Docstoc

bakteri asam laktat

Document Sample
bakteri asam laktat Powered By Docstoc
					ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Lactobacillus spp.

Oleh : Nama NIM Rombongan Kelompok Assisten : Musyarif Zaenuri : B1J006101 :I :3 : Indahwati

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2009

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Peranan bakteri baik yang menguntungkan ataupun yang merugikan dalam kehidupan kita dapat diketahui melalui proses isolasi dan identifikasi. Prinsip isolasi bakteri adalah memisahkan suatu mikroba dari mikroba lainnya sehingga diperoleh kultur murni. Identifikasi dilakukan setelah kultur murni yang berasal dari satu progeni didapatkan untuk diketahui potensinya. Langkah awal dalam proses identifikasi adalah pengamatan dan pencatatan ciri morfologi serta ciri lainnya. Identifikasi bakteri didasarkan pada berbagai macam sifat bakteri seperti sifat biokimia, morfologi koloni dan morfologi selnya. Menurut Lay (1994), morfologi mikroorganisme berdasarkan bentuk, ukuran dan penataan biasanya tidak cukup untuk melakukan identifikasi. Ciri lainnya seperti sifat pewarnaan, pola pertumbuhan koloni, reaksi petumbuhan pada karbohidrat, dan penggunaan asam amino sangat membantu dalam identifikasi mikroba. Menurut Barrow and Feltham (1993), uji Indol-Methyl redVoges Proskauer-Citrate (IMViC) digunakan juga sebagai uji untuk karakteristik dari mikroorganisme. Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai kelompok bakteri yang membentuk asam laktat, baik sebagai satu-satunya produk maupun sebagai produk utama pada metabolisme karbohidrat. Beberapa ciri yang dimiliki oleh bakteri asam laktat adalah termasuk dalam gram positif, tidak membentuk spora, berbentuk bulat atau batang, dan pada umumnya tidak memiliki enzim katalase. Lactobacillus termasuk golongan bakteri asam laktat yang sering dijumpai pada makanan fermentasi, produk olahan ikan, daging, susu, dan buah-

buahan. Sejauh ini telah diketahui bahwa keberadaan bakteri ini tidak bersifat patogen dan aman bagi kesehatan sehingga sering digunakan dalam industri pengawetan makanan, minuman dan berpotensi sebagai produk probiotik. Sifat yang menguntungkan dari bakteri Lactobacillus dalam bentuk probiotik adalah dapat digunakan untuk mendukung peningkatan kesehatan. Bakteri tersebut berperan sebagai flora normal dalam sistem pencernaan. Fungsinya adalah untuk menjaga keseimbangan asam dan basa sehingga pH dalam kolon

konstan.Lactobacillus pada usus halus, jumlahnya dapat mencapai 106 – 107 sel/g, sedangkan pada usus besar jumlahnya berkisar antara 1010 – 1011 sel/g ( Beberapa spesies Lactobacillus telah banyak diisolasi dari saluran usus halus manusia dan hewan. Beberapa diantaranya adalah Lactobacillus

acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus lactis, Lactobacillus casei, dan Lactobacillus fermentum. Lactobacillus acidophilus merupakan spesies bakteri asam laktat yang paling dominant dan paling banyak dipelajari (Sujaya, dkk. 2008). B. Tujuan Tujuan praktikum ini adalah ; 1. Mengisolasi Lactobacillus sp. 2. Mengidentifikasi mikrobiologis. Lactobacillus sp. hasil isolasi dengan pendekatan

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat yang digunakan dalam praktikum adalah pipet ukur, tabung reaksi,, petri dish, jarum ose, mikroskop, object glass. Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah akuades, alkohol 70 %, media selektif Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA), medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA), mannosa, raffinosa, reagen H2O2 , Nitrate Broth, Nitrat Reagen A dan B, MR-VP, KOH- alfanaftol, pewarnaan gram ( gram A, gram B, alcohol 95 %, dan safranin). B. Metode ► Tahap Isolasi 1. Preparasi suspensi dilakukan 2. Dilakukan pengenceran berseri hingga 10 -3 , Dua kali pengenceran terakhir disebar sebanyak 0,1 pada medium MRSA, selanjutnya diinkubasi pada suhu 370 C selama 2x24 jam. ► Tahap Pemurnian dengan Metode Streak Kuadran 1. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri satu tipe sel 2. Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkn ke permukaan koloni bakteri yang akan di streak pada planting MRSA 3. Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan MRSA 4. Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreak kan melewati streak primer kesatu atau kedua dn kemudian dilanjutkan streak sekunder tanpa kembali ke streak primer

5. Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streakan sekunder dan kemudian dilanjutkan strek tersier tanpa kembali ke streak sekunder dan primer 6. Planting diinkubasi pada uhu 37 0C Selama 2x24 jam. ► Pengamatan Morfologi Koloni 1. Pengamatan morfologi dilakukan pada koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian dengan streak kuadran. 2. Bentuk koloni, bentuk tepi, elevasi dan diamati. ► Pembuatan Stok Lactobacillus Koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian dengan streak kuadran ditanam pada media MRSA miring untuk persiapan perlakuan uji identifikasi. ► Pengamatan Morfologi Sel 1. Pengamatan morfologi sel dilakukan melalui teknik pewarnaan gram 2. Dibuat ulasan bakteri pada object glass, difiksasi 3. Ditetesi dengan gram A, dibiarkan selama 60 detik 4. Cuci dengan air mengalir, keringanginkan 5. Ditetesi dengan gram B, dibiarkan selama 60 detik 6. Dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan 7. Dicuci dengan alkohol 95% 8. Ditetesi dengan safranin, dibiarkan selama 60 detik, dicuci dan dikeringanginkan 9. Diamati dibawah mikroskop ► Uji Motilitas 1. Isolat dari stok ditanam pada MRSA tegak

2. Inkubasi pada suhu 370C selama 2x24 jam 3. Amati motilitas dari pertumbuhan bakteri yang terbentuk ► Uji Penggunaan Oksigen 1. Isolat dari stok ditanam pada MRSA tegak 2. Inkubasi pada suhu 370C selama 2x24 jam 3. Amati penggunaan oksigen dari pertumbuhan bakteri terrbentuk ► Uji Ketahanan Suhu 1. 2. Isolat dari stok ditanam pada MRSB di tabung Inkubasi pada suhu 450C selama 2x24 jam pada suhu 150 C dan 450 C.

3. Amati ketahanan suhu dari inkubasi apakah terjadi pertumbuhan bakteri atau tidak. ► Uji VP (Voges- Proskauer) 1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose 2. Bakteri uji diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 370C 3. Bakteri uji ditetesi KOH-alfanaftol 4. Hasil positif jika terbentuk kompleks warna pink ► Uji Katalase 1. Preparat ulas bakteri uji dibuat 2. Preparat ulas ditetesi dengan reagen H2O2 3. Perubahan diamati, hasil positif jika terbentuk gelembung gas dan hasil negatif jika tidak terbentuk gelembung gas. ► Uji Karbohidrat 1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Galaktosa, Mannosa dan Raffinosa

2. Bakteri uji diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 37 0C 3. Perubahan diamati, hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu. ► Uji TSIA 1. Biakan diinokulasikan pada media TSIA yang mengandung Laktosa, Sukrosa, fruktosa dan glukosa, dengan cara ditusukan ditarik dan diulas tegak lurus. 2. Diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. 3. Hasil dapat diamati/ diinterpretasikan ► Uji Reduksi Nitrat 1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair Nitrate Broth sebanyak 1 ose 2. Bakteri uji diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 37 0C 3. Diamati terbentuknya gelembung gs pada tbung durham 4. Bakteri juga ditetesi 1 ml Nitrate Reagent A dan dilanjutkan Reagen B 5. Hasil positif jika terbentuk warna merah tua 6. Jika tidak terbentuk warna merah tua selama 5 menit ditambahkan bubuk seng dan didiamkan, jika terbentuk warna merah menandakan uji negatifdan jika tidak terbentuk warna merah menandakan uji posotif. ► Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter dari bakteri yang telah diketahui. Menentukan persen homologi dengan rumus : % Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100% Jumlah karakter yang diujikan

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi merupakan proses untuk mengetahui, menentukan dan menempatkan suatu organisme ke dalam tingkatan taksa tertentu dengan membandingkan karakter yang dimilikinya dengan organisme lain yang telah diketahui. Identifikasi dapat dilakukan dengan 2 metode pendekatan yaitu konvensional dan pendekatan molekuler. Tujuan dari uji-uji identifikasi adalah untuk mengetahui karakteristik genus dan spesies dari suatu bakteri uji. Identifikasi jenis menggunakan semua sifat yang berkaitan dengan jenis. Hal ini mencakup morfologi, daya gerak, sifat biokimianya, kebutuhan akan oksigen, reaksi pewarnaan Gram, dan beberapa diantaranya sifat kekebalan (Anonymous, 2009). Isolasi dan identifikasi bakteri Lactobacillus spp.dari asinan sayur dimulai dengan dilakukannya pengenceran air asinan hingga 10 -3 kemudian disebar sebanyak 0,1 ml pada medium MRSA dan diinkubasi suhu 37 0C selama 2x24 jam. Hasil setelah diinkubasi diperoleh koloni bakteri dengan bentuk bulat dan mengkilat. Menurut Firmansyah (2009), ciri morfologi dari Lactobacillus adalah warna koloni putih susu atau agak krem, bentuk koloni bulat dengan tapian seperti wol. Pemurnian dengan streak kuadran selanjutnya dilakukan untuk

