Lars Tjenberg Alzheimers Disease and Amyloid MB KTH by renata.vivien

VIEWS: 2 PAGES: 52

									Alzheimer’s Disease and Amyloid
    β-peptide polymerization: 
    Structures and Strategies




           Lars Tjernberg
       Karolinska Institutet, KASPAC
           Outline of the talk

A. Amyloid
B. Amyloid β-peptide (Aβ) as a target in 
Alzheimer’s disease
C. Inhibition of Aβ polymerization
D. A novel screen for Aβ polymerization inhibitors
Amyloid

 • The term amyloid was first used 
 in the 1850s to describe deposits 
 that were stained with iodine
 • Thought to be composed of 
 starch
 • Main component is protein
 • Thought to be amorphous
 • 1920s: Stains with Congo red => 
       ordered structure
  Congo Red stains amyloid
                                     • Stain tissue with 
                                     Congo red
                                     • View under polarized 
                                     light
                                     • Turn polarizer: red 
                                     becomes green and 
                                     vice versa
                                     • This phenomena is 
                                     called birefringence
                                     • Indicates an ordered 
Plaque core stained with Congo Red
                                     structure
  Amyloid is composed of
       protein fibrils
                             Amyloid fibrils:
                             • can be observed 
                             by electron 
                             microscopy (EM)
                             • are ~8nm wide 
                             • can be isolated 
                    100 nm
                             from tissue
                             • can form from 
                             synthetic peptides
                             • are resistant to 
                             proteolysis
EM by Johan Thyberg, KI
 Amyloid fibrils show a cross-
  β fibre diffraction pattern
                     Peptide chain
    4.8 Å
                                     4.8Å


10-11Å        Fibril direction       10-11Å
           Amyloid proteins
    Protein                     Disease               .
Amyloid b-peptide        Alzheimer’s disease
Gelsolin                 Finnish-type fam. amyloidosis
Islet amyloid polypep.   Type II diabetes
Immunoglobulin l.c.      Light-chain amyloidosis
Lysozyme                 Heriditary syst. amyloidosis
Medin                    Aortic medial amyloid
Serum amyloid A          Secondary syst. amyloidosis
Transthyretin            Senile syst. amyloidosis
                         Fam. Amyloid polyneuropathy
         The amyloid plaque in 
          Alzheimer’s disease
                                        •Core of Amyloid 
                                        b-peptide (arrows)
                                        •Neurofibrillary 
                                        tangles (Tau)
                                        •Dystrophic 
                                        neurites 
                                        •Activated 
                                        microglia and 
                                        astrocytes

D. Selkoe, Nature, 399, A23-31 (1999)
       The Amyloid b-peptide, Ab
            Lumen/
  1.        extracellular   • Derived from the b-amyloid precursor
               b              protein (APP, ~700 residues
                              transmembrane protein)
Membrane       g            • First cleavage by BACE
           Cytosol          • Second cleavage by g-secretase
                              (protein complex containing presenilin)
 2.                         • 40-42 residue peptide
                Ab          • Especially the longer variant (Aβ42)
                              has a strong tendency to polymerize
                            • Identified in1984 (Glenner & Wong)
           Cytosol
                            • Main component of the AD-plaque
       Amyloid plaque cores
          Are composed of fibrils formed from the
          amyloid β-peptide (Aβ)

                           A




   A: Ex vivo plaque core               B: In vitro plaque core


Several lines of evidence indicate that the polymerization process could be
a drug target in Alzheimer’s disease
    Aβ is of importance in AD
• Aβ plaques are always present in AD brain

• Brain Aβ correlates with degree of dementia

• Aβ becomes neurotoxic upon polymerization

• All familial AD mutations => elevated levels of Aβ42

• Extra copy of APP (Down’s syndrome) => early onset AD

• Transgenic mice overexpressing Aβ develop AD-like
   lesions and show impaired memory
     The amyloid cascade
     FAD mutations: APP, PS1&2, other


Aβ binding                          metal ions, 
proteins (ACT,      Aβ-42           pH, other
ApoE, other)

                  Aggregation
Plaques                             Inflammation
      Tau fibrils         Calcium levels
                    ROS

              Neuronal damage, AD
       Aβ  polymerization


  Random coil                β-sheet
   Soluble                        Insoluble
    Nontoxic            Toxic




Monomer Di/Trimer Oligomer     Protofibril    Fibril
Toxic Ab species

        • Ab-fibrils are toxic
        Lorenzo et al. PNAS 91:
          12243-12247 (1994)


        • Protofibrils are toxic
        C. Nilsberth et al. Nat.
          Neurosci. 4: 887-893 (2001)


