DNA extraction

Document Sample
DNA extraction Powered By Docstoc
					              r                  rus                                 tr            (WSSV)

               t

                      .

        s      t u t
   1.
                               l    ộ         ễ     ù d
      (White spot syndrome virus –WSSV) gây ra.                                                             :
Vỏ      ởp ầ ầ        ự                     ò            l                                                â .
T                 â            ỏ ậ , ầ          ị     â .T                                       ỏă
toàn, ơ ổ         p ờ        ề .       lâ l                ỉl
    100%          ò 3-5         . Đâ l         â     ề                                                     ề
nuôi tôm.
        â l          â                  (WSSV) trên tôm:
          Nhóm:     Nhóm 1 (dsDNA- ợ              )
          Họ:       Nimaviridae
          Chi:      Whispovirus
          Loài:     White spot Syndrome Baculovirus Complex

                               ợ p                    lầ       ầ ởĐ                   (1992) (Chen et
al),                       ề                 ầ                   ợ                  l ở T
(Huang et al). T p                lâ          ễ                H       ,            ậ     ,T        ,
I d          ,            Đ        ,              .               ă 1995,          Ho            p
               ờ     ợp      ễ         ,                            ở ề            T
          ị ậ                dị          .   H                 ,                   p
  ợ lâ           ễ .
       T V             ,                               ề   â
           ỉ                  ,T      T           H ,H T                     ,               .
                              l      l                ờ                                   l ộ         ở
l                    p               ề                               ở                 . Vì vậ ,
                      ề          SSV l        ầ                                  p ò
trên tôm.
       H                   ề p ơ             p p                         ị         ầ             ,
p ơ p p                 l    ộ p ơ           p p               ề ,
     .
       2.




                                                  1
                                           ẩ     ị




                                  Hò


                                  ỏp             , polysaccharide


                                       T




                                       Đ          d




1. H        l           :
Lysis buffer                           TE 1X
 ồ
2. Ly trích DNA:
                    ự             ồ        5-6            ờ.
                             â                                 ợ l                   tôm nghi
  ờ có         .            ợ l        2                             .                 ự
    sau:
     V            d
       ù          pl       ộ           d                                           pd f,
            õ               p ầ       ằ                              . Tổ       ộ   l 6     ,
                        6      pd f.
       ỏ                        pd f,                                      l          ề
                        30 , ự       2 lầ .



                                                      2
 Cho 1ml d          dị l            vào              pd f             .
   dị l              p                          ò an DNA.
 Ủ 10 p ú ở               ộp ò .                l           ờ            d
   dị            ò            .
 Đ      l â                 ộ ở          ộ 13200 ò /p ú              5p ú
              ợ              ỏ         .                                      .
   T      d      dị            l tâm ra các         pd f        .
 T                      0.5 l ồ                                  .
 Đ      l â           ậ        12000 ò /p ú              5p ú,            l
             . Đổ ỏ p ầ d         dị .
 C     1 l ồ                            ồ l â ở ậ            12000 ò /p ú
   trong 2 p ú                        ( ự          2 lầ ). (           màu ỏ
           l                      ,l          ởp                   .T       ờ
     ợp        ầ          ề ơ .
 S                 ở          ộp ò               5p ú        l         ồ
     ơ.
T                l         ằ d        dị TE ff (tris-HCl EDTA) : cho
   100 µl TE                    ,          ở    l . TE ff l d              dị
          ổ ị pH                                     ợ       ơ ,
                       ằ                               ằ TE.
                    ợ        ợ dù                                   .




