PowerPoint Presentation - University of Alberta

Document Sample
PowerPoint Presentation - University of Alberta Powered By Docstoc
					                                                                                      A Novel Lipid Inhibitor of Protein Phosphatase-1
                                           Kathleen R. Perreault*, Brian Dembinski^, Jason T. Maynes*, Michael N. G. James,  Elena Posse de Chaves^, and Charles F. B. Holmes*
      From the Canadian Institutes of Health Research, Group in Protein Structure and Function and the Signal Transduction Research Group, the Departments of Biochemistry* and 
                                             Pharmacology^, Faculty of Medicine, University of Alberta, Edmonton, Alberta T6G 2H7, Canada 
                                                     Introduction                                                                                                                                                                                                                                                                          Conclusions
        Reversible protein phosphorylation is an integral mechanism of signal transduction in many important 
cellular  processes,  including,  but  certainly  not  limited  to, mitogenesis,  apoptosis,  and  regulation  of  gene 
                                                                                                                                  Results                                                                                                                                                         We  have  identified glucosylceramide  as  a  novel  inhibitor  of  PP1c  and 
                                                                                                                                                                                     Figure 3:   GlcCer inhibits  both  PP1c  and                                                          PP2Ac.    Mutagenesis  studies  of  PP1c  have  shown  that  residues  in  both  the  ß12-
expression.  In the human genome, the ratio of Ser/Thr protein kinases to Ser/Thr protein phosphatases is                                                                                                                                                                                  ß13  loop  and  the  hydrophobic  groove  are  important  for  the  inhibition  of  PP1c  by 
                                                                                                                                                                                     PP2Ac.    Inhibition  of  PP1c  (IC50~5 μM)  is 
approximately 8:1.  The corollary of this unbalanced ratio is that an individual phosphatase is responsible for  
                                                                                                                                                                                     approximately  3  times  more  potent  than                                                           glucosylceramide.
dephosphorylating a broad range of substrates, and therefore must be promiscuous with respect to substrate 
specificity.  To compensate for this relative lack of specificity, Ser/Thr phosphatases are regulated by a large                                                                     inhibition of PP2Ac (IC50~15 μM).
                                                                                                                                                                                                                                                                                                   Studies using lysates from live cells show that this inhibition is not purely an 
number  of  inhibitory  and  targeting  subunits,  which  serve  to  direct  their  activity  towards  the  appropriate                                                                                                                                                                    in vitro phenomenon, as endogenous PP1 activity is also affected by an increase in 
substrate.                                                                                                                                                                                                                                                                                 glucosylceramide.  
         Protein phosphatase-1 (PP1) is a Ser/Thr phosphatase of the PPP family, which is also comprised of 
PP2A, PP2B (Calcineurin), PP4, PP5, PP6 and PP7.  PP1 activity is regulated by many endogenous protein 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                        Future Directions
inhibiting/targeting subunits.  A number of structurally diverse natural product toxins are also potent inhibitors 
of PP1 activity (Figure 1).  Despite the structural diversity of these toxins, they have several coarsely similar                                                                                                                                                                                 We  hope  to  carry  out  studies  on  the  effect  of  endogenous  and  exogenous 
features that aid in binding to PP1: hydrogen bonding to specific conserved residues in close proximity to the                                                                                                                                                                             glucosylceramide on  the phosphorylation states  of  PP1  and  PP2A  substrates.   
site of enzymatic activity, acidic groups that interact with conserved basic amino acids within the active site,                                                                                                                                                                           Because glucosylceramide has  been  shown  to  accumulate  in multidrug-resistant 
and hydrophobic regions that allow binding at the hydrophobic groove adjacent to the active site (1-3).                                                                                                                                                                                    cancer  cell  lines  like  the  KB  cell  lines  used  in  our  study,  we  are  particularly 
         Ceramide is a sphingolipid second messenger produced in response to cellular stress via activation                                                                                                                                                                                interested in the phosphorylation state of proteins involved in cell cycle arrest and 
of sphingomyelinases.    Agonists  that  cause  cellular  production  of  ceramide  include  cytokines  (TNF,  Fas),                                                                                                                                                                       apoptosis.    Previous  studies  have  shown  that  treatment  of  sympathetic  neurons 
agents  of  environmental  stress  (heat,  UV  irradiation),  and  chemotherapeutic  agents.  The  accumulation  of                                                                                                                                                                        with ceramide (PP1 activator) blocks hyperphosphorylation of pRB (retinoblastoma 
ceramide activates JNK/SAPK, PKCζ, caspases as well as PP1 and PP2A.  Substrates of PP1 and PP2A                            Figure 4 (above):  Differences in sequence in the ß12-ß13 loop region of PP1, PP2A and PP2B (Calcineurin).  
                                                                                                                            The  ß12-ß13  loop  corresponds  to  residues  273-277  in  PP1c.    Because  this  is  a  non-conserved  sequence                                             gene  product),  and  therefore  we  hypothesize  that  we  may  see 
that  are  dephosphorylated  in  response  to  either  ceramide-inducing  agonists  or  addition  of  exogenous                                                                                                                                                                            hyperphosphorylation of pRB upon treatment of neurons with GlcCer (5). 
                                                                                                                            between PP1 and PP2A, located close to the active site and shown to be important in interaction with other PP1 
ceramide  include  c-jun,  SR  proteins,  retinoblastoma  protein,  PKB/Akt1,  protein  kinase  Cα  and  Bcl-2.             inhibitors, we examined it’s importance in GlcCer inhibition of PP1 and PP2A.  We mutated residues 273-277 in 
         Glucosylceramide  (GlcCer)  is  a  metabolite  of ceramide produced  by  the glycosylation of  the  1-             PP1c  (CGEFD)  to  the  corresponding  residues  in  PP2B,  and  examined  inhibition  of  the  mutant  enzyme  by 
hydroxyl  group  of ceramide by  the  enzyme Glucosylceramide  Synthase  (GCS)  (Figure  1).    Given  the                  GlcCer (below).  In addition, we used a mutation of PP1c in the hydrophobic groove to determine the importance 
similarities in structure between the natural product inhibitors of PP1, the clavosines and calyculins, and the             of this region in binding to GlcCer.                                                                                                                                                                            References
sphingolipid GlcCer, we hypothesized that GlcCer may affect PP1c activity by binding to the catalytic subunit                                                                                                                                                                              1. Kathleen R. Perreault, Jason T. Maynes, Maia M. Cherney, Hue Anh Luu, Michael N. G. James, and Charles 
in  a  similar  fashion.    Using radiolabelled  glycogen phosphorylase  a,  a  physiological  substrate  of  PP1,  we                                                                                                                                                                     F.  B.  Holmes.   Crystal Structure and Mutagenesis of a Protein Phosphatase-1:Calcineurin Hybrid
found  that GlcCer  inhibited  PP1  activity   in vitro.    Using  site-directed  mutagenesis  of  the  PP1  catalytic                                                                                                                                                                     Elucidate the Role of the ß12-ß13 Loop in Inhibitor Binding.   J. Biol. Chem. 279:  43198-43206  (October 
                                                                                                                                                                                                                          Figure 5:    The  ß12-ß13  loop  as  well  as                    2004). 
subunit (PP1c), we determined that the β12-β13 loop (Figures 2 and 4), an unstructured chain of five non-
                                                                                                                                                                                                                          residue Tyr-134 of the PP1c hydrophobic 
conserved amino acid residues present in PP1, PP2A and PP2B, is important for binding of GlcCer to PP1c.                                                                                                                                                                                   2.  Jason  T. Maynes,  Katherine  S.  Bateman,  Maia  M.  Cherney,  Amit  K.  Das,  Hue  Anh  Luu,  Charles  F.  B. 
Ceramide activation of PP1c is unaffected by mutations in this region.  We also found that mutation of Tyr-                                                                                                               groove, are important in binding of GlcCer                       Holmes,  and  Michael  N.  G.  James. Crystal Structure of the Tumor-promoter Okadaic Acid Bound to
134, an amino acid residue present at the interface between the hydrophobic groove and the active site of                                                                                                                 to  PP1c.    Mutating  the  residues  of  the                    Protein Phosphatase-1. J. Biol. Chem. 276: 44078-44082 (November 2001).  

