modelpenerapan bioteknologi by sofyanarifin

VIEWS: 577 PAGES: 6

									MODEL PENERAPAN BIOTEKNOLOGI DALAM PENGELOLAAN KETAHANAN INSEKTISIDA HAYATI, Bacillus thuringiensis –toksin M. Sarjan Staf Pengajar Fakultas Pertanian-Program Studi Hama dan Penyakit Tumbuhan Universitas Mataram

ABSTRAK
Pengunaan Bacillus thuringiensis (Bt) secara intensif ternyata telah mengakibatkan terjadinya ketahanan hama walaupun masih berupa kasus yang terjadi di tingkat laboratorium maupun di tingkat lapangan. Untuk mengantisipasi masalah tersebut telah banyak dialakukan kajian-kajian tentang mekanisme ketahanan hama terhadap Bt baik dari aspek genetika, fisiologi maupun molekuler. Dalam kaitan tersebut dalam peper ini akan ditunjukkan alternatif model ketahanan Bt melalui pendekatan immunology dengan menggunakan berbagai lectin sebagai bahan analisis, karena adanya kesamaan karakatristik molekuler antara Bt-toxin dengan lectin terutama Helix pomatia lectin (HPL) yang diisolasi dari sebangsa bekicot. Dalam model ini dijelaskan bahwa resistensi serangga terhadap Bt disebabkan oleh meningkatnya jumlah protein koagulasi, yang berinteraksi dengan molekul ”oligomeric toxin” seperti ”oligomeric lectin”. Kata kunci : bioteknologi, insektisida hayati, Bacillus thuringiensis

PENDAHULUAN Penggunaan pestisida kimia secara intensif dalam pengendalian hama serangga yang dapat merusak produksi pertanian dan lingkungan. Terdapat banyak bukti bahwa dalam beberapa dekade telah munculnya banyak kasus resistensi serangga terhadap beberapa jenis insektisida kimia. Hal ini terjadi secara global termasuk di Indonesia seperti pada tanaman pangan, sayuran dan bahkan tanaman perkebaunan. Untuk mengantisipasi masalah tersebut muncul cara alternative yang lebih aman , efisien dan efektif yaitu dengan memanfaatkan biopestisida seperti Baicillus thuringiensis (Bt), suatu bakteri yang disiolasi dari tanah. Namun penggunaan biopestisida Bt ini secara luas dan intensif ternyata juga mendatangkan dampak negatif terutama terjadinya resistensi beberapa jenis hama seperti hama ulat kubis (Plutella xylostella) (Tang et al, 1996; 1997) dan hama penggerek buah kapas (Tabassnik et al, 2000). Ketahanan juga terjadi pada beberapa jenis hama di tingkat laboratorium seperti hama pengerek kapas lainnya , Heliothis virescens (Gahan et al, 2001). Kurangnya pengetahuan tentang cara kerja (mode of action) dari Bt-toxin merupakan salah satu kendala dalam upaya pengembangan strategi pengelolaan resistensi serangga termasuk bagaimana mekanisme resistensi serangga terhadap Bt. Kajian-kajian tentang mekanisme ketahanan serangga terhadap Bt telah banyak dilakukan , baik dari aspek genetika, fisiologi maupun aspek molekuler, namun sampai sekarang belum menjawab tantangan bagaimana menghindari terjadinya ketahanan atau bagaimana pengelolaan ketahanan hama terhadap Bt tersebut. Sistem Imun Serangga Keberadaan serangga di alam selalu mendominasi organisme baik jenis dan jumlahnya. Hal tersebut tak lepas dari kemampuan serangga untuk mempertahankan diri terhadap serangan dari luar baik yang bersifat biologis maupun non biologis dengan reaksi kekebalan yang sangat sederhana.(Gupta, 1991) Secara umum reaksi kekebalan serangga terdiri atas dua macam yaitu yang bersifat seluler maupun humoral. Reaksi seluler terutama melibatkan sel darah serangga atau hemocytes yang merupakan reaksi adesive hemocytes terhadap mikrobia atau parasit ( McKenzie, 1992; Strand, 1994). Pada reaksi tersebut terjadi perubahan-perubahan secara morpologi, tingkah laku dan jenis sel yang terlibat selama terjadinya infeksi yang secara luas telah diteliti menggunakan teknik mikroskopik, lectin dan monoclonal antibodi markers (Theopold, 1995; Theopold et al, 1996). Hemocyte mempagositosis bakteri, memperangkap mikrobia dalam nodul dan kapsulasi (Vinson and Hegazi, 1998). Hemocytes juga terlibat dalam reaksi imun lainnya seperti koagulasi hemolim (Brehelin, 1979; Gregoire, 1974). Sedangkan reaksi imun yang bersifat humoral secara prinsip terdiri atas sejumlah antibactericidal protein dan peptida dalam hemolim. Beberapa penemuan mengungkapkan bahwa reaksi kekebalan ditingkatkan oleh infeksi bakteri dengan cara meproduksi molekul antibakteria dimana secara fungsional belum difahami secara lengkap (Shiotsuki and Kato, 1999). Hasil penelitian terkini dengan menggunakan hemolim serangga telah mendeteksi keberadaan berbagai protein yang terbentuk sebagai respon terhadap

