Docstoc

Disease prevention in laboratory animals_ hygienic

Document Sample
Disease prevention in laboratory animals_ hygienic Powered By Docstoc
					Disease prevention in laboratory 
           animals:

hygienic measures, containment facilities 
         and health monitoring

                Prof. Dr. Ir. F. Van Immerseel

      Ghent University, Faculty of Veterinary Medicine,
      Dept. Pathology, Bacteriology and Avian Diseases

               Filip.vanimmerseel@Ugent.be
     What are good data?
A. Low variation




                   B. High variation
     What are good data?
A. Low variation   Conclusive




                                             Inconclusive



                         B. High variation
     What are good data?
A. Low variation
                            Solution:
                        1. More animals?
                      2. Refining the trial?




                   B. High variation
     What are good data?
                       Standardization of
A. Low variation     environmental factors

                            Solution:
                        1. More animals?
                      2. Refining the trial?




                   B. High variation
What can we standardize?



                      STANDARDIZE 
                             =
                           REFINE 
                            AND 
                           REDUCE
    Why do we need to prevent infectious 
                diseases?
• Clinical disease and mortality, animal welfare

• Interference with experimental results

• Quality of biological products

• Zoonoses
Importance of prevention infectious diseases
                Clinical disease and mortality, animal welfare
•   Ethical aspects 
•   Clinical disease mostly caused by gastro-intestinal and respiratory 
    infections 
•   Most infections do not lead to clinical symptoms
     – Subclinical infections
     – Carrier animals
Importance of prevention infectious diseases
                   Interference with experimental results

•   Importance of subclinical infections/carriers 

•   Subclinical infections : not always detected, can lead to false 
    conclusions

•   Interference at different levels :
     –   Immunomodulation
     –   Physiological modulation
     –   Interference with reproduction
     –   Competition between micro-organisms
     –   Modulation of oncogenesis
Importance of prevention infectious diseases
                    Quality of biological products

•   Contamination of tissue samples, transplantable tumours, cells, sera 
    ....
•   Effects on in vitro trials
•   Spread of agents
•   Mostly viruses
•   Mycoplasma spp.
    Importance of prevention infectious diseases
                              Zoonoses

•   Risk of transmission of certain agents to humans
•   Examples : Salmonella, Helicobacter, Streptobacillus monoliformis, 
    ...
Importance of prevention infectious diseases

•   Clinical disease and mortality, animal welfare
•   Interference with experimental results
•   Quality of biological products
•   Zoonoses




                      IMPORTANT TO :
                      PREVENT, MONITOR, CONTROL !!!
  Prevention and control of bacterial infections in 
     laboratory animal colonies - Importance

• Importance of pathogen ?

• Spreading ? Virulent ? Important for experiments ?

• Need to eradicate ? Kill all animals ?

• What about neighbouring colonies ? 

• Only containment and desinfection ?
    Prevention and control of bacterial infections in 
              laboratory animal colonies
•   Introduction of non-contaminated animals

•   Eradication methods

•   Containment facilities

•   Hygienic measures

•   Antibiotics

•   Vaccination

•   Other control measures
       Introduction of non-contaminated animals

•   Suppliers should supply health report
     – Commercial manufacturers (Charles River, Harlan, Jackson, …)
     – Conventional livestock animals ??
     – Transgenic animals ?? Universities ??
         Introduction of non-contaminated animals

•   Suppliers should supply health report

     – Commercial manufacturers (Charles River, Harlan, Jackson, …)
     – Conventional livestock animals ??
     – Transgenic animals ?? Universities ??