                                    3
             tr

                  t
                      ộ                            .       ị                        l   p
                          .
                                          ị                         ợ dù       ,v
                                          p            .
         s        t u t
1. Xác ị            ồ   ộ         :
                  ị   ồ       ộ       l     ề ầ
     p                                    ọ p â .
        Thí d :
-S l ợ                l ợ                                 ở
vì ộ l ợ               d                           ự
      .
-         ợ ồ         ộ           dễ d                        l ợ     ầ d
l       z                                  .
        T           ờ 1           z              ợ 1µ                         .
2/ Đo qu       p ổ:
                          (                    ề     p               p      , p     l,
agarose...)              d             p ổ              ị      ồ    ộ dự        ộ p
        UV.
      Đ         ị     ồ     ộ                ọ                 260 nm, hay RNA (hay
p       )       ọ              280      .
      Ở                260            p ép             ợ ồ         ộ        d    l
           .
      V       â                                      ộ       l d       .Đ        ồ
  ộ        d      l                   dự                   :
      1 O. ở 260                   ợ              = 50 /µl
      1 O. ở 280                         = 40 /µl
      Tỷ l O 260 / OD280 1.7 – 2.0
        ự          ỷl               ,                                ỷl
    d       ộ                 l ợ              ị      .
                          ồ    ộ              l : OD260 * 50 /µl * ộ p l           .

1.       l
         Pha loãng 10 lầ : 90 µl              + 10 µl d        dị          .



                                               4
         Đ    ẵ     ầ        e    ú p                          (                  ầ
cone).
     Đ l d              l        ộ ề                       d   dị .
     V               ,        l 2 lầ       . Tổ            ộ    6 2=12             .
2. Đ O
  ậ ú     ở ộ
        ù d      dị
        ù     H2O       l      .       ú l                 l           ờ         ẩ .
        ù        pp     ú                    ,             ú    dS         pl      ọ
      .                lầ l ợ          :
           +K        ở            260 nm
           +         ở            280 nm
           + Tỉ l 260/280 :              ộ                                (ỉ l    ợ
              p ậ : 1.7 - 2.0)
           + Tỉ l 280/260
       :

          u          t qu           t qu
                                                 OD260/280         OD280/260
      u            OD260          OD280
   4a1            - 0.3000       -0.3000            1.0              1.0
   4b1            0.0932         0.0394           2.3651            0.4228
   4c1            0.0567         0.0618           3.3715            0.2966
   4d1             -0.12         -0.1515          0.7921            1.2624
   4e1            0.0862         0.0348            2.476            0.4039
   4f1            0.0904         0.0464           1.9474            0.5135
   4a2            0.0045            0                ∞                0
   4b2            0.0054         0.0012           4.5135            0.2216
   4c2            0.0144         0.0061           2.3666            0.4225
   4d2            0.0336         0.0118           2.8565            0.3501
   4e2            0.0238         0.0137           1.7423            0.5740
   4f2            0.0485         0.0256           1.8932            0.5282

  ậ      é          :
                        , ỷl O   260/OD280     1.7-2.0


                                           5
                                  ú       : 4f1, 4e2 , 4f2
      T               ,                     ợ ồ          ộ         ở3                l         p
  ậ       ợ :
                                           OD260                    ồ     ộ          (ng/µl)
           4f1                             0.0904                             45.2
           4e2                             0.0238                             11.9
           4f2                             0.0485                            24.25

                                                         d :
     T            ự           :       d                pp          ú l
   ,l            ờ        ẩ                   ú
            l     p                          , p               d
                 ở                     .
     + Tỉ l O 260/OD280           < 1.8 :                                , ị    ễ        p
    p       ,p     l ,             l                       ú
     + Tỉ l O 260/OD280            > 2 :               ị       ễ    ề    p                     ,
protein, chloroform.




                                                   6
                       u                 v                           v rus tro                      t
                                     o                          tr
                   t
             ù     p       ơ       p p                                                          .

         s        t u t
1.       ơ      p p        :
              ơ p p          ị                             ự         d                        ú                            dự
vào              ậ PCR (polymer                                      ) ổ                   . Đâ l                            ậ
                 p â                                       â           dự
             l       p:
             1.                ợ
             2.         ồ (p    )
             3. é d                                        .
         T                                       l ợ                 ă                 l                ,                 p ẩ
                    l                                      .S        p ẩ                                     l
                   ằ                2            ồ                     (           ị
     ợ    ).     ộ p                                 ầ 20-30                                                p ẩ
         p                                              ộ      d      d .
         Ở â                   â                              ợ p       ằ                                        ậ
             d        p                  ồ                   V 26 V 28.
         T   p ầ                             d              p ơ p p      :
            BiH2O: l                                     ,                                                      ,
                               ,                      ,
                  ff 9: l d          dị                                                        T   -HCl, KCl,
                       l2,    ờ p          ộ     l                                 p l                   d .
                   ff                â ằ pH ò                                                   l2 úp      l
                     d T               p l           l                         ă                  ă
                  ồ.
              d T :l                   l d ự d dù                                 ổ            ợp
                                                   p                   p            (                             p ă
               l ợ ).
                 ồ V 26        V 28           ò                           ọ                                p
                      , l                    , ợ                           â                         ỏ                18-25
                     l d            ồ      ộ ồ                             ộ                ồ               ợ ,
               d          ú           p        dâ                       ề ổ                     ợp                    ,     úp
                   ậ             p ầ         ầ    ợ                    â l                       ậ                ị
                 ầ          .


