isolasi plasmid

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK ANALISA DNA

KP A



ISOLASI DNA PLASMID

TANGGAL : Kamis, 3 September 2009



NAMA PRAKTIKAN



: 1. Devi (7071017) 2. Victor (7071816)



NAMA ASISTEN DOSEN



: 1. Wirawan 2. Helen



FAKULTAS TEKNOBIOLOGI UNIVERSITAS SURABAYA 2009



I.



TUJUAN Mahasiwa dapat mengisolasi DNA plasmid menggunakan metode mini preparation dalam kondisi basa (lysis by alkali)



II.



DASAR TEORI Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nikleus yang disebut sebaga DNA kromosomal, betigu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat bereplikasi secara terpisah dari DNA kromosomal, dapat ditransfer ke bakteri lain, dan memiliki ORI (Origin of replication). Perbedaan dari DNA kromosomal dan plasmid dapat diliat dari gambar di bawah ini:



Plasmid berdasarkan fungsinya dapat dikelompokkan menjadi: 1. Fertility-F-plasmids, merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel akteri lain untuk proses konjugasi 2. Resistance-(R)plasmids, mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun. 3. Col-plasmid, mengandung gen yang mengkode protein (bakterosin) yang dapat membunuh bakteri lain 4. Degradative plasmids, yang mampu mencerna subsansi yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat.



5. Virulence plasmids, yang menjadikan bakteri tersebut patogen Selain fungsi, plasmid juga memiliki bentuk yang beragam, antara lain: 1. Supercoiled (covalently closed-circular): DNA berbentuk sirkular dengan bentuk rantai yang terpilin



2. Relaxed circular: Kedua ujung DNA menyatu dan berbentuk sirkuler 3. Supercoiled Denature: kedua ujung DNA menyatu tapi pasangan basanya tidak sempurna 4. Nicked open circular: rantai DNA yang terpotong pada salah satu sisi saja 5. Linier: rantai DNA lurus yang terpotong pada kedua sisinya Berbagai macam bentuk plasmid itu akan mempengaruhi kecepatan migrasi plasmid dalam elektroforesis. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, linear, dan nicked open circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mundah bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. Karena plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan



keuntungannya, maka ada banyak cara yang digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 120g. Ssedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200g) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 g.



Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adlah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis. DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. Adanya EDTA ini berfungsi sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma. Selain itu EDTA juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Tris Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap stabil. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5. Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa renaturasi. Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnya



yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant. Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis. Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pembanding sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Beberapa hal yang dapat mempengaruhi hasil elektroforesis adalah jumlah DNA di dalam sampel dan kecepatan migrasi DNA yang dipengaruhi oleh ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis



III. ALAT DAN BAHAN a. Alat-alat yang digunakan :  Tabung eppendorf  Parafilm  Tip putih  Satu set peralatan elektroforesis horisontal  Mikropipet 1-10 L



 Satu set peralatan pembuatan gel agarosa  Erlenmeyer  Isolasi  Mikrosentriguge b. Bahan-bahan yang diperlukan :  Glukosa  EDTA  SDA  Asam asetat glasial  Ampisilin  Tris-Cl  NaOH  Aquadest  Media LB



IV. CARA KERJA 1. Mengambil sampel E.coli yang telah disediakan dan mengisikan sampel tersebut ke dalam 3 tabung ependorf sampai sampel habis. 2. Ketiganya disentrifuge 11.000 rpm selama 1 menit. 3. Membuang supernatant karena pellet sel yang akan digunakan untuk proses selanjutnya. 4. Menambahkan 500 l buffer STE dan menghomogenkan dengan menggunakan pipet mikro 5. Melakukan sentrifuge 11.000 selama 1 menit 6. Menambahkan 300 l larutan lisis dan menghomogenkan dengan memipet berulang kali dan membiarkan selama 5 menit 7. Menambahkan 150 l larutan penetralisir, dihomogenkan dan diabiarkan selama 3 menit. 8. Melakukan sentrifugasi pada 11.000 rpm selama 5 menit. 9. Mengambil supernatant sebanyak 400 l dan memasukkan pada tabung ependorf steril 10. Menambahkan 800 l etanol p.a. dingin dan membolak-balik tabung sebanyak 10 kali.



11. Melakukan sentrifugasi lagi pada 11.000 rpm selama 5 menit. 12. Membuang supernatant dan menambahkan etanol 70% sebanyak 1ml kemudian dibolak-balik sebanyak 10 kali. 13. Melakukan sentrifugasi lagi pada 11.000 rpm selama 1 menit. 14. Membuang supernatant dan melarutkan pellet DNA plasmid dengan ddH2O 50 l. 15. Melakukan elektroforesis larutan DNA plasmid dengan langkah yang sama seperti modul sebelumnya, penentuan ukuran DNA.



V.



HASIL PRAKTIKUM Hasil dari elektroforesis selama 30 menit dengan tegangan 90 volt dilihat dengan sinar UV:



untuk mempermudah penghitungan jarak migrasi DNA, gambar hitam putih beserta jarak migrasi nya adalah:



Hasil Batas sumur



Marker



1,87 2,19 2,8 2,98 3,22 3,72 4,3 4,76 5,49 6,35 6,9



1,91 2,06 2,2 2,4 2,61



4,32 4,97



4,16



VI. PERHITUNGAN Persamaan regresi logaritmik yang digunakan untuk DNA marker berdasarkan data yang diperoleh: Ukuran DNA (bp) 250 500 750 1000 1500 2000 Jarak migrasi (cm) 6,35 5,49 4,76 4,3 4,16 3,72



2500 3000 3500 4000 5000 6000 8000 10000



3,22 2,98 2,8 2,61 2,4 2,2 2,06 1,91



Grafik yang diperoleh dari data tersebut adalah:



Grafik Ukuran DNA vs Jarak Migrasi

7

Jarak Migrasi (cm)



6 5 4 3 2 1 0 0 2000 4000 6000 Ukuran DNA (bp) 8000 10000 12000 y = -1,247Ln(x) + 13,106 R2 = 0,9868



Persamaan garis yang diperoleh dari grafik tersebut adalah y = -1,247 ln (x) + 13,106 ; R2 = 0,9868 Persamaan logaritmik ini dipilih karena menghasilkan nilai R2 yang paling mendekati 1 dibandingkan penggunaan persamaan lain seperti persamaan linier, exponensial, ataupun power. Dengan menggunakan persamaan ini dapat ditentukan ukuran DNA sampel berdasarkan jarak migrasinya: Band ke 1 2 Jarak Migrasi DNA sampel ( cm) 1,87 2,19 Ukuran DNA ( base pair ) 8188 6335



3 4 5



4,32 4,97 6,9



1148 682 145



Karena R2 kurang mendekati nilai 1 maka terdapat kejanggalan pada perhitungan. Pada jarak migrasi 1,87 seharusnya ukuran DNA yang terbaca adalah lebih besar dari 10.000 base pair.



VII. PEMBAHASAN Pada percobaan ini dilakukan teknik isolasi plasmid DNA dengan metode mini preparation dalam kondisi basa (lysis by alkali). Plasmid yang digunakan berasal dari sampel E.coli. metode yang digunakan dibagi dalam 4 tahap: Tahap Resuspensi Sampe diambil dan diisikan ke tiga tabung ependorf yang telah disediakan kemudian ketiganya disentrifuge. Pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. EDTA berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain itu Tris Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya. Tahap Lysis Tahap ini memanfaatkan pellet hasil sentrifuge tahap sebelumnya. Pellet diresuspensikan dalam buffer lisis. Buffer ini terdiri dari empat komponen, yaitu: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan. DNA kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi sehingga yang dapat diperoleh setelah proses renatuasi kemungkinan besar adalah DNA plasmid.



-



Tahap Penetralan Penambahan larutan penetralisir yang terdiri dari kalium asetat dan asam asetat pada pH 5. Tujuannya adalah agar pH tidak basa sehingga DNA bisa renaturasi. Fungsi dari kalium asetat adlah untuk renaturasi plasmid, pengendapan DNA single strand, bergabung dengan SDS membentuk KDS yang tidak mudah larut sehingga SDS dapat terbuang dengan mudah. Yang perlu diperhatikan adalah proses sentrifugasi tidak boleh terlalu berlebihan karena akan menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga tidak dapat mengendap sebagai pellet melainkan terlarut bersama supernatant.



-



Tahap Pemurnian Supernatant yang berisi DNA plasmid dimurnikan dengan menambahkan etanol absolut dingin untuk mengendapkan plasmid berdasarkan perbedan polaritas dengan pelarutnya, suhu yang dingin ditujukan untuk penyempurnaan persitipasi. Selanjutnya ditambahkan etanol 70% untuk menghilangkan pengotor yang masih ada, disentrifuge, dan pellet yang terbentuk (supernatant dibuang) dilarutkan kembali dengan ddH2O kemudian plasmid dianalisis dengan menggunakan elektroforesis. Dari hasil elektroforesis yang dilakukan dapat diketahui ukuran DNA



sampel melalui persamaan garis yang diperoleh dari DNA marker. Ukuran DNA tersebut berbanding dengan jarak migrasinya, sehingga ukuran DNA sampel yang diperoleh adalah: Band ke 1 2 3 4 5 Jarak Migrasi DNA sampel ( cm) 1,87 2,19 4,32 4,97 6,9 Ukuran DNA ( base pair ) 8188 6335 1148 682 145



Jika dibandingkan dengan marker, terdapat kejanggalan pada ukuran DNA pada band pertama, jarak migrasi yang lebih pendek daripada marker dengan ukuran 10.000 bp tetapi dari hasil perhitungan hanya diperoleh 8188



bp. Hal ini disebabkan hasil R2 yang kurang mendekati 1 sehingga persamaan yang diperoleh kurang akurat untuk menentukan ukuran DNA sampel khususnya pada band pertama. Pada band-band selanjutnya ukuran dan jarak migrasi menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak migrasi DNA marker. Selain harga R2, pengaruh lain yang menyebabkan kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat karena adanya band yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui jarak migrasi pastinya. Jadi ukuran DNA pada band pertama itu seharusnya lebih besar dari sepuluh ribu base pair (>10.000 bp). Karena migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Bentuk DNA (plasmid) yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk supercoiled. Band kelima menunjukkan adanya RNA karena band yang ditunjukkan berupa smear dan kurang jelas yang merupakan ciri dari RNA saat elektroforesis. Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi, relaxed circular, linear, dan nicked open circular untuk band ke-4,3,2, dan band ke-1. Bentuk yang bervariasi ini juga bisa disebabkan proses renaturasi yang tidak sempurna. Hasil elektroforesis yang diperoleh oleh kelompok praktikan juga berbeda dengan kelompok lain pada agarose yang sama meskipun dengan sampel yang sama. Band teratas dari kelompok lain terdiri dari tiga band sedangkan pada kelompok ini hanya terdiri dari dua band. Namun, band teratas memiliki ketebalan yang tidak dimiliki oleh kelompok lain. Kemungkinan yang terjadi adalah band yang seharusnya terlihat dua, tertumpuk menjadi satu. Hal yang dapat menyebabkan tertumpuknya band ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses elektroforesis



yang dilakukan. DNA plasmid yang digunakan untuk proses elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid dalam bakeri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada proses penetralan jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu kuat maka DNA kromosomal dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid yang digunakan untuk tahap selanjutnya. Dalam proses elektroforesis itu sendiri banyak hal yang mempengaruhi migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis.



VIII. KESIMPULAN Ada banyak cara yang dapat digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid, salah satunya adalah lysis by alkali yang bisa digunakan untuk metode mini preparation. Metode ini khusus untuk isolasi plasmid bakteri yang berukuran 1-20 g. Lysis by alkali merupakan cara untuk melisiskan sel bakteri dalam kondisi basa dengan menggunakan bantuan SDS. Cara isolasi plasmid ini terdiri dari empat langkah yaitu resuspensi, pelisisan, penetralan, dan pemurnian. Setiap tahap memiliki tujuan dan fungsi reagennya masing-masing. DNA plasmid yang berhasil diisolasi selanjutnya dianalisa dengan menggunakan elektroforesis sehingga dapat diketahui ukuran DNA plasmid tersebut serta dapat diperkirakan bentuk dari DNA yang ada dalam sampel. Ukuran DNA sampel yang didapatkan adalah: Band ke 1 2 3 4 5 Jarak Migrasi DNA sampel ( cm) 1,87 2,19 4,32 4,97 Ukuran DNA ( base pair ) 8188 6335 1148 682



6,9 145 Ukuran DNA yang bervariasi ini disebabkan karena bakteri dengan spesies yang sama sekalipun dapat memiliki ukuran DNA yang berbeda. Ukuran



DNA yang berbeda ini juga menunjukkan adanya bentuk serta jenis plasmid yang berbeda pula. Namun tidak semua yang terbaca dalam elektroforesis adalah DNA plasmid, pada band kelima merupakan RNA karena hasil elektroforesis berupa smear yang merupakan ciri RNA dalam elektroforesis, ada juga pengotor lain seperti DNA kromosomal ataupun DNA mitokondria yang merupakan komponen sel bakteri tersebut.



IX. DAFTAR PUSTAKA http://images.google.com/images?hl=id&um=1&sa=1&q=plasmid&aq=f&o q=&start=0. Diunduh 5 September 2009 http://images.google.com/images?sourceid=navclient&q=supercoiled%20dn a%20plasmid&um=1&ie=UTF-8&sa=N&hl=id&tab=wi. September 2009 http://www.biocompare.com/forums/ViewThread.aspx?threadid=463. Diunduh 6 September 2009 Diunduh 5