•    In case of ‘unsafe’ suppliers :

     –   Quarantaine, barrier systems
     –   Sentinel animals
     –   Small units with separate entry/exit, staff …
     –   Rederivation 
            Eradication methods - Rederivation

•   Aiming to :

     – produce animals free of hazardous infection
     – Produce uninfected breeding animals for upstart of a colony
                       Rederivation - Caesarian section

   •    Offspring removed from uterus by sterile techniques will be free of 
        infection, except transplacental infections
Pregnant animal       hysterectomy           in isolator/barrier             foster mother
                             caesarian section                                                   by hand       
              Rederivation - Caesarian section

•   Time-mating : exact date of expected birth needs to be know to plan 
    future steps of the rederivation procedure

     – Synchronization of cycle :

         • Rabbits : ovulation induced by mating
         • Rodents more difficult to synchronize : placing males and females in same 
           cage with grid in between, then mate at day 3
         • Try to identify pro-estrus by vaginal smear


     – female mouse given 24 hrs with male

     – Remove male

     – Check for vaginal plug or sperm in vaginal smear
           Rederivation - Caesarian section




The  female on the left is in estrus:  note the swelling around the top of 
the vagina and the presence of a small opening as well as the bright red 
color.  
                                     approximately equal 
                                     numbers of large 
                                     cornified epithelial 
                                     cells and leukocytes


leukocytes




large, cornified (without nuclei) 
squamous-type epithelial cells
            Rederivation - Caesarian section




 If checking females for timed pregnancy, the presence of a plug in the 
     vaginal opening indicates that the female has mated and may be 
                                 pregnant.
The plug is usually waxy white to yellow in color.  It may also be clear (if it 
                        is new) or difficult to see. 
Rederivation - Caesarian section




   The gestation time for a mouse is 18-21 days.  
A pregnant female has characteristically bulgy sides 
              Rederivation - Caesarian section

•   3 days before expected birth : 

     – treat mother with medroxyprogesteron 
     – Unable to give natural birth, avoids spontaneous birth


•   The closer the date of section to birth, the higher the success rate

•   Euthanize for caesarian section, not under anaesthesia

     – Uterine blood supply still foreseen for 15 min
              Rederivation - Caesarian section

•   Place puppies with foster mother, whose offspring has been 
    removed

•   Highest success rate : between 2 and 10 days after birth of own 
    puppies

•   Before putting puppies with mother : scrub and heat
     – Pale, cold puppies can be cannibalized
             Rederivation - Caesarian section

•   Health monitoring of puppies : at  8 weeks

•   Sacrifice foster mother and some puppies
                       Rederivation – Embryo transfer
   •    Advantage : embryo’s can be frozen in liquid nitrogen
   •    Is a must for production of transgenic animals
   •    Disadvantage : specialized equipment needed
Pregnant animal       embryo collection       embryotransfer
                                                         to pseudopregnant animals
                Rederivation – Embryo transfer

•   Superovulated females after hormonal treatment (PMSG followed by 
    hCG 48 hrs later)

•   Mating 

•   Embryo sampling 

    –   Euthanasia
    –   Isolation from salpinx, 36 hrs post-mating (two-cell stages)
    –   Salpinx in isolation medium and flushed
    –   Frozen in straws (with cryoprotectant) : vitrification
                Rederivation – Embryo transfer

•   Superovulated females after hormonal treatment (PMSG followed by 
    hCG 48 hrs later)

•   Mating 

•   Embryo sampling 

    –   Euthanasia
    –   Isolation from salpinx, 36 hrs post-mating (two-cell stages)
    –   Salpinx in isolation medium and flushed
    –   Frozen in cryostat, slowly reducing T° (better survival)
                Rederivation – Embryo transfer

•   Superovulated females after hormonal treatment (PMSG followed by 
    hCG 48 hrs later)

•   Mating 

•   Embryo sampling 

    –   Euthanasia
    –   Isolation from salpinx, 36 hrs post-mating (two-cell stages)
    –   Salpinx in isolation medium and flushed
    –   Frozen in liquid nitrogen
    –   Thawing : at 37°C
              Rederivation – Embryo transfer

•   Mating of recipient mother with vasectomized male : induction of 
    pseudopregnancy

•   Synchronization of culture of embryos and mating

•   Anaesthesia recipient, embryos placed in salpinx

•   Pregnancy, birth, monitoring
Rederivation – Embryo transfer
Rederivation – Embryo transfer
 Commercial embryo transfer -Time schedule 




               http://jaxservices.jax.org/breeding/rederivation.html
                      Containment facilities

•   Barrier housing

•   Cubicles and filter cabinets

•   Filter-top cages and individually ventilated cage systems (IVC)

•   Isolators
                               Barrier housing

•   Protection of animals vs protection of personnel 

•   Decontamination of staff, materials and air entering the units !!

•   Materials, feed, ... : chemical decontamination or autoclaving at entry

•   Staff : 
     – no contact with animals of same species 48hrs before entry
     – Breeding units : showering; Experimental units : change clothes
     – Masks, gloves

•   Animals : entry after health monitoring

•   Air : inlet filtered, overpressure
                                Barrier housing

•   Barrier-housed animals should be ~ SPF

•   Entry of animals of ‘unsafe’ origin : containment in opposite direction

     –   Underpressure
     –   Showering at exit
     –   Filtering air leaving facility
     –   ...
                   Cubicles and filter cabinets

•   Animals can be placed behind a glass wall in a number of built-in 
    boxes containing a limited number of cages : ‘cubicles’

•   Stationary !

•   Ventilation inlet and outlet for each cubicle

•   Minimizes spread of infections and allergens
                  Cubicles and filter cabinets

•   Closed cabinet supplied with own ventilation motor (or individually 
    plugged in on central ventilation) : ‘filter cabinets’

•   Transportable !

•   Minimizes spread of infections and allergens
    Filter-top cages and individually ventilated cage 
                     systems (IVC)
•   Barrier around the individual cage

•   Even within barrier unit to enhance protection of individual animal

•   Filter-top cage : lid on cage with filter to allow air passage

•   Be aware of elevation of concentration of gases in cage !

•   Individually ventilated cage : each filter-topped cage has own 
    ventilation (all cages isolated from surroundings and other cages)

•   Special systems to run at positive or negative pressure exist
                                Isolators

•   ‘Isolators’ : fully closed systems in which animals are only handled 
    through gloves thightly sealed to the isolator wall

•   Needed when full knowledge of the microbiota of the animals is 
    required

•   HEPA filtered air, incoming materials and feed decontaminated

•   Water-lock for air outlet

•   Positive pressure (protection of animals)

•   Possibility to keep animals germ-free
              Cessation of breeding - Burnout

•   For viruses, not for bacteria
•   Stop introducing naïve animals for some weeks (mostly 6 weeks) 
    and stop breeding

•   Priniciple : if the whole population is infected and develops 
    protective immunity, the infection will be eliminated anyway
                          Stamping out

•   Removal of infected animals from a colony
                              Antibiotics

•   If used in experimental groups : take care of effect on animals itself

•   Can induce non-detectable carriers
                             Vaccination

•   Can interfere with research

•   Vaccination of breeding units and maternal antibodies ?

•   Passive immunization ?

•   Immunization can yield clinical symptoms (attenuated vaccines)

•   Desirable for conventional livestock animals in research ?
                  General aspects of hygiene

•   Construction of building – one direction traffic – dirty/clean
•   Make people aware of biosecurity
•   Cleaning – desinfection materials, cages, floors, …
•   Hygiene personnel (showering, clothes, …)
•   Desinfection or sterilization feed/water, …
•   Compartimentalization SPF – germ-free – conventional
•   Under- or overpressure in isolation units ?
                  General aspects of hygiene

•   Construction of building – one direction traffic – dirty/clean
•   Make people aware of biosecurity
•   Cleaning – desinfection materials, cages, floors, …
•   Hygiene personnel (showering, clothes, …)
•   Desinfection or sterilization feed/water, …
•   Compartimentalization SPF – germ-free – conventional
•   Under- or overpressure in isolation units ?
In- en uitgangscontrole
                  General aspects of hygiene

•   Construction of building – one direction traffic – dirty/clean
•   Make people aware of biosecurity
•   Cleaning – desinfection materials, cages, floors, …
•   Hygiene personnel (showering, clothes, …)
•   Desinfection or sterilization feed/water, …
•   Compartimentalization SPF – germ-free – conventional
•   Under- or overpressure in isolation units ?
           Wat is the ideal desinfectant ?

