1. Introducere
1. INTRODUCERE
Primul biosenzor amperometric a fost realizat în 1962 de către Clark şi Lyon [1]. Acesta era un senzor amperometric principial nou, prin aceea că reunea într-un dispozitiv funcţional monobloc un traductor amperometric (un senzor de tip Clark pentru oxigen [2]) şi un element de recunoaştere biologic (o enzimă din clasa oxidoreductazelor, glucozoxidaza, care catalizează reacţia de oxidare a glucozei de către oxigen cu formare de acid gluconic şi de H2O2). Ansamblul rezultat furniza, în anumite condiţii experimentale, un curent liniar dependent de concentraţia de glucoză din soluţia cu care se afla în contact. Pe un plan mai larg, în acest fel se realiza pentru prima dată asocierea, actualmente unanim considerată ca definitorie pentru noţiunea de biosenzor, dintre un element biologic de recunoaştere şi un traductor fizico-chimic adecvat, ultimul fiind conectat în serie cu primul [3]. De atunci, domeniul consacrat realizării şi îndeosebi utilizării biosenzorilor s-a dezvoltat într-un ritm din ce în ce mai accelerat, ajungând ca în zilele noastre să fie considerat unul dintre cele mai dinamice domenii de cercetare din bioelectrochimia analitică. In continuare sunt prezentate câteva dintre dovezile cele mai frecvent aduse în sprijinul acestei afirmaţii. In primul rând, trebuie menţionat că multitudinea şi importanţa eforturilor de cercetare consacrate domeniului biosenzorilor a determinat înfiinţarea unei reviste internaţionale de prestigiu („Biosensors and Bioelectronics”, factor de impact 2.947 calculat pentru anul 2003). De la apariţia sa, în anul 1986, această revistă este dedicată în exclusivitate publicării celor mai relevante rezultate obţinute în domeniul cercetării dedicate biosenzorilor şi dispozitivelor bioelectronice [4a]. Pe de altă parte, numeroase alte reviste de o importanţă deosebită în domeniul chimiei analitice [4b-4d], al electrochimiei analitice [4e], al bioelectrochimiei [4f], precum şi în domeniul senzorilor chimici [4g, 4h] consacră sistematic secţiuni întregi publicării lucrărilor despre biosenzori. De asemenea, trebuie amintit că din 1992, fără excepţie, cercetătorii care activează în domeniul biosenzorilor au posibilitatea să se întâlnească, odată la doi ani, în cadrul Congresului Mondial despre Biosenzori. De pildă, în anul 2004 acest congres, care a ajuns la cea de a 8-a ediţie, s-a desfăşurat la Granada (Spania) unde s-au reunit peste 1500 de participanţi din întreaga lume [5]. Pe de altă parte, este deosebit de semnificativ faptul că în ţări recunoscute pentru calitatea activităţii de cercetare/inovare funcţionează de mulţi ani puternice centre de cercetare, care sunt profilate în exclusivitate pe proiectarea, realizarea şi utilizarea de senzori/biosenzori [6]. Intr-unul din aceste centre [6b] în anul 1981 a 11
I. C. Popescu
fost inventat, ulterior brevetat (în 1984) şi apoi a fost adus până la faza de comercializare primul biosenzor (amperometric) pentru determinarea glucozei din sânge [7]. Acest biosenzor constituie şi astăzi exemplul cel mai reuşit de valorificare a cercetărilor din domeniu. Poziţia dominantă a biosenzorilor amperometrici între toate celelalte tipuri cunoscute de biosenzori, este demonstrată de o comparaţie realizată între diferitele variante constructive de biosenzori [8], care arată că biosenzorii amperometrici constituie grupul de biosenzori nu numai cel mai accesibil din punct de vedere experimental, dar şi cel mai performant. Astfel, în urma unei evaluări a performanţelor atinse în cazul diferitelor tipuri de biosenzori (clasificaţi după natura traductorului încorporat, vezi secţiunea 2.2), performanţe referitoare la 8 caracteristici considerate definitorii (sensibilitate, cost, selectivitate, versatilitate, domeniu de lucru, disponibilitate, perspective şi simplitate), cea mai mare medie (4,75 pe o scală cu 5 cinci gradaţii) a fost acordată biosenzorilor amperometrici [8]. Aceştia au fost urmaţi în ordine de biosenzorii