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Aislamiento_ selección_ conservación de los microorganismos

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Aislamiento_ selección_ conservación de los microorganismos Powered By Docstoc
					      UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
        FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
          Escuela Bioquímica y Farmacia


     PROYECTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL



     Aislamiento, selección, conservación de los
microorganismos aislados de la elaboración de vino de
                       Arazá




                                           Integrantes:
                                       Andrade Paulette
                                         Carrasco Karen
                                           García Judith
                                          Herrera Carla




                       2010-2011




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INDICE
1.            ANTECEDENTES:.....................................................................................................3
2.            PROBLEMA ............................................................................................................3
3.            JUSTIFICACION .......................................................................................................4
4.            OBJETIVO GENERAL: ...............................................................................................4
5.            MARCO TEÓRICO ...................................................................................................4
     6.2.     VINO DE FRUTAS ............................................................................................................ 5
     6.3.     FERMENTACIÓN DE LOS ZUMOS DE FRUTAS ................................................................ 5
     6.4.     FERMENTACIÓN DE PULPA DE FRUTAS ......................................................................... 5
     6.5.     ARAZÁ ............................................................................................................................ 6
     6.6.     CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL FRUTO DE ARAZÁ EN ESTADO MADURO ..... 7
     6.7.     BIOQUIMICA DE LA FERMENTACION: ............................................................................ 7
     6.8. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA BIOQUÍMICA DE LA LEVADURA Y LA
     FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA .................................................................................................. 7
     6.9.     PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA ............................... 8
     6.10. CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE LEVADURAS ........................................................... 8
7.            MARCO METODOLOGICO.......................................................................................8
     7.1.     DESCRIPCION DEL PROCESO PARA LA ELABORACION DEL VINO ................................... 8
     7.2.     PREPARACIÓN DEL MOSTO: .......................................................................................... 9
              7.2.1.  CONSIDERACIONES DE LA MATERIA PRIMA (ARAZÁ) PARA EL MOSTO EN
              LA ELABORACION DE VINO DE ARAZÁ: .......................................................................... 9
              7.2.2 MEZCLA EN LAS SIGUIENTES PROPORCIONES: ................................................... 10
              7.2.3 CARACTERIZACIÓN ESPERADA DEL VINO DE ARAZÁ ........................................... 10
     7.3. FUNDAMENTO DE LOS METODOS DE AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CONSERVACION DE
     LAS CEPAS FERMENTADORAS EN EL VINO DE ARAZÁ ............................................................ 10
     7.4   TECNICA A UTILIZAR EN EL AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CONSERVACION DE CEPAS DE
     LA FERMENTACION PARA ELABORACION DE VINO DE ARAZÁ ............................................... 13
              7.4.1.         TECNICA PARA AISLAMIENTO...................................................................... 13
              7.4.2.         METODO DE ENRIQUECIMENTO ................................................................. 13
              7.4.3.         TECNICA DE AISLAMIENTO EN MEDIO SELECTIVO ...................................... 14
              7.4.4.         CONSERVACION........................................................................................... 14
8.            BIBLIOGRAFIA: .................................................................................................... 14
9.            ANEXOS: ............................................................................................................. 15




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1. ANTECEDENTES:
En las regiones de clima cálido húmedo existe una enorme variedad de especies frutícolas
tropicales nativas de gran potencial que, si se explotan racionalmente, podrían contribuir al
desarrollo local. Entre estas frutas regionales, se encuentra el arazá (Eugenia stipitata) que
despierta cierto interés por las cualidades organolépticas del fruto y por el índice de
producción de la planta.
El arazá es una especie que se adapta a suelos de baja fertilidad, así como a las variaciones
climáticas de la región Su fruto suculento posee un aroma y sabor agradable, el mismo que
puede ser consumido en jugos, dulces, néctares, jaleas, licores, yogurt, etc.

La planta produce su fruto durante el año entero y dependiendo del manejo de la plantación,
existe problemas en la post cosecha por la abundante producción y suele existir desperdicio.
Siendo una fruta altamente perecible; y principalmente debido a sus características
organolépticas especiales se percibe la posibilidad de generar una alternativa tecnológica para
el aprovechamiento de la fruta y uno de ellos es aplicar procesos fermentativos como método
de transformación y conservación de la fruta.

En investigaciones recientes sobre el análisis de la actividad de levaduras y la utilización de
sustratos de jugos de frutas tropicales como la piña, mango y papaya, se encontró un alto
grado de adaptabilidad de las levaduras en estos sustratos, la piña fue la fruta que mejores
resultados dio para la elaboración de vinos de fruta tropical, para el mango y papaya se debe
aumentar la cantidad de azúcar.

2. PROBLEMA

En muchas de las regiones de nuestro país se lleva a cabo la elaboración de vinos de frutas
tropicales y exóticas de manera artesanal y mediante una fermentación espontánea que llega
a ser un proceso relativamente largo de tiempo.
En algunos procesos fermentativos naturales si las condiciones no son las adecuadas el vino no
posee las características de flavor propias de la fruta que se va a fermentar como el aporte de
elementos aromáticos y la intensidad de sabor.
Siendo la uva la materia prima ideal para la elaboración de vino, el desarrollo satisfactorio de
las levaduras en especial la de la especie de Saccharomyces cerevisiae encargadas de la
fermentación en jugos de frutas distintos al de la uva está limitado por la alta acidez y bajo
contenido de azúcar del arazá.