•   Broad spectrum
•   Fast working
•   Not sensitive to environmental factors
•   Not toxic
•   Not corrosive
•   Penetrating
•   Stable in pure and dissolved form
•   Soluble, and not inactivated by hard water 
•   Not staining
•   No odour
•   Easy to use
•   Cheap
          Types chemical desinfectants

• Many types

  –   Chemical structure
  –   Aim
  –   Activity: spectrum, mechanism of action
  –   Toxicity
  –   ...
Health monitoring
                          Health monitoring

•   Part of quality assurance : process and product quality monitoring

•   Used for microbiological standardization of animals

•   Aims to produce animals that meet preset requirements of microbiological 
    quality

•   Aid in maintenance of microbiological quality during experiments (e.g. 
    checking control measures, barriers)

•   Keep animals suitable for the experiments
                         Health monitoring

•   Actual practice of health monitoring can be adapted due to :

     – Research objectives
     – Local prevalence of specific agents
     – Regulations or national monitoring recommendations
 FELASA recommendations for health 
monitoring of rodent and rabbit colonies in 
    breeding and experimental units
            Monitoring frequency / sample size

•   Monitoring of colonies at least quarterly

•   In addition : necropsy of diseased/death animals

•   Units containing different rooms / species ? 

•   More frequent monitoring may be needed
          Monitoring frequency / sample size

Factors increasing risk of introducing agents in facility and thus require 
more frequent monitoring :

    •   Multipurpose units with various kinds of experiments

    •   Frequent introduction of animals 

    •   Frequent entry of personnel in addition to animal care personnel

    •   Frequent change of personnel working in unit

    •   Introduction of animals from different breeders

    •   Infected animals on-site
                 Monitoring frequency / sample size

•     To detect a single infected animal in a population at a certain 
      confidence level : 
       – Number of animals to be sampled is inversely proportional to the log N


                         Log 0.05 / logN = sample size
                         N : percentage of non-infected animals




    Assumptions : 1. both sexes infected at same rate
                        2. population size more than 100 animals
                             3. Random sampling
                        4. Random distribution of infection
             Monitoring frequency / sample size




Diseases with a high infection rate require less animals to be sampled to detect 
their presence than diseases with low infection rates !
             Monitoring frequency / sample size

•   Sample size of at least 10 animals per unit is recommended

•   Cost of sampling size vs detection rate (false negative result if 
    taking not enough samples)

•   Detection rate depends on test method

     – E.g. serology vs direct plating
           Monitoring frequency / sample size

•   What about expensive animals ? Small groups ?

•   What about immunosuppressed animals and serology ?




                    Increase sampling frequency


               Environmental or non-invasive sampling


              Sampling without killing (swabs, blood, …)
           Monitoring frequency / sample size

•   What about expensive animals ? Small groups ?

•   What about immunosuppressed animals and serology ?




                          Sentinel animals !

                 • Should be free from tested agents
         • In case of immunosuppressed animals, danger for 
                        opportunistic pathogens 
          • In same cage ? Separate using dirty bedding ? …
                           •Distribution ?
           Monitoring frequency / sample size

•   Sample size dependent of housing type 
                             Test laboratories

•   In diagnostic laboratories

•   Quality systems should be followed

     – Detailed written procedures

     – Testing in compliance with ISO 9000 norms

     – Accrediation of diagnostic labs according to ISO 17025

         • Special attention to staff competency (e.g. interpretation of results)
         • Partcipation in inter-laboratory testing programmes
       Agents to be monitored
MICE                            RATS




               HAMSTER
                     Agents to be monitored

•   Additional agents to be monitored :

     – When associated with lesions

     – When associated with clinical signs

     – when using immunodeficient animals

     – In case of evidence of drop in breeding performance or perturbation of 
       physiological parameters
                     Sampling procedures 

•   Work planning

•   Euthanasia

•   Blood sampling

•   Necropsy

•   Organ sampling
                            Work planning

•   Bacteriological analysis requires multiple days
•   Various steps involved (e.g. plating, purifying, identifying)
•   Need different growth media 
                     Sampling procedures 

•   Work planning

•   Euthanasia

•   Blood sampling

•   Necropsy

•   Organ sampling
                          Organ sampling

•   Wich agents do you expect ?

•   Healthy vs diseased animals : choice of organs

•   Send samples to diagnostic lab ?

