A yeast catabolic enzyme controls transcriptionnal memory
Ioannis Zacharioudakis, Thomas Gligoris and Dimitris Tzamarias
Institute of Molecular Biology & BiotechnologyFoundation of Research and Technology
Biology Department, University of Crete 71110 Heraklion, Crete
Introduction (1)
• Postulat : les modifications de la chromatine peuvent persister à travers la mitose et la méiose. Mémorisation d’états transcriptionnels. • Est-ce que la transmission de ces marques chromatiniennes peut se faire indépendamment de facteurs agissant en trans ? • Les levures et leur « mémoire cellulaire adaptative » ont été choisi comme système d’étude. Question : la « mémoire galactose » de la levure a-t-elle une base chromatinienne ou cytoplasmique ? Quels en sont les mécanismes ?
Introduction (2)
• Levure : la levure est un champignon unicellulaire. Ces sont des microorganismes eucaryotes qui ont des caractéristiques propres à ce type cellulaire et d’autres plus spécifiques aux levures elles-mêmes. De forme variable selon l’espèce, elles se multiplient par bourgeonnement ou par scissiparité.
• Gal4 : c’est un facteur de transcription. Il a été bien caractérisé par des expériences d’activation du gène lacZ. Protéine de 881 acides aminés possédant un domaine de fixation à l’ADN et un domaine effecteur (activation).
Analyse de la mémoire transcriptionnelle
Analyse de la mémoire transcriptionnelle (1)
• Cellules grandies sur glucose puis transférées sur galactose -> Gal1 activé lentement.
• Cellules de la progéniture grandies sur glucose et réexposées au galactose -> Gal1 activé rapidement. Glu-Gal : activation binaire. Gal-Glu-Gal : activation uniforme.
Analyse de la mémoire transcriptionnelle (2)
La gradation de la réponse des levures Gal-Glu-Gal indique que chaque cellule de cette population acquiert une mémoire galactose, cette dernière étant caractérisée par un taux d’activation transcriptionnelle des gènes GAL accéléré.
Origine de la mémoire transcriptionelle : a-t-elle une base chromatinienne ou cytoplasmique ?
Origine de la mémoire transcriptionelle (1)
• Proposition : la réactivation rapide du promoteur GAL1 pourrait venir de chromatine modifiée (variant d’histone, complexe de remodelage Swi/Snf).
Expérience : utiliser une approche faisant intervenir des hétérokaryons pour tester cette hypothèse.
Hétérokaryon: fusion de cellules animales par addition de PEG, favorisant adhésion puis fusion de la membrane plasmique d’une cellule à celle des cellules adjacentes. La plupart des cellules animales et des noyaux finissent aussi par fusionner. Il y a obtention de cellules viables contenant les chromosomes des deux parents. La fusion de cellules génétiquement différentes produit une cellule hybride appelée hétérokaryon.
Origine de la mémoire transcriptionelle (2)
• La mutation du gène kar1-1 abolit la fusion nucléaire. • Utilisation de cette propriété pour générer des hétérokaryons dérivés de cellules traitées différamment.
Origine de la mémoire transcriptionelle (3)
Croisement :
Cellules KAR1 naïves portant GAL1-GFP X Mutants kar1-1 pré-exposés au Gal sans GAL1 marqué à la GFP Activation rapide du promoteur GAL1-GFP.
Origine de la mémoire transcriptionelle (4)
Croisement : Cellules KAR1 naïves portant GAL1-GFP X Mutants kar1-1 naïfs sans GAL1 marqué à la GFP Activation de GAL1-GFP beaucoup plus lente.
Origine de la mémoire transcriptionelle (5)
• Les hétérokaryons portant des noyaux « naïfs » n’ayant pas été pré-traités par le galactose avant leur placement sur le glucose, ont exprimés rapidement GAL1-GFP quand ces cellules ont été croisé avec d’autres prétraitées au galactose. • Cette activation s’est donc faite dans un environnement cytoplasmique ayant été exposé au galactose avant placement sur milieu glucose.
Ceci suggère fortement que la mémoire transcriptionnelle n’est pas dépendante de régions chromosomales en cis, mais davantage de facteurs agissant en trans.