                                                       7
                           +      ồ             :
         ồ xu    VP26F: 5’ GG               TTTGG                 T                       TG 3’
         ồ      ượ              R: 5’ GGG TGTG                 GGT G TG                 3’

                           +      ồ         8:
         ồ xu             8F: 5′ GG T T                  G TT (               T)6 T           TG G T TT T T TT 3′
         ồ      ượ             8R: 5′       TG G T TT                         T GG T T                G TG 3′

                  Taq là enzyme DNA polymerase có                                                ă        ị           , ú
                                     d T                                                                   ổ          ợp.
                             l           ầ                                                                ởd            ợ ơ
                         ợ ép.

    2.                                  ộ
                           3                             (30              )
                                   :


         ộ
                     94           94
  (oC)
                     3’           0:30                                            72              72
Thời gian
(phút:giây)                                         49                        1:05                7:00

                                                     0:30
                                                                                                                             4


             G            ọ                 :               ộ ă       l       94-96o              ỏ       2-3 phút, lúc này
    2 ợ                    .
                           ự
         G               p: S      2 ợ                                                        ,            ộ      ợ              p
           45-60°        ồ                                                    ợ                   ơ                              ổ
    sung, ờ          1-2 phút.
         G          é d :         ộ ợ                                     â       l    72 o                p l
      p         ựd       ợ      .T ờ                                                              (              ỏ, ổ       2 lầ
      o
    72 l      ỏ    8 p ú ). S                                                                         ộ   ợ                  4oC
            ú       ình.
    =>          ự             p                                                         ợ 230             l ợ           .




                                                                  8
         3. Đ          d                             l:
             .G                     :            d        l               ơ p pl p       d   dù
         ờ                              l    d                            200 p – 50kbp.
             .                          ( pd                        V 26 V 28):
                   l                                              ộ l         ,          ú ù      ợp
p l              ẳ .H                                                   ề l                     p â
                                ,                     l                      ở        ộ    p    :l w
melting agarose,        p
     Đổ l            ầ ằ                                                                        d        dị
 ợp                                                           ồ            ổ                         ộ            ờ       l             .
        ,                                                          l                                          l           ộ
 ồ    ộ               d                        dị                 .
            ằ                                        ờ                           ờ pH=7,                                           â
          ề       d . Vậ                                               ă       p â l                 p                ộ
              :
                         :                    p â                                         l     d                         â        ơ
( ầ ơ )            p â                           ỏ.
       ồ        ộ        :                     ù                                              p â                                   ọ
 ồ    ộ p ù ợp. ồ                              ộ                       ,                                 ỏ.

                                                                                                (ợ       ẳ )p â
         ồ       ộ                          (% w/ )
                                                                           (kb)
      0.3                                                                  5 – 60
      0.6                                                                  1 – 20
      0.7                                                                  0.8 – 10
      0.9                                                                  0.5 – 7
      1.2                                                                  0.4 – 6
      1.5                                                                  0.2 – 3
      2                                                                    0.1 – 2

                   ú                    :        ù                                    ù       ú (                             , ò
             ẳ )                            ộd                                                . Đề                                  l
     ộ         d            l ợ E d
                           dị                                                             d :ở1 ề                                   ú
                       ơ     ú ẳ ,ở ề                                                                     ợ l .
             ờ   ộ dò     : ộp â l                                                    l                                   ờ            ộ
dò             ă      . ờ   ộ dò                                                          ợ l        ơ 5 l/                    (
                       2    ự .)