PP1c,  greatly  decreases  the  potency  of GlcCer inhibition.    Finally,  we  used lysates of  live  cells  with                                                                                                        ß12-ß13  loop  of  PP1c  to  the                                 3.    Charles  F.  B.  Holmes,  Jason  T. Maynes,  Kathleen  R. Perreault,  and  Michael  N.  G.  James.   Molecular
accumulated GlcCer to show that endogenous PP1 activity is also decreased in the presence of GlcCer.                                                                                                                      corresponding  residues  in  PP2B  caused                        Enzymology Underlying Regulation of Protein Phosphatase-1 by Natural Toxins.   Curr. Med. Chem. 9:   
                                                                                                                                                                                                                                                                                           1981-1989 (November 2002).
                                                                                                                                                                                                                          a 3-fold decrease in inhibition by GlcCer, 
                                                                                                                                                                                                                                                                                           4. Yaakov Lavie, Hui-ting Cao, Stuart L. Bursten, Armando E. Giuliano, and Myles C. Cabot. Accumulation of
                                                                                                                                                                                                                          resulting in an IC50 of ~15 μM.  Mutating 
                                                                                                                                                                                                                                                                                           glucosylceramides in multidrug-resistant cancer cells. J. Biol. Chem. 271:19530-6 (August 1996). 
                                                                                                                                                                                                                          the  hydrophobic  groove  residue Tyr-134 
                                                                                                                                                                                                                                                                                           5.  Greg Plummer, Kathleen R. Perreault, Charles F. B. Holmes, and Elena I. Posse de Chaves.  Activation of
                                                                                                                                                                                                                          to  Ala  caused  an  even  more  potent                          Serine/Threonine Protein Phosphatase-1 is Required for Ceramide-Induced Survival of Sympathetic
                                                                                                                                                                                                                          decrease in inhibition (IC50>20 μM).                             Neurons.  Biochem. J.  385: 685-693 (September 2004).