Rôle de Gal3
Rôle de Gal3 (1)
• La transcription des gènes GAL dépend de l’activateur transcriptionnel Gal4. • Gal4 est inactif de par son interaction avec le régulateur négatif Gal80. • Exposition au galactose : séquestration de Gal80 dans le cytoplasme grâce à un complexe galactose / ATP / Gal3. • Gal4 active les gènes GAL -> transcription entre autre de Gal3 -> boucle de régulation positive Gal3-Gal4. Rôle clef de Gal3 dans l’activation de Gal4. Gal3 est-il le facteur cytoplasmique préservant la mémoire galactose ?
Rôle de Gal3 (2)
• Tester l’hypothèse : utiliser des cellules n’ayant pas GAL3.
• Problème : l’activation transcriptionnelle de gènes GAL et la croissance cellulaire ne se font pas dans les cellules gal3Δ après une première exposition au galactose. • Solution : protocole de « gene disruption » pour supprimer le gène GAL3 à partir de cellules sauvages grandies continuellement dans un milieu galactose. Génération de mutants gal3Δ exprimant complètement Gal1-GFP. Gal3 ne semble pas indispensable à l’activation des gènes GAL.
Rôle de Gal3 (3)
• Les mutants gal3Δ exprimant Gal1-GFP gardent la capacité à réactiver la transcription de Gal1GFP rapidement et uniformément. Ceci indique clairement que Gal3 n’est pas responsable de la mémoire galactose.
Qui est alors le responsable de la mémoire transcriptionelle ?
Identification du responsable de la mémoire transcriptionelle (1)
• Galactokinase Gal1 : homologue proche de Gal3 interagissant avec Gal80 in vivo.
• Observation : après divisions cellulaires dans le milieu glucose, la baisse de Gal1 dans les cellules pré-grandies dans du galactose corrèlent avec la perte de la mémoire galactose.
• Hypothèse : Gal1 pourrait avoir une fonction Gal3-like et séquestrer Gal80, permettant à Gal4 de réactiver la transcription dans les cellules de la progéniture.
Identification du responsable de la mémoire transcriptionelle (2)
Croisement : Cellules KAR1 naïves portant GAL1-GFP X Double mutants kar1-1, gal1Δ pré-exposés au Gal sans GAL1 marqué à la GFP Les hétérokaryons n’ont pas répondu rapidement à l’induction au galactose.
Identification du responsable de la mémoire transcriptionelle (3)
• Analyse des cinétiques de réactivation d’une souche mutante gal1Δ exprimant Gal7GFP. Les mutants gal1Δ Gal-GluGal ne réactivent pas rapidement le gène GAL7 et ont des cinétiques d’activation identiques aux cellules Glu-Gal.
Identification du responsable de la mémoire transcriptionelle (4)
• Expression constitutive de GAL1 dans des cellules Gal-GluGal ou Glu-Gal. Cinétiques d’activation de la transcription de Gal7-GFP identiques entre les cellules naïves ou celles déjà exposées au galactose. Preuve supplémentaire que Gal1 est bien le facteur cytoplasmique.
Identification du responsable de la mémoire transcriptionelle (5)
• Savoir si Gal1 a une activité Gal3-like : expression de GAL3 à partir du promoteur de GAL1 dans des cellules gal1Δ prégrandies dans du galactose.
• Induction rapide de Gal7-GFP dans les cellules portant GAL3 comparée à celles portant un vecteur. Gal1 est donc absolument requis pour la mémoire galactose.
Conclusion
Conclusion (1)
• La mémoire galactose réside donc sur l’accumulation de la galactokinase Gal1, qui est ensuite transmise aux générations successives via le cytoplasme.
• Une seconde exposition met en place une boucle de feedback positive Gal1-Gal4 qui libère rapidement le potentiel d’activation de l’activateur Gal4. • La réactivation rapide de la transcription des gènes GAL dépend de la fonction Gal3-like de Gal1.
Conclusion (2)
• A propos des autres hypothèses… Le variant d’histone H2A.Z. Une étude a montrée une translocation, en périphérie du noyau, du cluster de gènes GAL dépendante de H2A.Z, et sa persistence après croissance dans du glucose serait la base de la mémoire galactose. Aucune preuve directe n’a été apporté et cette caractéristique topologique pourrait seulement être une conséquence de dynamiques de relocalisation chromosomique. Le complexe Swi/Snf. Il serait requis pour la réactivation rapide des gènes Gal. Son implication est évidente pour la mémoire transcriptionelle après une génération, mais sa présence reflèterait davantage son rôle de co-activateur dans la transcription.