        • Diffusable aggregates are
          toxic
        M. P. Lambert et al. PNAS
          95: 6448-6453 (1998)
  Amyloid β-peptide as a target in AD
  Aβ becomes neurotoxic upon polymerization
   Possible regimes for pharmacological intervention:


Ø Inhibit production of Aβ: β- and g-secretase inhibitors


Ø Increase clearance: Vaccination

Ø Inhibit Aβ aggregation: Small Aβ-binding compounds 
capable of interfering with Aβ-Aβ interactions
       Anti-amyloid strategies 
                        b-secretase: 
+ No severe phenotype in knock-out mice
- Difficult to develop inhibtors due to large active site
                      g-secretase:
+ Several examples of efficient inhibitors
- Many different substrates besides APP i.e. Notch
- Knock-out lethal in mice

                        Vaccination
+ Vaccination can reduce amyloid burden
- Clinical trials stopped due to  side effects

               Aggregation inhibitors
+ Aβ aggregation has no physiological function
   Crystal structure of BACE 
         with inhibitor 



                                Eight residue transition state
                                inhibitor
                                Ki = 1.6 nM
                                Hong Science 2000

+ KO mice viable      
- Large binding pocket, difficult to find good inhibitors
                  g-Secretase




Ø Is composed of (at least) four transmembrane proteins
Ø Mediates the final catalytic step in the processing of APP 
(C99) into Aβ
Ø Is a potential drug target in Alzheimer’s disease
Ø Has other substrates, e.g. Notch

Specific inhibition of APP processing is necessary!
        Nonsteroidal anti-
  inflammatory drugs (NSAIDs)
                                          • There is an inflammatory 
                                          component in AD
                                          • Large studies have shown 
                                          that some none steroid anti-
                                          inflammatory drugs (NSAIDs) 
                                          decrease the incidence of AD
                                          • The mechanism behind this 
                                          effect is unknown, but might 
                                          be due to lower levels of Aβ-42
                                          • Ibuprofen-treated APP mice 
                                          show reduced Aβ-42 in brain

S. WEGGEN et al. Nature 414, 212 - 216 
                                          • Clinical trials ongoing
(2001) 
    g-Secretase inhibitors in
         Clinical trials
Ø Ibuprofen in phase III

Ø Flurizan in Phase III
• Selective amyloid lowering agent
• Reduced insoluble Aβ in Tg mice and
  improved memory
• Well tolerated
• May decrease cognitive decline
Antibodies against Aβ slow cognitive
   decline in Alzheimer’s disease
              30 AD patients were injected with 
              aggregated Aβ-42
              20 of them generated antibodies

              Patients who generated antibodies 
              showed less decline of cognitive 
              functions and activities of daily living

              Trial stopped since several patients got 
              meningoencephalitis
               C. Hock et al. Neuron 38, 547-554 (2003)

              Clears amyloid

              Patients still produce antibodies

                    New trials ongoing
Aβ immunotherapy                    New vaccination strategy

for treatment of AD               A fragment of Aβ 
                                  is attached to
                                  small beads

 Ø There are several trials 
 ongoing
 Ø Both passive and active 
 immunization are evaluated                               The immune 
                                                          system responds 
 Ø Passive immunization                                   by producing 
 might increase cerebral                                  antibodies direct 
                                                          to Aβ
 amyloid angiopathy (CAA)
 Ø The antigen can be full 
 length Aβ or short fragments     The antibodies 
                                  bind and 
 Ø The peptide can be             sequester Aβ
 conjugated to a carrier 
 protein or micro-beads
                                Professor Bengt Winblad, Karolinska 
                                University Hospital, Huddinge
Inhibition of Aβ polymerization


• Aβ polymerization is thought to be
  nucleation-dependent
• Several different Aβ species may be toxic
• Inhibit as early as possible
• No high resolution structure
   An important region for 
       Aβ-Aβ binding
DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA

                   1. Synthesize short
                   peptide sequences
                   corresponding to
                   segments of Aβ on a
                   membrane
                   2. Incubate membrane
                   with labeled full-length
                   Aβ
                   3. Quantify binding
                   Ø The region Aβ9-22
                   is important for Aβ-Aβ
                   binding
               Tjernberg et al. J. Biol. Chem. 271:8545-8
Aβ 16-20 (KLVFF) is important 
     for Aβ-Aβ binding
       Truncated variants of 
       the central binding 
       decapeptide were 
       synthesized and 
       incubated with radio-
       labeled Aβ.
        Peptides containing the 
       KLVFF sequence were 
       found to bind Aβ. 


        Biacore study
        The peptide 
        AcKLVFFAAC was 
        immobilized on the 
        sensorchip and Ab 
        was injected.              Radio-labeled KKLVFF 
                                   was used to probe the 
        Lower trace: Cys           KLVFF binding site
 Aβ fibril formation can be 
inhibited by short peptides

                    Synthetic Aβ was
                    incubated in buffer
                    in the absence (A)
                    or in the presence
                    (B) of a short
                    peptide (QKLVFFA).