potenţiometrici (4,25), optici (3,75), piezoelectrici (2,12) şi termici (2,12). In fine, în cele din urmă dar nu în ultimul rând, trebuie subliniate actualitatea şi atractivitatea domeniului care se reflectă şi prin aceea că într-un interval de timp relativ scurt au fost publicate în edituri de prestigiu ample monografii despre diverse aspecte referitoare la construcţia, caracteristicile funcţionale şi îndeosebi aplicaţiile biosenzorilor [9]. O analiză atentă a imensei cantităţi de material faptic, adunat în cei peste 40 de ani de când a fost iniţiat domeniul de cercetare dedicat biosenzorilor, conduce la concluzia că principalele motive pentru care acest dispozitiv analitic a reţinut atenţia cercetătorilor într-o măsură atât de mare pot fi reduse la trei: (i) selectivitate remarcabilă; (ii) sensibilitate deosebită; (iii) versatilitate neobişnuită [9l]. Este relevantă observaţia că toate cele trei caracteristici prin care biosenzorii s-au distins în ansamblul senzorilor chimici sunt rezultatul comportării ieşite din comun a receptorului biologic. Astfel, dacă pentru simplitate se restrânge discuţia la nivelul biosenzorilor amperometrici enzimatici (BAE), atunci se observă fără dificultate că selectivitatea acestora este strâns corelată cu selectivitatea / specificitatea procesului enzimatic, că sensibilitatea BAE este dictată esenţialmente de eficienţa extraordinară a acestor biocatalizatori, iar diversitatea excepţională a sistemelor enzimatice este fără îndoială strâns legată de versatilitatea deosebită a BAE. Ca o consecinţă firească a poziţiei dominante a biosenzorilor amperometrici printre celelalte tipuri de biosenzori, receptorul cel mai frecvent utilizat este de natură enzimatică, cel mai adesea o enzimă din clasa oxidoreductazelor. Oxido-reductaza catalizează o reacţie redox, a cărei viteză, în anumite 12
1. Introducere
condiţii, poate fi proporţională cu concentraţia substratului. Dacă unul dintre reactanţii sau produşii de reacţie implicaţi în reacţia enzimatică posedă activitate electrochimică, atunci avansarea reacţiei poate fi urmărită în mod direct, pe cale amperometrică. Este cazul BAE, care nu implică prezenţa unui mediator sau a unui reactiv auxiliar. Exemplul clasic îl constituie BAE pentru determinarea glucozei în care procesul de detecţie fie este bazat pe urmărirea consumului de oxigen (prototipul BAE), fie constă în oxidarea/reducerea H2O2 pe un electrod adecvat [9b]. O situaţie principial diferită corespunde BAE a căror funcţionare este dependentă sau de prezenţa unui mediator redox (cu rol de electrocatalizor, determinant pentru funcţionarea eficientă a traductorului amperometric), sau de prezenţa unui cofactor determinant pentru desfăşurarea procesului enzimatic (de exemplu NAD+ în cazul multor dehidrogenaze). In cele din urmă, este uşor de constatat că problematica aferentă BAE se amplifică semnificativ dacă se iau în consideraţie şi următoarele aspecte: (i) O succesiune de reacţii enzimatice interconectate, în care pot fi implicate şi alte enzime decât cele din clasa oxido-reductazelor, poate conduce la apariţia unei specii electrochimic activă, detectabilă amperometric [10]; (ii) In structura BAE sunt încorporate uneori mai multe enzime, care servesc fie pentru eliminarea pe cale enzimatică a unor posibili interferenţi [11], fie pentru creşterea sensibilităţii BAE prin reciclarea unor produşi de reacţie, rezultaţi din procesul enzimatic primar [12]; (iii) Un contact eficient între traductorul amperometric şi receptorul biologic presupune o imobilizare stabilă a enzimei/enzimelor pe suprafaţa unui electrod adecvat, procedură nu tocmai simplă din punct de vedere practic şi nici fără consecinţe defavorabile asupra activităţii enzimei imobilizate [13]. In acest context, în prezenta lucrare, prima monografie dedicată biosenzorilor amperometrici redactată în limba română, sunt abordate mai întâi, pe scurt, o serie de aspecte generale necesare pentru încadrarea, definirea şi stabilirea particularităţilor funcţionale caracteristice BAE în ansamblul biosenzorilor actualmente cunoscuţi. Apoi, sunt prezentate noţiunile fundamentale referitoare la funcţionarea traductorului amperometric, precum şi la caracteristicile şi posibilităţile de exploatare analitică ale elementului de recunoaştere biologică. In cele din urmă sunt expuse câteva dintre cele mai reprezentative soluţii de utilizare ale biosenzorilor amperometrici în domeniul biomedical şi al controlului calităţii mediului înconjurător. Multe dintre exemplele incluse în prezenta lucrare provin din îndelungata activitate de cercetare desfăşurată de autori atât pentru elaborarea şi caracterizarea unor sisteme electrochimice cu activitate electrocatalitică, utilizate ca traductori amperometrici pentru detecţia unor specii chimice de interes bioelectrochimic, cât şi pentru realizarea nemijlocită de biosenzori amperometrici. 13
I. C. Popescu
Bibliografie
1. 2. 3. 4. Clark L.C., Lyons C., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1962, 102, 29. Clark L.C., Trans. Am. Soc. Art. Int. Org., 1956, 2, 41. Thevenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G., Biosens. Bioelectron., 2001, 16, 121. (a) Biosensors & Bioelectronics, Elsevier; (b) Analytical Chemistry, American Chemical Society; (c) Analytica Chimica Acta, Elsevier; (d) Analyst, Royal Society of Chemistry; (e) Electrochimica Acta, Pergamon; (f) Bioelectrochemistry, Elsevier; (g) Sensors and Actuators, Chemical B, Elsevier; (h) Sensors Update, Wiley-VCH. World Congres on Biosensors 2004, Grenada, Spain; http://www.biosensors2002.com/ (a) Institut für Chemo- und Biosensorik, Münster, Germany; (b) Cranfield Biotechnology Centre, Cranfiled, UK; (c) Edison Sensor Technology Center, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio, SUA. ExacTech® Pen produs de MediSense; http://www.medisense.com/history.html. Griffiths D., Hall G., TIBTECH, 1993, 11, 122. (a) „Biosensors. Fundamentals and Applications”, Turner A.P.F., Karube I., Wilson G.S. (eds.), Oxford Univ. Press, Oxford, UK, 1987; (b) „Biosensors. A Practical Approach”, Cass A.E.G. (ed.), Oxford Univ. Press, Oxford, UK, 1990; (c) Hall E.A.H., „Biosensors”, Open Univ. Press, Buckingham, UK, 1990; (d) „Biosensor Principles and Applications”, Blum L.L., Coulet P. (eds.), Marcel Dekker, New York, SUA, 1991; (e) Schmidt H.L., Schuhmann W., Scheller F.W., Schubert F., „Specific Features of Biosensors” în „Sensors. A Comprehensive Survey”, Gopel W., Hesse J., Zemel J.N. (eds.), Wiley-VCH, Weinheim, Germania, 1992. vol. 3, partea II-a; (f) Buerk D.G., „Biosensors. Theory and Applications”, Technomic Publ. Co., Lancaster, UK, 1993; (g) Danielsson B., „Biosensors. An Introduction” în „Advances in Molecular and Cell Biology. Biochemical technology”, Danielsson B., Bulow L. (eds.),. JAI Press Inc., Greenwich, Connecticut, USA, 1996, vol 15B, 349; (h) Eggins B.R., „Biosensors. An Introduction”, Wiley-VCH, Chichester, UK, 1996; (i) Scheller F.W., Schubert F., Fedrowitz J. (eds.), „Frontiers in Biosensorics. I”, Birkhauser Verlag, Basel, Elveţia, 1997; (j) „Handbook of Biosensors and Electronic Noses. Medicine, Food and the Environment”, Kress-Rogers E. (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 1997; (k) „Enzyme and Microbial Biosensors”, Mulchandani A., Rogers K.R. (eds.), Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998; (l) „Biosensors for Environmental Monitoring”, Bilitewski U., Turner A.P.F. (eds.), Harwood Academic Publ., Amsterdam, Olanda, 2000. Mădăraş M.B., Popescu I.C., Ufer S., Buck R.P., Anal. Chim. Acta, 1996, 319, 335. Wollenberger U., Scheller F., Pfeiffer D., Bogdanovskaya V.A., Tarasevich M.R., Hanke G., Anal. Chim. Acta, 1986, 187, 39. Cosnier S., Popescu I.C., Anal. Chim. Acta, 1996, 319, 14. Barker S.A. în „Biosensors. Fundamentals and Applications”, Turner A.P.F., Karube I., Wilson G.S. (eds.), Oxford Univ. Press, Oxford, UK, 1987, 85.
5. 6.
7. 8. 9.
10. 11. 12. 13.
14