During the past decade several d

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					SCHEDA N. 10

ARGOMENTO: GENOTECHE E DISPLAY PROTEICO

Introduzione Il concetto di display di librerie geniche è emerso negli ultimi decenni e ha trovato applicazione pratica in numerosi modelli biologici con rilevanti risultati sia scientifici che applicativi. Il display consente di associare fenotipo a genotipo: in altre parole ogni proteina (espressione fenotipica) porta fisicamente con se la propria informazione genetica (genotipo). Per questo motivo, l’isolamento di una struttura proteica, soprattutto in virtu’ della sua capacità di formare legami chimici con una controparte, consente di leggere la sua informazione genetica e contemporaneamente di incrementare a piacere la disponibilità della proteina. Il display viene ottenuto in modi diversi (Fig. 1): nel piu’ comune, il gene d’interesse è clonato in fusione con quello codificante una proteina di superficie di un vettore che puo essere un microrganismo (virus o batterio) o una cellula eucariotica (dal lievito alla cellula umana). L’espressione della proteina chimerica consente di identificare ed isolare il vettore e con esso il gene in questione. In altri casi, l’associazione genotipo-fenotipo è ottenuta sfruttando una condizione naturale e cioè isolando i complessi mRNA-proteina. Un’ultima possibilità è, infine, offerta dal doppio ibrido: geni di due proteine sono clonati in vettori diversi in frame con due geni residenti che codificano per due frammenti di una stessa proteina. L’interazione tra i polipeptidi dei geni d’interesse ricostituisce fisicamente la proteina, così come la sua attività biologica (enzimatica o regolataria) conferendo alla cellula ospite un qualche vantaggio selettivo o la capacità di esprimere dei marcatori identificabili. I sistemi sopra indicati trovano il loro significato operativo in librerie geniche e cioè un sistema complesso in cui ciascun vettore espone una diverso polipeptide isolabile per affinità. Oltre che alle librerie genomiche e di cDNA, il dsplay di librerie si applica anche a molecole naturalmente variabili, come gli anticorpi o i recettori linfocitari T, o a geni mutagenizzati in modo casuale, creando il presupposto per un’evoluzione molecolare. In questa scheda saranno brevemente descritti alcuni dei metodi di display genico per chiarire ulteriormente i concetti espressi piu’ sopra. I casi piu’ interessanti saranno ripresi in altre schede e trattati in modo piu’ completo.

Fig. 1 Phage display Nel caso del phage display l’espressione di frammenti polipeptidici sulla superficie della particella fagica (una fago filamentoso come l’M13 o l’fd) è ottenuta clonando il suo gene codificante in fusione e in-frame con uno dei geni che codificano per una delle proteine del rivestimento del fago. Il vettore di clonaggio è

costruito in modo tale da poter essere impaccato nella particella fagica. I differenti sistemi utilizzati prevedono un display del polipeptide sia di tipo monovalente (a copia singola), sia di tipo multivalente (a copie multiple) a seconda della proteina di ancoraggio e del vettore utilizzato. Il sistema piu’ diffuso di tipo monovalente, utilizzato ad esempio per l’espressione di anticorpi con fusione diretta o associazione con ponti disolfuro, prevede la fusione con la proteina minoritaria del rivestimento del fago indicata con la sigla g3p. Nel caso del tipo multivalente, l’espressione avviene in fusione con la proteina maggioritaria del rivestimento del fago (g8p, 2700 copie) e questa condizione aumenta implicitamente l’avidità dell’interazione con il ligando nel corso della selezione della libreria.

Fig. 2 Ribosome and mRNA display Nel ribosome display, il link tra il polipeptide e l’RNA codificante ò costituito dal ribosoma stesso il cui rilascio, al termine della traduzione dell’RNA , viene bloccato. Il complesso ternario così formato viene usato per la selezione. Nell’RNA display il legame tra RNA e polipetide è assicurato dall’antibiotico puromicina.

Fig. 3 Questi metodi di display sono interamente condotti in vitro, eliminando così la necessità di un passaggio di trasformazione di cellule batteriche, come accade sovente in altri metodi. Inoltre, in questo sistema è particolarmente agevole indurre mutagenesi del gene clonato d’interesse, inducendo una diversità artificiale. In Fig. 3 sono riportati, a titolo d’esempio, i passaggi fondamentali nell’utilizzo dei due metodi.

Yeast and bacterial cell display In questo caso, il polipeptide chimerico è espresso sulla superficie di una cellula di lievito o di un batterio. Nel caso del lievito Saccaromyces cerevisiae, la fusione avviene con il gene codificante per una proteina di membrana (agglutinina) che determina l’adesione cellulare. L’espressione totale delle molecole ricombinanti è di circa 3x104 e questo rende possibile la selezione di cellule in cui il ligando interagisca marcando la cellula sulla superficie. Il recupero avviene utilizzando sistemi automatici come il Cell Sorter (FACS) che leggono la fluorescenza e separano le cellule in base a questa. Il display su cellule batteriche segue lo stesso principio, con espressione di proteine chimeriche che hanno come base le proteine batteriche della membrana esterna di Escherichia coli. Esiste un’ampia selezione di proteine di membrana utilizzabili a questo scopo, come dall’elenco di Fig. 4 riportato a titolo d’esempio.

Fig. 4 Il caso piu’ noto di bacterial display è quello del gene Omp A, la cui schematizzazione è riportata in Fig. 5.In condizioni normali, l’inserzione di un gene esogeno puo’ avvenire solo in uno dei loop della proteina che protrudono nell’ambiente esterno, con conseguenti difficoltà di clonaggio (figura a sinistra). Una maggiore versatilità si è ottenuta modificando Omp A con l’inserzione di una seconda proteina di E. coli denominata

Lpp (lipoproteina). La modificazione della topologis di Omp A che ne consegue, consente l’inserzione della proteina esogena all’estremità C-terminale.

Fig. 5 Il sistema del doppio ibrido (yeast e bacterial two-hybrid) ed il PCA (Protein Complementation Assay) I sistemi del doppio ibrido, sia batterico sia di lievito, si basano su prodotti di fusione costituiti da due polipeptidi che interagiscono l’uno con l’altro (anticorpo-antigene, ormone-recettore, tossina-recettore, enzima-substrato, adattatori proteici, ecc.) e due metà funzionali di un fattore di trascrizione. I fattori di trascrizione eucariotici, che attivano l’espressione genica, sono formati da due domini, uno d’interazione con il DNA (binding domain), l’altro attivatore vero e prorio (activating domain). L’interazione tra i due polipeptidi esogeni riassembla il fattore di trascrizione che puo’ interagire con il promotore consentendo l’espressione di un gene reporter che è costituito da un fattore di resistenza ad un antibiotico o un enzima cromogeno (Fig. 6).

Fig. 6 Nel doppio ibrido batterico, il principio è lo stesso, con due domini di una proteina fusi con due possibili interattori. La differenza fondamentale è che , in questo caso, vengono usati degli enzimi come la -lattamasi batterica o il diidrofolato riduttasi eucariotica che garantiscono la resistenza ad un antibiotico e quindi la crescita della colonia batterica in cui l’interazione tra i due geni clonati puo’ avvenire (Fig. 7). Questo sistema viene genericamente indicato con il termine con il termine di PCA (Protein-fragment Complementation Assay).

Fig. 7


				
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posted:12/29/2009
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