elisitor yang dapat di kategorikan sebagai “inducible bacreial proteins” dan ”inducible nonbactericidal proteins”. Mekanisme Ketahanan Serangga Secara Molekuler Secara umum, terdapat lebih dari satu protein pengikat Bt-toksin di dalam usus serangga dan sejauh ini protein-protein yang mengikat Bt-toksin pada serangga ordo lepidoptera adalah protein dengan berat molekul 120 kDa dan 220 kDa yang merupakan bagian integral dari fraksi brush border membrane vesicle (BBMV) (Martinez-Ramirez et al, 1994; Knight et al, 1994; Sangadala et al, 1994). Namun potein yang diekastrak pada kondisi denaturasi secara langsung dari usus serangga, protein pengikat Bt-toksin tambahan terisolasi. Sebagai contoh pada hama ulat kubis (Plutella xylostella), protein berukuran 85 kDa dijumpai sebagai protein utama yang dideteksi dengan Bt-toksin antibodi dan Helix pomatia Lectin (HPL) (Gambar 1). Hal ini berarti bahwa pada kondisi denaturasi (SDS-PAGE dan Western blots), Bt toxin dan HPL secara dominan mengikat p85.

1

2

3

85 kDa

Gambar 1.

Bt-toxin CryIAc mengikat glycoprotein serangga lepidoptera. Western blot yang mengandung ekstrak protein dari larva instar empat diprob dengan 1) preserum antibodi dengan menggunakan antibodi sekunder peroxidase-conjugated, 2) Peroxidase-conjugated HPL, 3) antibodi anti-CryIAc menggunakan antibodi sekunder peroxidase-conjugated.

A M G GC PM G

B GC PM

P 85

Gambar 2.

Pengecatan Coomassie (A) dan HPL (B) dari berbagai jaringan larva DBM. HPL hanya mendeteksi p85 dan protein-protein dari usus dengan ukuran lebih tinggi (G), gut content (GC) and peritrophic memberane (PM).

Fakta menunjukkan bahwa p85 tidak ditemukan pada BBMV yang berarti glycoprotein ini kemungkinan hilang selama proses fraksinasi BBMV. Dengan demikian protein tersebut keberadaannya bukan pada BBMV, tapi pada cairan usus serangga yang dibedah secara langsung. Pada pengecatan coomassie, p85 kelihatannya sangat samar dibandingkan dengan pada 3 protein lainnya dengan ukuran masing-masing 78, 80 dan 82 kDa yang sangat kuat pada pengecatan tersebut yang diduga sebagai arylphorin, phenoloxidase (PO) dan apolipophorin II (Gambar 2A). Dengan pengecatan HPL, p85 merupakan glycoprotein yang dominan( Gambar 2B), dimana p85 tersebut dapat terdeteksi pada beberapa jaringan DBM seperti usus, lemak tubuh, hemolymph dan isi usus (Gambar 3). Hasil pengamatan ini menunjukkan bahwa

p85 kemungkinan diproduksi di dalam lemak tubuh dan dilepaskan ke cairan usus. (Gambar 2A). Dari pengamatan tersebut juga menunjukkan bahwa p85 terdapat pada peritrophic membrane dalam jumlah sedikit (Gambar 2 B), yang berarti berasosiasi tetapi bukan merupakan bagian struktur peritrophic membrane. Untuk menganalisis kemungkinan fungsi p85 sebagi protein pengikat toksin, dilakukan pengujian pada larva DBM resisten dan peka. Pada strain yang resisten HPL mengikat p85 lebih kuat dibandingkan dengan yang strain yang peka (Gambar 4). Kemungkinan penjelasannya adalah bahwa jumlah p85 meningkat pada cairan usus serangga resisten . Temuan terakhir mengidentifikasikan bahwa glycoprotein yang terlibat dalam koagulasi memiliki kesamaan yang bervariasi (Li et al, 2002). Sebagai contoh kelompok protein yang menginduksi reaksi imun larva membentuk komplek yang tidak terlarut (non-soluble complexes), sementara protein dari larva yang tidak terinduksi tetap dalam bentuk terlarut (D.Li, unpubl. data). Dari keberadaan p85 tersebut yang terdapat dalam hemolymph , salah satu kemungkinan peranan protein ini adalah keterlibatannya dalam reaksi koagulasi. L G GC Fb Car Hem

p85

Gambar .3.

Western blot ekstrak protein dari individu jaringan larva DBM yang berbeda yang dicat dengan HPL. P85 glycoprotein dapat terdeteksi pada berbagai jaringan seperti larvae (L), Gut (G), Gut Content (GC), Fat body (FB), Carcases (Car) and Hemolymph (Hem).

R

R

M

S

S

P85

Gambar 4.

Western blot total ekstrak protein dari individu larva DBM resisten (R) dan susceptible (S) yang dicat dengan peroxidase-conjugated HPL, menunjukkan p85 tercat lebih kuat dibvandingkan dengan p85 pada serangga susceptible

Dengan menggunakan pendekatan imunologi Sarjan (2002) telah melakukan penelitian mekanisme ketahanan serangga lepidoptera terhadap Bacillus thuringiensis-endotoxin. Dengan menganalisis ekstrak usus serangga uji, ditemukan bahwa protein utama yang mengikat Cry IAc dari Bt-toxin adalah p85 yang merupakan glyucoprotein yang terlarut yang kemungkinan berperanan dalam kogulasi glicoprotein hemolim (Sarjan , 2003 in prep). Lokasi p85 yang merupakan protein yang berhubungan dengan sistem kekebalan serangga terdapat di cairan usus serangga . dimana terjadi perubahan p85 baik secara kualitatif

maupun kuantitatif pada serangga yang tahan terhadap Bt-toxin (Sarjan, 2002). Model mekanisme ketahanan serangga terhadap Bt-toxin yang dikemukakan oleh Sarjan (2002) adalah sebagai berikut (Gambar 5):

Gambar 5.

Model Ketahanan Seangga terhadap Bt, memperlihatkan keberadaan p85 pada dua tingkatan yaitu pada serangga yang berstatus tahan dan peka. Model ini menunjukkan bahwa peningkatan Bt-toxin pada usus serangga yang menyebabkan toksisitas pada tingkat p85 yang rendah, tetapi akan memblok Bt-toxin pada tingkat p85 yang tinggi. Bila toxin meningkat terus, maka p85 yang merupakan protein koagulasi akan berkurang sehingga menyebabkan molekul toxin dapat mencapai sel usus yang menyebabkan serangga menjadi peka kembali.

KESIMPULAN Jumlah p85 meningkat pada larva dari strain resisten, yang mungkin akan menyebabkan peningkatan reaksi menyebabkan agregasi lipophorin ke dalam komplek koagulasi yang terlarut. Keadaan dapat menyebabkan absennya p85 pada peparasi serangga resisten.

DAFTAR PUSTAKA Gahan, L. J., Gould, F., and Heckel, D. G. (2001). Identification of a gene associated with Bt-resistance in Heliothis virescens. Science 293, 857-860. Gang Ma,. Sarjan, M., Preston, C, Asgari, S and Otto Schmidt, 2005. Mechanisms of inducible resistance against Bacillus thuringiensis endotoxins in invertebrates . Insect Science (2005) 12, 319 Gang Ma, Harry Roberts, Muhammad Sarjan, Nicki Featherstone, Jelle Lahnstein, Ray Akhurst, Otto Schmidt, 2005. Is the mature endotoxin Cry IAc from Bacillus thuringiensis inactivated by a coagulation reaction ion the gut lumen of resistant Helicoperva armigera larvae?. Insect Biochem.Mol.Biol. 35:729-739, 2005. Griffitts, J. S., Whitacre, J. L., Stevens, D. E., and Aroian, R. V. (2001). Bt toxin resistance from loss of a putative carbohydrate-modifying enzyme. Science 293, 860-864. Gupta, A. P. (1991). Insect immunocytes and other hemocytes: roles in humoral and cellular immunity. In A. P. Gupta (Ed.), Immunology of Immunology of Insects and other Arthropods, (pp. 19-118). Boca Raton, Florida: CRC Press.

Hallett, R.H., Zilahi-Balogh, R., Engerilli, N.P.D and Borden, J.H. (1993). Development of a Pest management System for Diamonback Moth, Plutella xylostella .L (lepidoptera: Yponomeutidae) in a Third –World Country-Considerations for Sustainability. In Pest Control and Sustainable Agriculture. CSIRO. Entomology. Canberra.Australia Harwood, R.R., 1990. A History of Sustainable Agriculture in Sustainable Agricultural Systems. Eddited by Edwards, C.A, Rattan, L, Patrick, M, Robert, H.M and Gar House. Li, D., Scherfer, C., Korayem, A. M., Zhao, Z., Schmidt, O., and Theopold, O. (2002). Insect hemolymph clotting: evidence for interaction between the coagulation system and the prophenoloxidaseactivating cascade. Insect Biochemistry and Molecular Biology. Luna, J.M and Garfield, J.H., 1990. Pest Management in Sustainable Agricutural System in Sustainable Agricultural Systems. Eddited by Edwards, C.A, Rattan, L, Patrick, M, Robert, H.M and Gar House. Martinez-Ramirez, A.C., Gonzales-Nebauser S., Escriche, B., and Real, M. D. (1994). Legand blot identification of a Manduca sexta midgut binding protein spesific to three Bacillus thuringiensis cry IA-type ICPs. Biochem. Res.Commun 201, 782-787 McKenzie, A. N. J. and Preston, T. M. (1992) Functional studies on Calliphora vomitoria haemocytes subpopulations defined by lectin staining and density centrifugation. Dev. Comp. Immunol. 16, 1930. Rachman, M; Sassan, A; Sarjan, M and Schmidt, O.,2004. Induction and Transmission of Bacillus thuringiensis tolerance in the flour moth Ephestia kuehniella ( Jurnal PNAS, Vol 101 No.9, 2004). Rajakurendran, V., 1993. Use of Bt on Vegetable Crops In Australia Second Bacillus thuringiensis. Meeting Canbera ( Abs). 21 –23 September 1993. Rasahan, C.A., 1996. Kebijakan Pembangunan Pertanian di Indonesia menjelang pasar bebas. Makalah workshop” Tindak lanjut pengembangan PHT di Bandung, 3-7 Nov. 1996 17 h. Richard Glatz, Harry L.S. Roberts, Dongmei Li, Muhammad Sarjan, Ulrich H. Theopoldc, Sassan Asgari, Otto Schmidt,2004. Lectin-induced haemocyte inactivation in insects ( Jurnal of Insect Physiology, Vol 50.No 10, October 2004) Sangadala , S., Walters, F. S., English, L. H., and Adang, M. J. (1994). Amixture of Manduca sexta aminopeptidase and phosphatase enhances Bacillus thuringiensis insecticidal cry I A(c) toxin binding and **Rb-K- efflux in vitro. J. Biol. Chem. 269, 10088- 10092.Wallingford, UK. 604 p. Sarjan, M., 1995. The Use of Bacillus thuringiensis to control Spodeptera exigua Hbn on onion. Laporan Penelitian, Fakultas Pertanian Universitas Mataram. 17h Sarjan, M., 2002. Resistance against endotoxin from Bacillus thuringiensis in lepidopteran insects (Ph.D thesis, 2002) Sarjan, M., 2003a. Immune Reactions in the Bacillus thuringiensis Resistant Insect (Agroteksos, Vol. 13. No. 3. October 2003) Sarjan, M.,2003b. Glycosilation status of Glycoproteins and Location of the Immune realated Proteins in the Gut of caterpillar( Jurnal Lemlit Universitas Mataram, Oktober 2003 Sarjan, M., 2004. The potency of non-chemical syntetic insecticides in conserving predator of army worm (Spodoptera litura F.) on soybean crop (Agroteksos, Vol. 13. No. 4. January 2004) Schmidt, O; Fabri, M; Sarjan, M; Theopold, U. 2005. Mode of action of antimicrobial proteina, poreforming toxins and biologically active peptides ( Hyphothesis). Review ISJ, 2: 82-90. 2005. O Schmidt, M Rahman, G Ma, U Theopold, Y Sun, M Sarjan, M Fabbri, H Roberts, 2005. Mode of action of antimicrobial protein, pore-forming toxins and biologically active peptides ( Hyphothesis). Review ISJ, 2: 82-90. 2005. Strand, M. R. (1994) Microplitis demolitor polydnavirus infects and expresses in specific morphotypes of Pseudoplusia includens haemocytes. J. Gen. Virol. 75, 3007-3020. Schnept, E; Crickmore, N; Van Rie, J; Lereclus, D; Baum, J; Feitelson, J; Zeigler, D.R and Dean, D.H (1998). Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins. Microbiol and Mol Biol Rev, 62:3:775-806

Tabashnik, B.E., Cushing, N.L., Finson, N., and Johnson, M.W. (1990). Field development of resistance to Bacilus thuringiensis in diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae). J.Econ.Entomol. 83:16711676. Tabashnik, B. E., Liu, Y. B., Malvar, T., Heckel, D. G., Masson, L., Ballester, V., Granero, F., Mensua, J. L., and Ferre, J. (1997). Global variation in the genetic and biochemical basis of diamondback moth resistance to Bacillus thuringiensis Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 94, 12780- 12785. Tang, J. D., S. Gilboa, R. T. Roush and A. M. Shelton. (1997) Inheritance, stability, and fitness of resistance to Bacillus thuringiensis in a field colony of Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) from Florida. Journal of Economic Entomology 90:732-741. Theopold, U., Samakovlis, C., Tempst, P., Dillon, N., Axelsson, B., Schmidt, O. and Hultmark, D. (1996). Helix pomatia Lectin, an Inducer of Drosophila Immune Response, Binds to Hemomucin, a Novel Surface Mucin. J. Biol. Chem 271, 12708-12715. Vinson, S. B. and Hegazi, E. M. (1998) A possible mechanism for the physiologicalsuppression of conspecific eggs and larvae following superparasitism by solitary endoparasitoids. J. Insect Physiol. 44, 703-712.


								
To top