                    Tjernberg et al. J. Biol. 
                    Chem. 271:8545-8
Pentapeptides composed of D-amino 
 acids can inhibit Aβ fibril formation




  Pentapeptides were              Sequences similar to 
  synthesized on a                                            Aβ was incubated 
                                  a reversed Aβ 16-20         with D-peptides:
  membrane and incubated          sequence show 
  w. radio-labelled KLVFF         strong binding              A=none, B=yyrrl,
                                                              C=lflrr, D=yfllr
               Tjernberg et al. J. Biol. Chem. 272:12601-5.
Short Aβ-fibril inhibitors have effect in vivo
Ø    iAβ5 blocks Aβ-42 
     neurotoxicity in cell     Saline         iAβ5P
     culture and fibril 
     formation in rat brain


Ø    iAβ5 dissasembles 
     fibrillar deposits in 
     rat brain and 
     prevents/reverses 
     neuronal shrinkage

E.M. Sigurdsson et al. Nat.    Partial decrease of 
     Med. 4:822-826 and J.
     Neuropathol. Exp.
                               amyloid deposition
     Neurol. 59:11-17                                     Escape latency
                              Chacon et al. Molecular
Ø    Modified molecule        Psychiatry (2004) 9; 953
                              -961. 
                                                         iAβ5P improves 
     crosses BBB
                                                         working memory 
                                                         performance
                  Clinical trials Phase I => no toxicity
Curcumin, a small organic compound 
     can affect amyloid in vivo




  Curcumin crosses the BBB and binds to plaques
         Yang, et al. J. Biol. Chem. (2005);280:5892-5901
     Curcumin suppresses amyloid 
accumulation in aged APP transgenic mice
                                                   Tg2576 mice were 
                                                   placed on chow 
                                                   supplemented w. 
                                                   curcumin at 17 
                                                   months of age 
                                                   and brains were 
                                                   removed after 22 
                                                   months
                                                   A-C = control
                                                   D-F = Curcumin




                                                   G. Image analysis 
                                                   of plaque burden
                                                   H. ELISA 
                                                   measurement of 
                                                   guanidine- soluble 
                                                   Aβ

                 Yang, F. et al. J. Biol. Chem. 2005;280:5892-5901
Curcumin inhibits formation of 
       Ab oligomers




          Yang, F. et al. J. Biol. Chem. 2005;280:5892-5901
A small organic Aβ-polymerization
    inhibitor in clinical trials
 •   Glycosaminoglycans (GAGs) bind to Aβ, promote fibril
     formation and are present in amyloid deposits
 •   Low molecular weight GAG mimetics bind to Ab and
     inhibits fibril formation
 •   APP tg mice treated with 3-amino-1-propanesulfonic
     acid (3APS) show reduced amyloid burden
 •   Phase II: 3APS is safe, tolerated and reduces CSF Aβ
 •   Phase III studies ongoing



        P. Aisen et al. Neurology 2006; 67:1757-1763
    Assays for Aβ polymerization
           Assay                          Principle
Dye binding, Thioflavin T    ThT shifts fluorescence spectrum 
(ThT) and other              upon binding

Circular dichroism (CD)      Aβ secondary structure changes 
spectroscopy                 upon polymerization
                              
Light scattering             Particles scatter light

Fluorescence correlation     The diffusion time changes upon 
spectroscopy (FCS)           polymerization

Atomic force or electron     Visualization of the aggregates
microscopy (AFM or EM)

      ThT-binding is the most frequently used assay
                        The ThT assay
  A                                                 C
                                    ThT




 Aβ was incubated +/- the Collagenous                   Turbidity
 Alzheimer Amyloid plaque Component 
 (CLAC) Söderberg et al. FEBS J. 272: 2231-36
                                                D
  B
                                   ThT




 Preformed Aβ fibrils were incubated +/- CLAC

Extensive aggregation => ThT assay gives false low values
                  The ThT assay



Short Aβ peptides were incubated 
and assayed for ThT binding. The 
nonapeptide QKLVFFAED showed 
the highest ThT signal. 

