Documents
Resources
Learning Center
Upload
Plans & pricing Sign in
Sign Out

20

VIEWS: 68 PAGES: 6

									Sains Malaysiana 37(4)(2008): 429-433

Peningkatan Produktiviti Siklodekstrin Glukanotransferase dengan Menggunakan Kultur Selanjar
(Increased productivity of Cyclodextrin Glucanotransferase using continuous culture) KHOSIYA SALI, AIDIL ABDUL HAMID & WAN MOHTAR WAN YUSOFF

ABSTRAK

Penghasilan Siklodekstrin glukanotransferase(CGTase) daripada Bacillus sp. G1 berjaya ditingkatkan dengan menggunakan sistem kultur selanjar mengatasi penghasilan daripada kultur kelompok. Aktiviti CGTase tertinggi yang didapati dalam kultur kelompok ialah 28.1 U/ml. Kajian kultur selanjar difokuskan kepada masa kemasukan medium segar yang berbeza (12, 24 dan 48 jam ), kadar pencairan ditetapkan pada 0.03 per jam. Hasil menunjukkan masa memulakan pam medium segar tidak memberi perubahan yang signifikan terhadap aktiviti CGTase (25.7, 26.3 dan 26.1 U/ml masing-masing) dan produktiviti CGTase (0.77, 0.79 dan 0.78 U/ml/j masing-masing) pada keadaan mantap tetapi produktiviti CGTase (0.77 U/ml/j) akan lebih tinggi berbanding produktiviti kultur kelompok apabila masa di antara larian kultur kelompok diambil kira. Malah peningkatan berpotensi ditingkatkan lagi dengan memulakan pam medium segar lebih awal daripada 12 jam dan juga dengan meningkatkan kadar pencairan. Kata kunci: Bacillus sp. G1; CGTase; kultur selanjar
ABSTRACT

The production of Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) from Bacillus sp. G1 was successfully increased using continuous culture. The highest CGTase activity in batch culture was 28.1 U/ml. The study in continuous culture was focused on the effect of different time (12, 24 and 48 hours) to start pumping fresh medium at fixed dilution rate of 0.03 per hour. Results showed that the pumping time did not give significant changes in CGTase activity (25.7, 26.3 and 26.1 U/ml, respectively) and in CGTase productivity (0.77, 0.78 and 0.78 U/ml/h) respectively at steady state operation. Nevertheless, the productivity (0.77 U/ml/h) of CGTase was found to be higher than that obtained in batch culture when the time interval between batch run was taken into account. The productivity could be further increased by pumping the media earlier than 12 hours and also by increasing the dilution rate. Keyword: Bacillus sp. CGTase; continuous culture; G1 PENDAHULUAN Siklodekstrin glukanotransferase (CGTase, alpha-1,4-glukan, 4-glykosyltransferase, EC.2.4.1.19) ialah kumpulan enzim ekstrasel yang dapat menukar kanji atau "-1-4 glukan yang lain seperti maltodekstrin, amilose dan lain-lain kepada siklodekstrin (CD) (Tonkova 1998). CD digunakan dalam pelbagai industri seperti industri makanan, kosmetik, famarseutikal, industri kimia dan racun makhluk perosak (Szejtli 1997; Vassileva et al. 2005). CGTase dihasilkan oleh pelbagai jenis mikroorganisma. Alkalofilik bacillus adalah spesies yang paling banyak digunakan dalam penghasilan CGTase dan (!-CD adalah produk utama yang dihasilkan oleh enzim ini (Tonkova 1998). Kebanyakan laporan penghasilan CGTase menggunakan kultur kelompok (Gawande et al. 1998; Tonkova 1998). Walaupun begitu, teknik kultur selanjar berupaya meningkatkan aktiviti CGTase dan produktiviti CGTase melebihi produktiviti kultur kelompok seperti yang dilaporkan Jamuna et al. (1993). Ianya sebanyak 3 kali ganda lebih tinggi berbanding kultur kelompok. Abdel et al. (2000) juga melaporkan produktiviti CGTase dalam kultur selanjar 10 kali ganda lebih tinggi berbanding kultur kelompok. Manakala Vassileva et al. (2005) melaporkan bahawa penghasilan secara kultur selanjar mampu meningkatkan aktiviti CGTase 2.4 kali ganda berbanding kultur kelompok. Dalam operasi kultur selanjar terdapat beberapa faktor yang perlu dikaji dan masa mula pam medium segar merupakan salah satu faktor yang penting. Ramai pengkaji fokus kepada penelitian kesan kadar pencairan (Jamuna et al. 1993; Kunamneni et al. 2007) dan tidak kepada kesan masa mula operasi kultur selanjar. Masa permulaan pam medium sekiranya dapat dipercepatkan, produktiviti CGTase juga akan meningkat. Masa permulaan kultur selanjar seperti yang dicadangkan oleh Pirt (1975), ialah pada fasa eksponen, kerana pada fasa ini mikroorganisme berada dalam keadaan yang paling aktif jika dibandingkan dengan fasa pertumbuhan lain. Oleh itu, kajian ini fokus kepada pengurangan masa operasi kultur selanjar untuk meneliti kesannya ke atas produktiviti CGTase daripada pencilan tempatan Bacillus sp. G1, yang merupakan alkalofilik bacilli yang berpotensi dalam penghasilan (!-CGTase (Wan Mohtar et al. 2002).

430

BAHAN DAN KAEDAH
STRAIN BAKTERIA DAN KULTUR STOK

PENENTUAN AKTIVITI CGTASE

Bacillus alkalofilik sp. G1 merupakan pencilan tempatan dan diperoleh dari kultur stok simpanan makmal Teknologi Fermentasi, Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia. Kultur disimpan pada suhu 4°C dan di subkultur setiap empat minggu sekali untuk memastikan tiada kontaminasi pada stok.
PENYEDIAAN INOKULUM

Bacillus sp. G1 di kultur dalam kelalang 250 ml yang mengandungi 100 ml medium Horikhoshi II (Horikoshi 1979). Seperti berikut: 1% (w/v) kanji larut, 0.5% (w/v) pepton, 0.5 % (w/v) Ekstrak yis, 0.1% (w/v) K2HPO4, 0.02% MgSO4.7H2O dan 1% (w/v) Na2CO3. dan pH ialah 9.8 dan di eram pada 35°C dengan goncangan 150 rpm (Incubator shaker, INFORS) selama 18 jam.
PENGHASILAN CGTASE DALAM KULTUR KELOMPOK

Aktiviti enzim CGT ase diasai berdasarkan kaedah fenolftalein (Kaneko et al. 1987). Sebanyak 1 ml larutan 4% kanji larut dalam 0.1 M natrium fosfat (pH 7) di campur dalam tabung uji dengan 0.5 ml sampel enzim. Campuran di eram pada 70°C selama 10 minit. Selepas itu, 3.5 ml 30 mM NaOH dimasukkan serta merta ke dalam campuran tersebut untuk menghentikan tindak balas enzim. Sebanyak 0.5 ml larutan fenolftalein (0.02% (w/v) dalam 5 mM Na2CO3) dimasuk dan dibiarkan selama 15 minit pada suhu bilik. Seterusnya nilai ketumpatan optik dibaca pada jarak gelombang 550 nm dengan menggunakan spektrofotometer (Hitachi). Aktiviti !#CGTase dapat ditentukan melalui lengkuk piawai !# siklodektrin. Satu unit aktiviti CGT ase ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang berupaya menghasilkan 1 µmol !#siklodektrin per min.
PENENTUAN KEPEKATAN KARBOHIDRAT

Penghasilan secara kultur kelompok dilakukan dalam fermentor 2L (LH Fermentation LTD., Stoke Poges, UK). Sebanyak 10% (v/v) inokulum dimasukkan dalam fermentor dengan isipadu akhir kultur sebanyak 1L. Medium pengkulturan adalah mengikut Hanan et al. (2005) mengandungi 4% (w/v) kanji ubi kayu, 2% (w/v) pepton, 0.04% (w/v) MgSO4.7H2O dan 1% (w/v) Na2CO3, pH ialah 9.8. Pengkulturan dilakukan pada suhu 35°C, pengudaraan 1 v/v/m dan goncangan 150 rpm selama 120 jam. Pensampelan dilakukan setiap 12 jam untuk pengasaian kepekatan biojisim, aktiviti CGT ase dan kepekatan karbohidrat.
PENGHASILAN CGTASE DALAM KULTUR SELANJAR

Penentuan karbohidrat ditentukan dengan menggunakan kaedah asid fenol-sulfurik (Dubois et al. 1956). Sebanyak 0.5 ml fenol 5% ditambah dengan 2.5 ml H2SO4 pekat dan kemudian dimasukkan 0.5 sampel. Campuran itu di eram selama 20 minit pada suhu bilik. Kemudian ditentukan nilai ketumpatan optik (OD) pada jarak gelombang 490 nm. Kepekatan karbohidrat ditentukan melalui lengkuk piawai kanji larut. HASIL DAN PERBINCANGAN
PERTUMBUHAN BIOJISIM DAN PENGHASILAN CGTASE OLEH BACILLUS SP. G1 DALAM KULTUR KELOMPOK UNTUK MENENTUKAN JULAT MASA MULA PAM MEDIUM SEGAR

Parameter pengkulturan adalah seperti yang dinyatakan dalam penghasilan kultur kelompok. Kedua-dua pam peristaltik (Watson-Marlow LTD., Falmouth, Cornwall, UK.) untuk aliran medium masuk dan keluar ditetapkan. Kadar pencairan ditetapkan pada 0.03 j–1 dengan menetapkan kadar alir medium sebanyak 0.5 ml/min. Tiga eksperimen dilaksanakan untuk menentukan masa terbaik kemasukan (12, 24 dan 48 jam) medium segar. Medium pengkulturan diguna sebagai medium segar. Pengkulturan dilakukan selama 120 jam. Pensampelan dilakukan setiap 12 jam untuk pengasaian kepekatan biojisim, aktiviti CGTase dan kepekatan karbohidrat.
PENGASAIAN PENENTUAN BIOJISIM

Sampel dicairkan dalam 0.85 % NaCl dan nilai ketumpatan optik (OD) ditentukan pada jarak gelombang 600 nm dengan menggunakan spektrofotometer (Hitachi). Penentuan biojisim ditentukan melalui lengkok piawai sel berat kering melawan dengan bacaan OD pada 600 nm.

Rajah 1 menunjukkan penghasilan CGTase didapati berlaku mengikut profil pertumbuhan dan aktiviti tertinggi pada 36 jam (28.1 U/ml). Semua penghasilan berlaku semasa fasa eksponen. Ini menunjukan bahawa masa mula pam medium segar adalah dalam julat 12 hingga 36 jam iaitu pada pertengahan fasa eksponen. Hasil yang diperolehi didapati tidak seperti yang di laporkan oleh Jamuna et al. (1993) dan Vassileva et al. (2005) kerana masa yang digunakan mereka untuk mula pam medium segar ialah pada akhir fasa eksponen. Manakala pertumbuhan biojisim (8.4 g/l) tertinggi juga pada jam ke-36 dan berkadaran dengan penggunaan karbohidrat. Kepekatan karbohidrat yang terguna dianggarkan sebanyak 20 g/l dan tak menurun lagi selepas 48 jam pengkulturan menandakan tiada peningkatan pertumbuhan dan sintesis CGTase. Fenomena ini berlaku seperti yang didapati oleh Jamuna et al. 1993 dan Rosso et al. 2002. Ini mungkin disebabkan kehabisan sumber nitrogen dalam medium pengkulturan atau pertumbuhan sudah masuk fasa pegun.

431

Kepekatan biojisim setara (g)

Masa (j) RAJAH 1. Profil pertumbuhan, aktiviti CGTase dan kepekatan karbohidrat dalam kultur

kelompok dengan fermentor 2L yang mengandungi 1L medium pengkulturan (pada suhu 35°C, 1 v/v/m, 150 rpm, selama 120 jam)

KESAN MASA MULA PAM MEDIUM SEGAR KE ATAS PERTUMBUHAN BIOJISIM DAN PENGHASILAN CGTASE OLEH BACILLUS SP. G1 DALAM KULTUR SELANJAR

Dalam penghasilan secara selanjar, medium pengkulturan perlu dimasukkan dengan berterusan supaya kultur sentiasa dibekalkan dengan medium yang baru kerana dapat mengelakkan daripada berlaku perencatan pertumbuhan dan sintesis CGTase. Oleh itu, masa mula pam medium yang berbeza (12, 24 dan 48 jam) dalam kultur selanjar telah dikaji berdasarkan profil pertumbuhan pada fasa eksponen dan permulaan fasa pegun. Rajah 2 menunjukkan bahawa sistem kultur selanjar berjaya di selenggara pada keadaan mantap sehingga 120 jam dengan purata aktiviti CGTase pada keadaan mantap sebanyak 25.7 U/ml (12j mula pam),

26.3 U/ml (24j mula pam) dan 26.1 U/ml (48j mula pam). Aktiviti CGTase pada ketiga-tiga eksperimen menunjukkan perbezaan yang tidak signifikan. Oleh itu, masa 12 jam adalah masa yang terbaik untuk mula pam medium segar dalam kultur selanjar, kerana penuaian lebih cepat akan meningkatkan lagi produktiviti. Kultur selanjar mungkin boleh di mula lebih awal iaitu pada julat 6-10 jam, berdasarkan kepada profil penghasilan CGTase dalam kultur kelompok. Persoalan bila medium segar boleh mula di pam tidak diteliti oleh Jamuna et al. (1993) tetapi hanya menetapkan pada 16 jam, manakala Abdel et al. (2000) tetapkan pada 24 jam dan Vassileva et al. (2005) tetapkan pada 6 jam. Kepekatan biojisim didapati menurun selepas pengkulturan dan ketiga-tiga eksperimen berjaya diselenggarakan pada keadaan mantap selepas 48, 72, 96

RAJAH

2. Aktiviti CGTase semasa pengkulturan selanjar dalam fermentor 2L dengan perbezaan (12, 24 dan 48 j) masa mula pam medium segar. (Pada kadar pencairan 0.03 j-1, 35oC, 1 v/v/m dan 150 rpm)

Aktiviti CGTase (U/m1/j)

Kepekatan karbohidrat (g/1)

Aktiviti CGTase (U/m1/j)

432

jam pengkulturan secara selanjar masing-masing (Rajah 3). Oleh itu, masa mula pam pada 12 jam paling baik untuk produktiviti kerana masa penyelenggaraan mantap bermula seawal 48 jam. Kepekatan biojisim tertinggi (3.4 g/l) dicerap pada keadaan mantap didapati apabila pam dimulakan pada 48 jam. Bagaimanapun keadaan ini tidak dapat memberi peningkatan terhadap aktiviti CGTase. Ini ternyata bahawa sintesis CGTase dengan baik ialah pada fasa eksponen seperi yang dilaporkan oleh Vassileva et al. (2003) yang juga melaporkan bahawa penghasilan CGTase berlaku pada fasa eksponen.

PERBANDINGAN AKTIVITI DAN PRODUKTIVITI CGTASE DALAM KULTUR KELOMPOK DENGAN KULTUR SELANJAR

RAJAH

3. Pertumbuhan Bacillus sp.G1 semasa pengkulturan selanjar dalam fermentor 2L dengan perbezaan (12, 24 dan 48 j) masa mula pam medium segar. (Pada kadar pencairan 0.03 j-1, 35°C, 1 v/v/m dan 150 rpm)

Jadual 1 menunjukkan aktiviti CGTase dalam kultur kelompok (28.1 U/ml) adalah lebih tinggi berbanding dengan aktiviti daripada kultur selanjar (25.7 U/ml). Ini mungkin disebabkan oleh faktor kadar pencairan apabila kadar alir medium yang dimulakan dalam kultur selanjar. Jamuna et al.(1993) juga melaporkan aktiviti CGTase dalam kultur kelompok (41.6 U/ml) lebih tinggi berbanding kultur selanjar (28 U/ml). Abdel et al. (2000) dalam penghasilan CGTase juga mendapati hasil yang sama. Laporan Vassileva et al. (2005) pula menyatakan bahawa aktiviti CGTase (478 U/ml) dalam kultur selanjar adalah lebih tinggi berbanding dengan kultur kelompok (199 U/ml). Walaubagaimanapun, dari segi produktiviti CGTase berjaya ditingkatkan dengan teknik kultur selanjar apabila masa di antara larian kultur kelompok diambil kira. Ini adalah kerana operasi kultur kelompok memerlukan masa menyediakan fermentor untuk larian ke-2 dan seterusnya. Hal ini berbeza dengan kultur selanjar, kerana operasi dilakukan tidak terputusputus dalam tempoh masa yang lama dan pada keadaan mantap menghasilkan produktiviti CGTase selama mana operasi diselenggarakan. Hasil yang diperolehi disokong dengan laporan Tonkova (1998) yang menyatakan produktiviti CGTase adalah 5-13 kali ganda lebih tinggi berbanding kultur kelompok. Jamuna et al.(1993), Abdel et al. (2000) dan Vassileva et al. (2005) juga melaporkan peningkatan produktiviti CGT ase berbanding kultur kelompok.

Pertumbuhan (O.D)

JADUAL

1. Perbandingan aktiviti dan produktiviti CGTase dalam kultur kelompok dan kultur selanjar dalam fermentor 2L Aktiviti CGTase U/ml (X) Masa Fasa Eksponen (jam) (Y) Produktiviti CGTase (U/ml/j) Z=(X/Y)

Sistem Pengkulturan

Kultur kelompok - 1 larian - 2 larian - 3 larian Kultur selanjar (Kesan masa tuai) - 12 jam - 24 jam - 48 jam

28.100 ± 0.068a 56.200 ± 0.068a 84.300 ± 0.068a

36b 72c 108d

0.78e 0.78e 0.78e

25.700 ± 0.075af 26.300 ± 0.052f 26.100 ± 0.140f

-

0.77g 0.79g 0.78g

Nota: a Andaikan jumlah aktiviti CGTase maksimum dalam kultur kelompok per larian ialah sama untuk setiap larian ialah 28.1 U/ml. b Pengiraan jumlah masa mula masuk inokulum sehingga capai aktiviti maksimum ialah 36 jam. c Meliputi jumlah masa untuk 1 larian ialah 36 jam di campur dengan masa capai aktiviti CGTase untuk larian ke-2 36 jam menjadi jumlah keseluruhan ialah 72 jam. d Meliputi jumlah masa untuk 2 larian kultur kelompok ialah 72 di campur dengan masa capai aktiviti iaitu 36 jam menjadi jumlah keseluruhan ialah 108 jam. e Pengiraan produktiviti tidak mengambil kira masa untuk penuaian, basuh dan steril fermenter serta penyediaan inokulum. f Purata aktiviti CGTase pada keadaan mantap dalam kulur selanjar. g Pengiraan produktiviti CGTase, kutur selanjar ialah R= DE , D = kadar pencairan (0.03 j-1), E = purata aktiviti CGTase pada keadaan mantap.