                                                                                                                           Figure 6:   Glucosylceramide has  been  shown 
                                                                                                                           to  accumulate  in  several  multidrug-resistant 
    Figure 1:  The PP1 inhibitors clavosine (left), and the sphingolipid glucosylceramide (right).                         (MDR) cancer cell lines (4).  We examined PP1                                                                                     Cell Type

                                                                                                                           activity  and GlcCer content  in multidrug-                                                                      KB-3-1    KB-V.01     KB-V.1       KB-V1
                                                                                                                           resistant  human epidermoid carcinoma  cells.   
                                                                                    Figure 2:    Crystal  structure        We  found  these  cells  have  increased                                PP1 Activity
                                                                                                                                                                                                                    4.6±0.3                           4.0±0.2*    3.6±0.1**    3.4±0.1**
                                                                                    of PP1c bound to clavosine.                                                                                (x107 mU/mg protein)
                                                                                                                           glucosylceramide content  and  decreased  PP1 
                                                                                    The residues of the ß12-ß13 
                                                                                    loop  as  well  as  the  residue 
                                                                                                                           activity.    For  Figures  6  and  7,  statistically                                   GluCer content
                                                                                    Y134  of  the  hydrophobic             significant  results  compared  to  untreated 
                                                                                    groove  of  the  enzyme  are           cultures are indicated ** (p<0.005).
                                                                                    indicated  in  green.    The 
                                                                                    methylated         rhamnose 
                                                                                    moiety  is  in  close  proximity                                                                                                                                                           **
                                                                                    to  the  ß12-ß13  loop.    The         Figure 7:    Accumulation  of GlcCer in  live 
                                                                                                                                                                                      PP1 Activity (x106 mU/mg protein)

                                                                                    hydrophobic  groove,  which            cells causes a decrease in PP1 activity.  Rat                                                  3
                                                                                    contains  the  residue  Y134           sympathetic  neurons  were  incubated 
                                                                                    binds the polyketide chain of 
                                                                                    the  inhibitor.    We  propose 
                                                                                                                           overnight with the indicated concentrations of 
                                                                                    that  these  regions  are  also        GlcCer and Cer.    The  cells  were lysed,  and 
                                                                                    important  in  forming                 PP1c  activity  in  the lysates was  measured                                                                             **     **
                                                                                    interactions  with  the  C18-          using phosphorylase a  as  a  substrate.    We                                                 1
                                                                                    sphingosine  moiety  of                found  that  PP1  activity  decreased  with 
                                                                                    ceramide and GlcCer.
                                                                                                                           increasing exposure to GlcCer.
                                                                                                                                                                                                                              control   5    10      20     30      40        C6- Cer       Figure 8:    A  close-up  view  of  the  proximity  of  bound clavosine to  the  ß12-ß13 
                                                                                                                                                                                                                                               C8-GlcCer                                    loop (left) and Y134 residue (bottom middle) of PP1c.  The blue circles are the 
                                                                                                                                                                                                                                                  (mM)                                      catalytic manganase ions in the active site of the enzyme.

Shared By: