de métodos químicos de
análisis                                                    Completado
Determinación tasas potenciales
                                                           Muestras 2005
nitrificación
Determinación de tasas potenciales de                      Muestras 2005
desnitrificación
              Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                       Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                                     Empuriabrava). REN2003-02185




                        Desarrollo del Proyecto

5. Construcción de sistemas experimentales
                          Combinados
                             agua-
                          sedimento
DESNITRIFICACIÓN                           NITRIFICACIÓN
Anaeróbico (N2)                                                O2
Agitación                                               Agitación
+Nitrato 2mM                                       +Amonio 7.5mM
+acetato:etanol:      Toma de muestras
propionato



               Análisis nitrato y nitrito HPLC


                       Cálculo cinético
        Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                 Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                               Empuriabrava). REN2003-02185




                  Desarrollo del Proyecto

5. Construcción de sistemas experimentales
   μgN/ g DW/h        Desnitrificación       Prod.nitrito         Prod.nitrato
   control                   5.0                 0.002                0.003

   Sedimento              3.0 ± 1.1           0.31 ± 0.06          0.03 ± 0.01

   Typha sp.              17.0 ± 4.8          6.91 ± 1.47          2.06 ± 0.68

   Phragmites sp.        25.5 ± 13.3          4.19 ± 1.41          4.15 ± 1.81


 Desnitrificación                         Nitrificación
• Similar en agua y sedimento             • Poco importante en agua
libre de vegetación                       • De 10 a 20 veces superior en
• De 6 a 8 veces superior en              sedimento con vegetación.
sedimento con vegetación                  • Acumulación de nitrito
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                 Desarrollo del Proyecto

8. Construcción de sistemas experimentales in situ:
  Estudio de la actividad transformadora de nitrógeno a escala
  real.

Planificado período (2004-2005)                                 Realizado
Personal: LBV, ORR, NPM, JLP                             LBV, LCP,ORR, NPM
Construcción de sistemas experimentales                      No iniciado
in situ
Análisis de actividad en condiciones                         No iniciado
naturales
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




                 Desarrollo del Proyecto

8. Modelización: Utilización de los resultados en modelos
  reales y explotación.
Planificado período (2004-2005)                                 Realizado
Personal: JGG, LBV, LCP

                                                             No iniciado
Inicio de la explotación de los resultados                    Previsión
en el cuarto trimestre de 2005.
                                                             Junio-2006
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




             Resumen Final del Proyecto
El desarrollo de las tareas realizadas respecto de las
programadas en el proyecto puede resumirse en:
2. Disminución del número de muestreos.
3. Freno en el desarrollo del estudio de bacterias
nitrificantes debido a la renuncia del personal
asignado.
4. Demora en los estudios de expresión génica hasta
el primer trimestre del año 2006.
5. Demora en el desarrollo de sistemas
experimentales in situ y explotación de los
resultados.
       Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
                Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                              Empuriabrava). REN2003-02185




             Resumen Final del Proyecto
Objetivos conseguidos hasta la fecha:

3. Estudio de la diversidad del gen nirS.
4. Optimización protocolos de T-RFLP.
5. Optimización mètodos de estudio de genes
funcionales nirK, nosZ, amoA y amoB.
6. Diversidad de AOB mediante gen 16S rRNA.
7. Análisis de las actividades                             potenciales             de
nitrificación/desnitrificación.
8.Aislamiento y cultivo de bacterias desnitrificantes.
     Diversidad Funcional y Ecofisiología de las Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
              Aplicación a la Gestión de un Sistema de Humedales de Tratamiento (EDAR-
                                                            Empuriabrava). REN2003-02185




Diversidad Funcional y Ecofisiología de las
Bacterias Transformadoras del Nitrógeno y
 Aplicación a la Gestión de un Sistema de
    Humedales de Tratamiento (EDAR-
              Empuriabrava).

                     REN2003-02185

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Stats:
views:129
posted:1/13/2010
language:Spanish
pages:25