                                                                           9
            ề             ờ : p â                               l      ơ 50 – 100 p                         d
            ù   ậ            ề          ờ                             ổ,     ờ   ợp
p          d   p l d-field gel electrogoresis.
    T         p ầ                     ộ: ờ                          ợp ồ         ộ                   p ơ
                           o
5% p                d ở4 ,                                          p ầ                               ở
    ự             ộ                      .
    E       d         d (E ):           ở                           15% ậ
 ẳ .
                dị                       d:           ở                 l. ồ    ộd                     dị
                         l       l                                   .T E      d                         d
    ề                        l       ỏ            ự        â        ự ề      ở   d                        d
    ở           d .


    1.                       ù       V 26

             Đầ                     p                                    :

                         ồ           ộ T                   1   ýp         T                   12     ýp
H
                                       (μl)                               (μl)
BiH2O                                  19                                 228
Buffer 9                10 X           2.5                                30
dNTPs                   200 µM         1                                  12
VP26F                   25 µM          0.5                                6
VP26R                   25 µM          0.5                                6
Taq                     5U             0.25                               3
Tổ                                     23.75                              285

     S                  ộ   ằ
                             ề
           ề         ợp      12 ú p ( 23.5 μl                                ú p),                ú p
                             d ơ l                                                        ẩ        ị ẵ .
     Sau khi chia thành 11 tuýp thì ú
        ýp         tích là 2.5/2=1.25 μl.
     Đ              ú p               ,     ầ                                   .
     Sau k                              ,                                           ợ                     d.

                d        l
    a- Đổ           l                d
                        p   p            ổ   l   l ợ ,         ơ     ă       p ẳ     .

                                                      10
       â 0.6                                     p ậ ,                 ợp TE
       vào.
      Đ                    lò       ,        ú    ff   (1’30”), d      dị    ở
                              , ợ lò                       ,l         .
      Đ                            , ợ       ộ     ( ò             o
                                                                  60 )        ở
           p, ẩ           ậ       1l E         ,l     ề (                   ờ
                  ,       ỉ ầ         ổ       ồ       ò       ò              ).
      Đổ ẩ           ậ                      d            l                d
                  ọ         . G l               30 p ú
                                    .
-          d
     Đ      l            d.
              l ợ ,         l        l.
     T      dd      d p          l1
       ù           pp     ễ 10 ọ        ff (        l :               p     l,
      xylen cyenon, glyceron)
       ù           pp l 3          l                  ộ                     ọ
            ồ            l d      .    úý         ọ        ò
        ọ uffer.
     T            l d    : ỏ                ầ          l d,
      l d                         p
                p l                             d ơ .T                     l d
           l dd               ỏ     lú ầ .
              lở               90V        120 p ú . T ờ
                 p           ợp             d, l dd                     õ ràng,
      và                    d                       ỏ




                                        11
    ự                    :
                         d ơ                         300bp
        7                                d       ơ                                         d ơ      ,    l
                 .
                                                     d   ơ                ,                     ễ            . Tuy
            ,ở               d       100 p                            ợ            d                          l d
        p        ự               p                       ú        p                ự        p            ồ
         ồ       ợ                           p           d

2.                       ù     V 28
                             ơ   ự ở V 26,                                         ề                p

                         ồ               ộ T                          1       ýp   T                10   ýp
H
                                           (μl)                                    (μl)
BiH2O                                      19                                      190
Buffer 9             10 X                  2.5                                     25
dNTPs                200 µM                1                                       10
VP26F                25 µM                 0.5                                     5
VP26R                25 µM                 0.5                                     5
Taq                  5U                    0.25                                    2.5
Tổ                                         23.75                                   237.5

            S        p               ,               ộ       ýp

                                                              12
   S                  ợp       10    ýp,           ýp   l   23.5 μl
   ợp
   Trong 10 tuýp, thì 9 tuýp ầ             d                        ,
ýp           d              p ò                l            d ơ .
   Sau khi chia thành 9 tuýp thì     ú
ýp        tích là 2.5/2=1.25 μl.

      :




                                    13

				
DOCUMENT INFO