mendapatkan kultur murni sehingga mempermudah dalam mengidentifikasinya. Pemurnian dilakukan dengan mengambil satu koloni dari pengisolasian diatas, kemudian dilakukan streak kuadran pada medium MRSA dan diinkubasi selama 2x24 jam dengan suhu 37 0C. Hasil dari pemurnian ini dapat diketahui bentuk morfologi dari Bakteri Asam Laktat (BAL) yang diujikan yaitu diperoleh bentuk

morfologi yang bulat-bulat dengan permukaan cembung. Menurut Waspodo dalam Firmansyah (2009), koloni dari Lactobacillus yang ditumbuhkan pada media agar adalah biasanya berukuran 2-5 mm, dengan permukaan cembung, entire, buram (opaque) dan tanpa pigmen atau biasanya disebut sebagai warna putih susu. Pengamatan morfologi sel dari Lactobacillus spp. ini dilakukan dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram ini dilakukan dengan menambahkan larutan gram A (crystal violet), gram B (iodin) dan gram C (etanol 90%) serta gram D (Safranin) dengan interprestasinya jika berwarna ungu menunjukan gram positif (+) dan jika berwarna merah menunjukan gram negatif (-). Hasil yang diperoleh dari pewarnaan gram ini adalah isolat berwarna ungu yang menunjukan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam gram positif (+). Tabel .1 Uji TSIA, Uji Motilitas, Uji Katalase, Uji Pewarnaan Gram dan Uji Ketahanan Suhu Kel TSIA S= merah 1 B= hitam Menghasilkan 2 gas warna tetap Pecah/ 3 terangkat S= merah 4 B= hitam motil + ++ Non motil + + Non motil + ++ Motilitas motil Katalase Gram +/+ 450 + suhu 150 +

Tabel. 2 Hasil Uji Karbohidrat Penggunaan O2 Permukaan Tengah Dalam + + + + + + + -

Kel 1 2 3 4

Rafinosa + -

Manosa + + +

Galaktosa + + + +

Tabel . 3 Hasil uji VP-NR

Kel 1 2 3 4

VP _

NR + + +

A. Hasil Gambar Kelompok 3 Rombongan 1

Gambar 1. Hasil uji penggunaan oksigen

Gambar 2. Hasil uji penggunaan NR

Gambar 3. Hasil uji pewarnaan gram

Gambar 4. Hasil Uji Voger Proskauer

Gambar 5. Hasil uji karbohidrat

Gambar 6. Hasil uji Motilitas

Menurut Kandler dan Weiss dalam Arief, dkk (2006), bakteri asam laktat bersifat Gram positif, tidak membentuk spora, dapat berbentuk bulat atau batang, dengan komposisi basa DNA kurang dari 50% mol G+C, umumnya bersifat katalase negatif tetapi kadang-kadang terdeteksi katalase semu pada kultur yang ditumbuhkan pada konsentrasi gula rendah. Untuk tumbuh membutuhkan karbohidrat yang dapat difermentasi. Pengamatan selanjutnya adalah uji motilitas. Uji motilitas ini dilakukan untuk mengetahui motilitas dari pertumbuhan bakteri yaitu dengan menanamkan