          The samples were subjected 
          to electron microscopy.
          A)    HQKLVFFAED
          B) HHQKLVFFAE
          C)       QKLVFFAED          Tjernberg et al. J. Biol. Chem. 274:12619-25

            ThT can give false positive results
                         CD and FCS

                     CD 217 nm (β)



                   CD 200 nm (random)                2 min            40 min




80 µM Aβ was incubated  90 min in          80 µM Aβ was incubated in the 
TBS (open symbols) or                      presence of rhodamine labeled Aβ
“CD buffer” (filled symbols)               Upper panel: Fluorescence intensity vs 
Inset: Data was recorded up to 20 h and    time.
the signal at 217 (β-sheet)  and at 200    Lower panel: The corresponding 
nm (random coil) was plotted. K Berndt     intensity autocorrelation function. 
                                           A Pramanik

        Wanted: A simple, rapid and sensitive assay
Ab oligomers can be detected by
        specific antibody
                  A-B: Single neuron labeled 
                  with oligomerspecific antibody 
                  Fluorescent (A) 
                  or peroxidase-conjugated (B) 
                  secondary antibody




                  C: Dot blot analysis of soluble 
                  Ab in AD and control brain.
            HTS-Assay for Aβ 
         polymerization inhibitors

                                        1
                                        2
     1. Find Aβ-Aβ interacting motif    3
                                        4
                                        5
                                        6




2. Design a peptide that mimics
these interactions and label it with
a donor and an acceptor
(fluorescence resonance energy
transfer, FRET)

    3. Incubate with compound library
    and read fluorescence
Constrained peptides containing the 
  HQKLVFFAED motif form fibrils
             C HQKLVFFAED Y
                           N
                           G
             C DEAFFVLKQH K
Amyloid fibril formation from a 
     tetrapeptide, KFFE




 EM                  Congo Red                          Model of a beta-sheet 
                                                     composed of four antiparallel 
                                                          KFFE peptides

       Tjernberg, L. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:43243-43246
The turn-motif is of importance 
 for the secondary structure




           CD-spectra:
      o=KFFEYNGKKFFE => β-sheet
      ▲=KFFEAAAKKFFE => random
The peptide KFFEYNGKKFFE forms 
      a β-hairpin in solution




   B. Persson

        Molecular modeling in agreement with NMR data
 HTS-Assay for Aβ polymerization inhibitors


                                                              1
                                                              2
     1. Find Aβ-Aβ interacting motif                          3
                                                              4
                     K L V F F                                5
                                                              6




2. Design a peptide that mimics         K L V F F A E Y
                                                          N
these interactions and label it with                      G
a donor (W) and an acceptor             E A F F V L K K
(dansyl) (fluorescence resonance
energy transfer, FRET)

    3. Incubate with compound library
    and read fluorescence
                          FRET


F
    lmax          lmax 
    Donor         Acceptor                 9 M 
                                           urea        TBS




                                l
                                    A probe containing 2 KLVFFAE motifs, 
       Close; energy transfer       Trp (donor) and dansyl (acceptor) was 
                                    synthesized and emission scans were 
       Far away; no transfer
                                    recorded
Urea denaturation of inhibitor probes




      The acceptor and donor fluorescence was 
      measured at different urea concentrations 
      and the ratio calculated

   These probes could be useful for screening!
 Curcumin gives dose dependent 
changes in fluorescence spectrum
                 10


                 3



                                              0

                 1


                                           1
                0                          3
                                          10



The probe was incubated 2h in the presence 
of 0, 1, 3 or 10 uM curcumin
   The probe shows decreased acceptor 
fluorescence in the presence of curcumin




    The probe (0.5 uM) was incubated in the presence of 
        curcumin (0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5 or 2uM) 

   The inhibitor interacts with the 
Curcumin does not absorb the 
light emitted from the acceptor
                           Buffer
                         Curcumin




    A solution of curcumin (2.5 uM) was placed in 
    the emission path, probe concentration 0.5 uM.
                   CD-spectroscopy
 The probe shows decreased β-sheet 
     in the presence of curcumin




                       200                  220          240 nm
   The probe (10 µM) was incubated in the absence (blue trace) or in the 
   presence (green trace, t = 0, red trace, t = 30 min) of 36 µM curcumin

                                Curcumin          Unordered 
β-sheet                                           conformation
SEC - fluorescence detection
 The probe was dissolved in 50% acetonitrile and injected onto a SEC 
 column. The signal at 520 nm was recorded (acceptor emission).




       Broken line: direct excitation of acceptor (350  nm) 
       Full line:       excitation of donor (290 nm)
Conclusion: The probe is a monomer and shows intramolecular FRET
        Acknowledgements
Karolinska Institutet:
Lars Terenius     Rudolf Rigler Johan Thyberg

The Picower Institute for Medical Research:
David Callaway

Swedish University of Agricultural Sciences:
Jan Johansson

Dainippon Sumitomo Pharma
            Conclusions

• Amyloid is bad
• The amyloid b-peptide is important in AD
• The amyloid b-peptide can be a therapeutic 
target in AD
• There are drugs aimed at lowering Ab-levels 
in clinical trials
• Still more to learn

								
To top