microarray

Document Sample
microarray Powered By Docstoc
					MIKROARRAY TEKNOLOJİSİ


                          Veysel Sabri HANÇER
Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı
                                  2602040083
                               vshancer@yahoo.com
             EŞ ANLAMLILAR

   Biochip
   DNA chip
   DNA microarray
   Gene array




                             2
Neden bu teknolojiye ihtiyaç duyuldu?

   Bir organizmada bulunan binlerce gen ve bu
    genlerin ürünleri olan RNA ve proteinlerin
    ortaklaşa fonksiyon görmeleri hayatın
    gizemini oluşturmaktadır.




                                             3
Milyonlarca DNA bazının dizilişini bilmek,
genlerin ne yaptıklarını, nasıl çalıştıklarını,
hücreden organizmaya giden aşamaları,
hastalıkla hangi mekanizmaların değiştiğini,
yaşlanmanın nedenlerini vs. öğrenmek
anlamına gelmez.



                                                  4
   Bir hücrenin tipi veya içinde bulunduğu evre, o
    hücrede eksprese olan gen profili yani sahip
    olduğu genlerin mRNA düzeyindeki değişiklikleri
    ile belirlenir.
   Daha önce tanımlanmamış birçok genin
    ekspresyon profili incelenerek ve diğer bilinen
    gen profilleri ile karşılaştırarak o genlerin olası
    fonksiyonları hakkında ipuçları elde edilmektedir.


                                                     5
   Bu bilgiler metabolik yollara ait şemalar
    ile birleştirildiğinde , değişen şartlar
    altında bu yolların nasıl etkilendiği
    öğrenilebilmektedir.
   Fakat tüm genleri eş zamanlı çalışmak
    oldukça karmaşık bir olaydır ve geniş
    kapsamlı teknolojilere ihtiyaç vardır.

                                           6
   Bir array, nükleik asit örneklerinin düzgün bir
    şekilde sıralanması ile oluşmaktadır.
   Bilinen ve bilinmeyen DNA örneklerinin baz
    eşleşmesi özelliğine göre hibridizasyonu için
    uygun bir ortam sağlayarak bilinmeyen DNA
    ların tanımlanabilmesi için kullanılır.



                                                 7
                               Affymetrix Gen Çipleri
                                      Hibridize edilmiş prob              *         *
GeneChip Prob Array’i                                           *              *
                                                                     *
                            Tek zincirli hedef RNA
                                    Oligonükleotit prob
                                                                                        24µm



                                                          Spesifik bir oligonukleotidin
    1.28cm                                                Milyonlarca kopyası



                                                          >200,000 farklı
                                                          tamamlayıcı prob




              Hibridize edilmiş prob dizilimi
                                                                                               8
   Fikse edilen örneğe ait noktanın büyüklüğüne göre
    makroarray ve microarray olmak üzere ikiye ayrılırlar.
    300 mikron ve daha büyük noktacıklardan oluşan
    makroarray,jelde ve blot tarayıcılarda kolayca görülür.
    Mikroarrayde ise örnek çapı 200 mikrondan küçüktür.
   Bu nedenle bir array üzerinde binlerce örnek bulunabilir.
   Microarray çalışmalarında özel robotlara ve görüntüleme
    donanımlarına ihtiyaç vardır.


                                                           9
   Microarray yüksek hızda çalışan robotlar
    tarafından imal edilmektedir. Genellikle cam,
    bazende naylon yüzeyler üzerine DNA dizisi
    bilinen problar dizilir.




                                                    10
   Cam yüzeyin naylon ve nitroseluloz filtrelere göre
    avantajları vardır.

   Örneğin deneyi minyatürize eder, florasan
    boyaların kullanımına imkan verir, yüzey sert
    olduğu için örnek difüze olmaz böylece lazer
    analizine imkan doğar.



                                                    11
   Cam yüzey nötr pH’da DNA ile iyonik bağ
    oluşturan silan, DNA nonkovalent geridönüşmez
    şekilde bağlanan nitroseluloz temelli polimer veya
    polilizin ile kaplanabilir.

   Bu kaplama ile DNA örnekleri cam yüzeyde fikse
    edilmektedir.



                                                    12
ARRAY İKİ ŞEKİLDE ÜRETİLEBİLMEKTEDİR




                                       13
                              1.Fotolitografi

Silikonize edilmiş olan cam yüzeyde
oligonukleotit sentezi gibi bir fotokimyasal
reaksiyon gerçekleştiği sırada morötesi ışık
kaynak olarak kullanılır.




                                               14
Bir engelden geçirilen bu ışık aşamalı olarak
reaksiyonu devam ettirir. Bu engelde, birkaç
mikrometre genişliğinde ve camın cm2 sinde
birkaçyüzbin probun yer alabileceği açıklıklar
vardır.




                                                 15
Ancak bu insitu sentez teknolojisinin
dezavantajı 25 nükleotit uzunluk ile sınırlı
olmasıdır.




                                               16
                       2.Mekanik Fiksasyon
Ink-jet veya XYZ ekseni üzerinde hareket
kontrolü olan bir cihaz yoluyla örneklerin
fiziksel olarak yüklenmesidir.

Yüzey ile direkt ilişki ve çok küçük miktarda
sıvı kullanılması nedeniyle buharlaşma ve
kontaminasyon problemleri görülmektedir.



                                                17
İKİ TİP ARRAY VARDIR




                       18
1.   500-5000 baz uzunluğundaki cDNA probları
     robotlar ile cam gibi katı yüzeylere tutturulur. Bir
     seri hedef bu yüzeye uygulanır.

     Stanford Üniversitesinde geliştirilmiş olan bu
     yöntem ‘geleneksel DNA microarray’ olarak kabul
     edilmektedir.



                                                            19
2.   20-80 mer oligonükleotit veya peptit nükleik asit
     (PNA) problar sentezlenerek dizilirler. Array,
     işaretli DNA ile hibridizasyona sokularak
     komplementer dizi varlığı/miktarı tanımlanır.
     Bu yöntem fotolitografik ürünler üreterek satan
     Affimetrix Inc. tarafından geliştirilmiştir.




                                                         20
                    mRNA saflaştırılması ve RT
   mRNA 1-2 mikrogram olacak şekilde saflaştırılır.
    mRNA daha dayanıklı olan cDNA molekülüne
    revers transkripsiyon ile çevrilir.
   Bazı RNA ların bir kısmı cDNA’ya çevrilebilmekte ve
    tam olmayan bu sentez arraye bağlanmasını
    bozmaktadır.


                                                      21
   Bu sorun, uçtan yapılan sentez yerine rastgele
    yapılan primerler ile yapılan cDNA sentezinin
    uygulanmasıyla çözülmektedir.
   Fakat bu da gereksiz tRNA ve rRNA’nın da örnekte
    yer almasına neden olmaktadır.




                                                 22
          cDNA’nın florasan işaretlenmesi

   Microarray’e bağlanan cDNA’nın görülebilmesi,
    varlığını belli eden bir ‘reporter’ molekülle
    işaretlenmesine bağlıdır. İncelenecek örnek iki
    farklı boya ile boyanır. Genelde rodamin/floresin
    veya Cy3/Cy5’dir.


                                                   23
               Microarray ile Hibridizasyon

   Array üzerinde bulunan binlerce DNA dizisi üzerine
    laboratuarda hazırlanmış cDNA’lar uygulanır.cDNA
    komplementerini bulduğu noktada hibridize olur
    ve florasan sayesinde bu noktayı görünür kılar.
   Array üzerindeki her bir nokta ayrı bir deney
    olarak yorumlanır.

                                                  24
   Bazı bakteriler ve S. cerevisiae’de bilinen
    her genin genomik DNA’sını ve olası ORF
    yapısını çalışmak mümkündür !!!!




                                              25
       Hibridize edilen arrayin taranması

   Tarama okuyucu denilen sistem ile yapılır.
    Okuyucu, bilgisayar ile kontrol edilen ‘inverted
    scanning fluorenscent confocal’ mikroskoptur ve
    lazer ile çalışır.




                                                  26
   Proba bağlanmış olan florasan işaretli moleküller
    lazer ile uyarıldıklarında ışıma yaparlar. Array
    tarayıcının amacı, komplementer noktalara
    bağlanan probun yaydığı ışını tespit etmektir.




                                                    27
                                cDNA dizilimleri: süreç
Çipin Yapımı:
   PCR                PCR saflaştırması ve
                      hazırlanması

SLAYTLARIN                                     BASMA
HAZIRLANIŞI

RNA hazırlanışı:

 Hücre kültürü ve                            İŞLEM SONRASI
 ekim
                    DİZİ MELEZLEMESİ
  RNA IZOLASYONU


                                              VERİ ANALİZLERİ
cDNA ÜRETİMİ          PROB ETİKETLENİŞİ

                                                             28
         Taranan Görüntünün Yorumlanması


   Kırmızı sarı yeşil yoğunlukları ölçülerek
    değerlendirmeler yapılır. Sarı noktacıklar her iki
    hücre grubunda da eşit miktarda cDNA
    bağlandığını gösterir. Florasan yoğunluğu mRNA
    yoğunluğunu belirtmektedir.


                                                    29
                                                                      tarama
cDNA klonları           cDNA dizilimleri
                                              lazer 2       lazer 1



                 PCR ürün çoğaltımı
                                                             emisyon
                 saflaştırma
   yazılım
                              mRNA (hedef)




                                             Yüzey görüntüsü ve normalizasyon


                0.1nl/nokta




 mikrodizilim


                                                        analizler
                                                                         30
   Affimetrix arraylerde genelde her gen için 20 prob
    vardır. Standardizasyon için aktin G6PDH gibi
    genlerin ekspresyon düzeyleri kullanılır.

   Diğer arraylerde standardizasyon daha önemli bir
    sorundur. Standart deney amacına göre
    değişmektedir.

                                                   31
   Sıklıkla northern blot, real-time PCR, immün
    boyama gibi yöntemlerle sinyallerin doğruluğunu
    kontrol etmek gerekmektedir.




                                                32
Affymetrix çip fotoğrafı: düşük
                    çözünürlük
          Processing the data
• For each experiment, spot intensities are translated into
  fold changes and displayed as different intensities of
   – Red for log2(Cy5/Cy3)>0
   – Green for log2(Cy5/Cy3)<0




                                                              34
                   Cluster analysis
• In Hierarchical Clustering, Distances are used to sort genes and experiments
  into dendrograms (trees).




                                                                                 35

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:0
posted:5/3/2013
language:Unknown
pages:35