bakteri (isolat) ke dalam media SIMA (Tryptone 30 gr, Meat extract 3 gr; Na2S2O35H2O 0,5 gr Cysteine 0,2 gr, Hydro chloride 5 gr, agar 5 gr dan akuades sebanyak 1000ml) dan diinkubasi selama 2x24 jam. Hasil yang diperoleh adalah media yang sebelumnya berwarna bening setelah diinkubasi warna menjadi keruh dan terlihat seperti ada kotoran dalam mediannya yang menunjukan bahwa bakteri di dalamnya bersifat motil. Uji penggunaan oksigen selanjutnya dilakukan untuk mengetahui sifat Lactobacillus spp. dalam perolehannya terhadap oksigen. Uji penggunaan O 2 ini dengan menumbuhkan isolat pada media MRSA dengan tiga perlakuan yaitu hanya menumbuhkan isolat pada permukaan media, pada media dengan sedikit ditusukan ke dalam dan yang ketiga dengan menusukan media yang lebih dalam lagi. Hasil yang diperoleh setelah diinkubasi selama 2x24 jam adalah bakteri paling banyak tumbuh adalah dalam semua perlakuan. Lactobacillus spp. merupakan bakteri yang dapat sedikit tumbuh di udara tapi akan lebih baik pertumbuhannya pada kondisi dibawah tekanan oksigen rendah dan beberapa anaerob pada isolasi (Firmansyah, 2009). Uji ketahanan suhu dilakukan dengan nenumbuhkan isolat pada media MRSB dengan suhu yang digunakan adalah 15 0C dan 45OC dan diinkubasi selama 2x24 jam. Hasil yang diperoleh pada suhu 15OC bakteri ini mampu tumbuh dengan baik jika dibandingkan dengan suhu yang lebih tinggi yaitu 45 OC. Menurut Firmansyah (2009), Lactobacillus spp. merupakan bakteri dengan suhu optimum pertumbuhannya adalah 30-370C. Hasil uji katalase menunjukan hasil negatif. Lactobacillus spp. bersifat katalase negatif tetapi kadang-kadang terdeteksi katalase semu pada kultur yang

ditumbuhkan pada konsentrasi gula rendah (Arief, dkk, 2006). Katalase merupakan enzim yang mengkatalisasikan penggunaan hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel

karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Berikut ini rekasinya : → H2O + ½ O2 katalase Uji Voges Proskauer biasanya digunakan untuk membedakan antara satu H2O2 spesies bakteri yang satu dengan yang lainnya (Cahyadi, 2007). Uji Voges Prokauer dikenal juga dengan uji VP. Isolat ditumbuhkan pada media VP kemudian diinkubasi selama 2x24 jam. Pengujian atau pengamatan dilakukan dengan menambahkan KOH 40% sebanyak 2-3 tetes dan α-naphlol sebanyak 2-3 tetes sebagai indikator dengan interpretasi jika terbentuk warna merah berarti hasil positif (+) dan jika warna tetap berarti hasil negatif (-). Hasil yang diperoleh dari pengujian VP ini adalah tidak terjadi perubahan warna atau negatif (-). Uji karbohidrat dilakukan dengan nenumbuhkan isolat pada media MRSB yang telah ditambah BCP dengan tiga perlakuan yaitu tabung pertama dengan manosa kemudian tabung dua dengan rafinosa dan ketiga menggunakan galaktosa. Hasil yang diperoleh adalah bakteri tumbuh lebih banyak pada media dengan manosa dan galaktosa sedangkan media dengan ditambah rafinosa tidak menunjukan adanya pertumbuhan. Kompleksitas struktur karbohidrat

mempengaruhi fermentasi yang dilakukan oleh mikroorganisme. Monosakarida lebih sering difermentasikan terlebih dahulu daripada disakarida. Apabila dalam medium terdapat monosakarida dan disakarida, maka mikroorganisme akan memecah monosakarida terlebih dahulu. Uji produksi asam dari karbohidrat tertentu sangat penting dalam klasifikasi dan identifikasi (Salle, 1961). Beberapa

jenis bakteri genus Lactobacillus menurut Sneath et al dalam Firmansyah (2009), mengfermentasi glukosa, laktosa dan galaktosa tetapi tidak memfermentasi sukrosa dan mannosa. Lain halnya dari bakteri Lactobacillus bulgaris, dalam fermentasi karbohidrat bersifat Sakarolaktat obligat yaitu sebagian atau seluruh produk adalah asam laktat. Uji Reduksi Nitrat (NR), bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair Nitrat Broth sebanyak 1 ose kemudian diinkubasi 2x24 jam dengan suhu 37 0C. Pengamatan dilakukan dengan melihat adanya gelembung gas pada media dan ditambahkan Nitrat Reagen A dan B. Hasil yang diperoleh adalah tidak terjadi perubahan warna dari sebelumnya, kemudian ditambahkan Zn. Interprestasi data setelah ditambahkan Zn adalah merah jika negatif dan warna tetap jika positif. Hasil yang diperoleh dari uji NR ini adalah terjadi perubahan warna menjadi merah. Menurut Sneath et al dalam Firmansyah (2009), genus dari bakteri ini bersifat mikroaerofilik, mereduksi nitrat, tidak mendegesti gelatin dan kasein tetapi sejumlah kecil sumber nitrogen terlarut. Penentuan spesies dilakukan dengan pendekatan homologi yaitu data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter dari bekteri yang diketahui. Berdasarkan hasil praktikum, berikut adalah perbandingan ciri-ciri yang diperoleh sebagai berikut :

Homologi dengan Lactobacillus plantarum
% homologi  jumlah karakter yang sama  100 % jumlah karakter yang diujikan

=

11 × 100% = 78,5 % 14

Homologi dengan Lactobacillus brevis
% homologi  jumlah karakter yang sama  100 % jumlah karakter yang diujikan

=

12 × 100% = 85,7 % 14

Homologi dengan Lactobacillus acidophilus
% homologi  jumlah karakter yang sama  100 % jumlah karakter yang diujikan

=

11 × 100% = 78,6 % 14

Homologi dengan Lactobacillus casei
% homologi  jumlah karakter yang sama  100 % jumlah karakter yang diujikan

=

10 × 100% = 71,4 % 12

Homologi dengan Lactobacillus bulgaricus
% homologi  jumlah karakter yang sama  100 % jumlah karakter yang diujikan

10 × 100% = 71,4 % 14 Dari perhitungan homologi di atas bakteri yang diuji dari asinan sayur
= memiliki banyak kesamaan dengan Lactobacillus brevis.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan, praktikum Isolsi dan Identifikasi Lactobcillus spp., dapat disimpulkan sebagai berikut : 1. Lactobacillus merupakan bakteri gram positif, tidak berspora, tidak motil, fakultatif anaerob dengan warna koloni putih susu, bentuk koloni bulat serta tepian seperti wol. 2. Bentuk morfologinya circular (bulat), margin entire dan buram (opaque). 3. Penentuan spesies melalui pendekatan homologi diperoleh hasil Lactobacillus dari spesies L. brevis. permukaan bulat, cembung, bentuk

B. Saran Saran yang dapat diambil dari praktikum ini adalah praktikum isolasi dan identifikasi merupakan praktikum yang rumit dan memerlukan waktu yang lama sehingga diperlukan kecermatan dan ketelitian yang lebih, agar mendaptkan hasil yang lebih akurat.

DAFTAR REFERENSI

Anonymous. 2009. “Cara Mengisolasi Bakteri”. http//id.tahitianonijure.com. Diakses tanggal 26 November 2009. Arief, dkk. 2006. Karakteristik Lactibacillus spesies yang Diisolasi dari Daging Sapi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan. Fakultar Peternakan, IPB Barrow, G. I, Feltham, R. K. A. 1993. Cowan and Steel’s for the Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press, USA. Cahyadi. 2007. Uji Biokimia. http:// id.answer.yahoo.com. Diakses tanggal 26 November 2009. Firmansyah. M.2009. Mikrobiologi Lingkungan. http:// Blogspot com. Diakses tanggal 28 November 2009. www.putihijauku.

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta Salle, A.J. 1961. Fundamentals Principles of Bacteriology. McGraw-Hill Book Company, New York. Sujaya, dkk. 2008. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Susu Kuda Sumbawa. Jurnal Veteriner, Vol. 9 No. 2:52-59

Tabel homologi

Uji Suhu -150C -450C Karbohidrat -Rafinosa -Manosa -Galaktosa TSIA

Lactobacillus uji

L. plantarum

L. bulgaricus

L. brevis

L. casei

L. acidophilus

Referensi Cowan dan Steel’s, 1993

+ -

+ -

+

+ -

+ -

+

+ + +

+ + + -

+ + -

+ + + +

+ + -

+ + -

Cowan dan Steel’s, 1993

Cowan dan Steel’s, 1993 Cowan dan Steel’s, 1993 Cowan dan Steel’s, 1993 Cowan dan Steel’s, 1993

VP

-

-

-

-

-

-

NR

-

-

-

-

-

-

Motilitas

Non Motil

Non motil

Non motil

Non motil

Non motil

Non motil

Penggunaan O2 -Permukaan -Tengah -Dalam Pewarnaan gram + + + + + + + + + + + Schlegel dan Schmidt, 1994 Cowan dan Steel’s, 1993 Cowan dan Steel’s, 1993

Katalase

-

-

-

-

-

-


				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Tags:
Stats:
views:17226
posted:1/10/2010
language:Indonesian
pages:19
Description: identifikasi