    –   Organs : cooled (frozen (?))
    –   Swabs in transport medium
    –   Faeces cooled
    –   Serum samples  frozen of cooled
                        Detection methods

•   Direct methods : detection of agent or part of agent

•   Indirect methods : indirect proof of presence of pathogen (a.g. 
    antibodies)
                         Detection methods

•   Direct methods : detection of agent or part of agent

•   Indirect methods : indirect proof of presence of pathogen (a.g. 
    antibodies)


Ø Virology : 
     § Serology : ELISA, IFA(, HI)
Ø Bacteriology :
     • Culture, serology, molecular methods
Ø Parasitology :
     • Microscopic examination, serology
                       Reporting test results

•   FELASA health monitoring report :

    – Unit designation and description
    – Identification of all species and strains present
    – Date of issue of the report
Reporting test results
                        Reporting test results

•   FELASA health monitoring report :

    –   All agents for which monitoring is required
    –   Date of latest investigation
    –   Result of latest investigation
    –   Name of testing laboratory
    –   Test method used
    –   Cumulative result of latest 18 months
Reporting test results
                      Reporting test results

•   Meaning of negative result :

     – Not been demonstrated by the applied method
     – Does not necessarily reflect group status


•   Present : identified in at least 1 animal in group

•   Eradicated : after last positive results no detection anymore during 
    18 months (6 test intervals)
Biosafety in laboratory animal 
           facilities:

 Risks groups, biosafety levels and 
         working practices

             Prof. Dr. Ir. F. Van Immerseel

   Ghent University, Faculty of Veterinary Medicine,
   Dept. Pathology, Bacteriology and Avian Diseases

            Filip.vanimmerseel@Ugent.be
             Classification of micro-organisms

•   Countries should classify micro-organisms based on :

    – Pathogenicity of the organism.

    – Mode of transmission and host range of the organism. 

    – Local availability of effective preventive measures. 

    – Local availability of effective treatment. 
                Classification of micro-organisms

•   Risk Group 1 (no or low individual and community risk)
     – A microorganism that is unlikely to cause human or animal disease.

•   Risk Group 2 (moderate individual risk, low community risk)
     – A  pathogen  that  can  cause  human  or  animal  disease  but  is  unlikely  to  be  a 
       serious  hazard  to  laboratory  workers,  the  community,  livestock  or  the 
       environment.  Laboratory  exposures  may  cause  serious  infection,  but  effective 
       treatment  and  preventive  measures  are  available  and  the  risk  of  spread  of 
       infection is limited.

•   Risk Group 3 (high individual risk, low community risk)
     – A  pathogen  that  usually  causes  serious  human  or  animal  disease  but  does  not 
       ordinarily spread from one infected individual to another. Effective treatment and 
       preventive measures are available.

•   Risk Group 4 (high individual and community risk)
     – A  pathogen  that  usually  causes  serious  human  or  animal  disease  and  that  can 
       be  readily  transmitted  from  one  individual  to  another,  directly  or  indirectly. 
       Effective treatment and preventive measures are not usually available.


                                                                      http://www.biosafety.be/
    Classification of laboratories in biosafety levels

•   Based on agents used in the laboratory

•   Must be based on professional risk assessment

•   Risk group ≠ biosafety level !!!!
               Microbiological risk assessment

•   Used to classify labs into biosafety levels, based on organisms
•   Performed by professionals, familiar with the organisms, equipment, 
    animal  models,  procedures, facilities,  ...  (lab  director, principal 
    investigator, ...)
                Microbiological risk assessment
                         Factors to be considered :
•   Pathogenicity of the agent and infectious dose

•   Potential outcome of exposure

•   Natural route of infection

•   Other routes of infection, resulting from laboratory manipulations 
    (parenteral, airborne, ingestion)

•   Stability of the agent in the environment

•   Concentration of the agent and volume of concentrated material to be 
    manipulated

•   Presence of a suitable host (human or animal)

•   Information available from animal studies and reports of laboratory-acquired
    infections or clinical reports
                Microbiological risk assessment
                         Factors to be considered :

•   Laboratory activity planned (sonication, aerosolization, centrifugation, etc.)

•   Any genetic manipulation of the organism that may extend the host range of 
    the agent or alter the agent’s sensitivity to known, effective treatment 
    regimens 

•   Local availability of effective prophylaxis or therapeutic interventions.
Classification of laboratories in biosafety levels
Biosafety level requirements
                      Laboratory animal facilities

•   Designated in Biosafety Levels according to risk assessment and the risk 
    group of the microorganisms

•   With respect to the agents :

     –   Normal route of transmission
     –   Volumes and concentration to be used
     –   Route of inoculation
     –   Whether and by what route the agents are excreted

•   With respect to the animals :

     –   Nature of animals, i.e. aggresiveness and tendency to bite and scratch
     –   Natural ecto- and endoparasites
     –   Zoonotic diseases to which they are susceptible
     –   Possible dissemination of allergens
Laboratory animal facilities
             Animal Facility – Biosafety Level 1

•   Suitable for : 

     – maintenance of most animal species
     – Animals that are deliberately inoculated with Risk Group 1 agents


•   Animal facility director must establish policies, procedures, protocols

•   Medical surveillance programme

•   Safety and operation manual  
            Animal Facility – Biosafety Level 2

•   Suitable for work with animals deliberately inoculated with Risk 
    Group 2 microorganisms
           Animal Facility – Biosafety Level 2
                  Safety precautions
•   Biohazard warning signs on doors
           Animal Facility – Biosafety Level 2
                  Safety precautions
•   Biohazard warning signs on doors

•   Facility designed for easy cleaning and housekeeping

•   Doors open inwards, self-closing
            Animal Facility – Biosafety Level 2
                   Safety precautions
•   Biohazard warning signs on doors

•   Facility designed for easy cleaning and housekeeping

•   Doors open inwards, self-closing

•   Adequate heating, lighting, ventilation

•   Inward airflow, exhaust not recirculated

•   Restricted access

•   No animals admitted for other than experimental use
            Animal Facility – Biosafety Level 2
                   Safety precautions
8.   Arthropod and rodent control programme

9.   Windows, if present, secure, break-resistant

10. BSC I or II, or isolator cages foreseen

11. Autoclave on-site

12. Bedding removed in a manner that minimizes generation of 
    aerosol and dust

13. Waste materials and bedding decontaminated before disposal
            Animal Facility – Biosafety Level 2
                   Safety precautions
14.   Sharps collected in containers

15.   Safe transport of waste to autoclave, in closed containers

16.   Animal cages decontaminated after use

17.   Animal carcasses incinerated

18.   Protective clothing must be worn, removed on leaving

19.   Hand-wash facilities foreseen
            Animal Facility – Biosafety Level 2
                   Safety precautions
20.   All injuries recorded and treated

21.   No eating, drinking

22.   Appropriate training 
            Animal Facility – Biosafety Level 3

•   Suitable for work with animals deliberately inoculated with Risk 
    Group 3 microorganisms, or when indicated by risk assessment
          Animal Facility – Biosafety Level 3
                 Safety precautions
•   Access strictly controlled

•   Facility separated from other lab and animal house areas by a 
    double-door anteroom

•   Hand-washing facilities in anteroom

•   Showers in anteroom

•   Exhaust air through HEPA filters 

•   Autoclave in animal house 
            Animal Facility – Biosafety Level 3
                   Safety precautions
7.    Infectious waste autoclaved before movement to other areas of 
      the facility

8.    Incinerator available on-site or alternative arrangements with 
      authorities

9.    Bedding dust-free as possible

10.   Protective clothing decontaminated before laundry

11.   Immunization of staff offered
            Animal Facility – Biosafety Level 4

•   Normally linked with work in maximum containment lab 
          Animal Facility – Biosafety Level 4
                 Safety precautions
•   Access strictly controlled

•   Two-person rule

•   Highest level of training as microbiologists

•   All rules for maximum containment lab should be followed

•   Airlock anteroom, showering facilities

•   Special protective clothing (autoclaved before leaving)

•   Negative pressure, HEPA filters
            Animal Facility – Biosafety Level 4
                   Safety precautions
8.    Double-ended autoclave

9.    All animal manipulations in maximum containment conditions

10.   All animals housed in isolators

11.   All bedding and waste autoclaved before removal from facility

12.   Medical supervision

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:0
posted:6/2/2014
language:English
pages:118