433

KESIMPULAN Peningkatan produktiviti CGTase berjaya dicapai dengan teknik kultur selanjar berbanding kultur kelompok apabila masa di antara larian kultur kelompok diambil kira untuk pengiraan larian ke-2 dan ke-3.
PENGHARGAAN

Penghargaan kepada Prof. Madya Dr. Rosli M Illias dari Universiti Teknologi Malaysia (UTM) atas ihsan penyediaan pencilan tempatan Bacillus sp. G1 dan kepada MOSTI atas pemberian geran IRPA.
RUJUKAN

Abdel-Naby, M.A. Rayad, R.M. & Abdel-Fattah, A.F. 2000. Biosynthesis of cyclodextrin glucanotransferase by immobilized Bacillus amyloliquefaciens in batch and continuous culture. Biochimical Engineering Journal 5: 1-9. Dobois, M. Gilles, L.A. Hamilton, J.K. Robers, P.A. & Smith F. 1956. Colormetric method for determanation of sugar and related substances. Analytical Chemistry 28: 350-356. Gawande, B.N. Singh, R.K. Chunhan, A.K. Goel, A. & Patkar, A. Y. 1998. Optimization of cyclodextrin glucanotransferase production from Bacillus firmus. Enzyme and Microbial Technology 22: 288-291. Hanan M. I., Wan M. W. Y., Aidil A.H., Rosli M.I., Othman H. & Othman O. 2005. Optimization of medium for the Production !-Cyclodextrin glucanotransferase using Central Composite Design (CCD). Process Biochemistry 40: 753-758. Horikoshi, K. 1979. Production and industrial application of cyclodextrin. Process Biochemistry: 26-30. Jamuna R., & Saswathi N., Sheela R. & Ramakrishna S.V. 1993. Synthesis of Cyclodextrin glucanotransferase by Bacillus cereus for the Production of Cyclodextrin. Applied Biochem. Biotechn. 43: 163-176. Kaneko, T. Kato, T. Nakamura, N. & Horikoshi, K. 1987. Spectrophotometric determination of cyclization activity of cyclodextrin-forming cyclomaltodextrin glucanotransferase. Journal of Japanese Society of Starch Science 34(1): 45-48.

Kunamneni, A. Prabhakar, T. Jyothi, B.& Ellaiah, P. 2007. Investigation of continuous culture cyclodextrin glucanotransferase producton by the algenate-immobilized cells of alkalofilik Bacillus sp. in an airlift reactor. Enzyme Microbial Technology 40: 1538-1542. Pirt, J.S. 1975. Principles of microbe and cell cultivation. New York: Black Well Scientific Publication. Rosso, A.M. Ferrarotti, S.A. Krymkiewicz, N. & Nudel, C. 2002. Optimisation of batch culture conditions for cyclodextrin glucanotransfease production from Bacillus circulans DF 9R. Microbial Cell Factories 1: 3-12. Szejtli J. 1997. Utilization of cyclodexstrin in industrial products and processes. Journal of Material Chemistry 7: 575-587. Tonkova A. 1998. Bacterial cycclodextrin glucotrasferase. Enzyme and Microbial Technology 22: 678-686. Vassileva, A. Burhan, N. Beschkov, V. Spasova, D. Radoevska, S. Ivanova, V. & Tonkova, A. 2003. Cyclodextrin glucanotransferase production by free and agar gel immobilized cell of Bacillus circulans ATCC 21783 in bioreactors. Process Biochemistry 38: 1585-1591. Vassileva, A. Beschkov, V. Ivanova, V. & Tonkova, A. 2005. Continuous cyclodextrin glucanotransferase production by free and immobilized cell of Bacillus circulans ATCC 21783 in bioreactors. Process Biochemistry 40: 3290-3295. Wan Mohtar W.Y., Hanan M.I., Aidil A. H., Rosli M. I. & Othman O. 2002. A potential New Isolate for ! -Cyclodextrin glucanotransferase production. Malaysian Journal of Biochemistry and Molecular Biology 7: 13-17.

Program Mikrobiologi Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi Fakulti Sains dan Teknologi Universiti Kebangsaan Malaysia 43600 Bangi, Selangor D.E. Malaysia Diserahkan : 12 April 2007 Diterima : 14 Disember 2007


								
To top