En el país no se venden comercialmente cultivos iniciadores (starter) para la fermentación de
otras frutas que no sean las de la uva para la elaboración de vino.
La necesidad de asegurar la fermentación y la calidad del producto, ante el hecho de que hay
un gran número de variables que intervienen en una fermentación espontánea, favorece el
uso de las levaduras aisladas, identificadas y conservadas.
Todas las fábricas productoras de vino de cualquier fruta utilizan starter comercial que se
importan de diferentes países principalmente europeos, pero que no se encuentran adaptadas
a las condiciones de fermentación del arazá

Para la fermentación del arazá a vino no existen cultivos iniciadores con cepas nativas, se
utilizan cepas comerciales de Saccharomyces cerevisiae, microorganismo aislado comúnmente
de las diferentes variedades de uva, por lo que se obtienen bajos rendimientos y falta de
características sensoriales propias de esta fruta en contraste a utilizar una cepa nativa



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adaptada a las condiciones del mosto y que ha sido aislada directamente del proceso de
fermentación natural de esta fruta

3. JUSTIFICACION

En el Ecuador, la importación de vinos se ha convertido en el negocio rentable.
En nuestro país no existe una cultura vinícola y menos de frutas exóticas como es el ARAZA,
solo se conoce productores artesanales de este tipo de productos.
El ARAZA es una fruta exótica tropical que contiene un alto contenido de agua es lo que es muy
perecible, y por ello nos hemos visto en la necesidad de aplicar un proceso tecnológico y
científico para evitar su perdida y aumentar su valor agregado.
El ARAZA no es una fruta estacionaria por lo que no existirían problemas de producción y se
elaboraría sin importar la estación en la que nos encontremos.
El ARAZA es originario de la región amazónica occidental comprendida entre los ríos Marañón
y Ucayali y en las proximidades de Requena y el nacimiento del río Amazonas. Su origen
corresponde a uno de los 5 centros de diversidad que se encuentran en la Amazonia.
Lo que nos indica que en nuestro país tenemos ARAZA en suficiente cantidad para la
fabricación de vino de esta fruta exótica y dado el gran desperdicio que se produce en la fruta
una alternativa tecnológico para el aprovechamiento de la fruta seria la fabricación de vino.
Como es un producto perecedero debido a su gran contenido de agua se puede aplicar
procesos fermentativos como método de transformación y conservación de la fruta.
En nuestro país las pocas fabricas productoras de vinos utilizan starder comercial que se
importan de otros países pero no se encuentran adaptadas a las condiciones de fermentación
de frutas exóticas y menos con un pH bajo como es el caso del ARAZA.
Por lo que seria un producto innovador con sabor característico y muy agradable que gustaría
mucho al consumidor.

4. OBJETIVO GENERAL:

Aislar, seleccionar y conservar los mejores microorganismos resistentes a pH ácidos, aislados
del mosto de arazá (fruta tropical).

5. OBJETIVO ESPECIFICO:

       Elaboración del mosto de arazá.
       Aislar las mejores cepas fermentadoras del arazá en la segunda y tercera etapa de
        fermentación.
       Seleccionar las mejores cepas con criterio de rendimiento y capacidad de adaptación.
       Caracterizar los microorganismos por biotipo.
       Preservar las cepas seleccionadas.


5. MARCO TEÓRICO
Vinificación es el proceso que transforma el jugo de uvas en vino, al originarse la fermentación
alcohólica mediante la acción de las levaduras. La fermentación, convierte los azúcares que
contiene el jugo de uva en alcohol.
El vino es, por lo tanto una bebida que resulta de la fermentación del jugo de uva por las
levaduras adicionadas, con el procedimiento controlado. Esta bebida ha sido producida desde
tiempos antiguos. La diversidad y la calidad del vino son el resultado del tipo de uva, la calidad
distintiva del suelo, el clima y los procesos diseñados en las diferentes partes del mundo.


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Todos los vinos son hechos en un proceso común, con variaciones de acuerdo al tipo que se
pretende producir.

        6.1.1.LEVADURAS Y EL VINO

 Las levaduras juegan un papel trascendental en el proceso de elaboración del vino junto con
factores climáticos, de cultivo, de la fruta, pH del mosto, etc. Las levaduras del género
Saccharomyces son las más utilizadas en la elaboración del vino, sin embargo, varias especies
no pertenecientes a este género han sido encontradas en el mosto fermentado, tales como
Hanseniaspora guillermondii, Kloeckera apiculata, Pichia anomala, Candida stellata,
Torulaspora delbrueckii. Estas levaduras no pertenecientes al género Saccharomyces
contribuyen a mejorar el bouquet del vino, sin embargo no son capaces de resistir todo el
proceso de fermentación debido a su escasa tolerancia al etanol. Por esta razón, varios autores
han estudiado la fermentación con mezclas de levaduras, aplicadas simultáneamente o
encultivos secuenciales. Las levaduras favorecen el sabor del vino de tres modos significativos:
influencia la ecología del proceso de la vinificación, el metabolismo y las actividades
enzimáticas y el impacto organoléptico de especies individuales o combinaciones de especies
en el sabor del vino.

   6.2. VINO DE FRUTAS
Se define como vino de frutas la bebida proveniente de mostos de frutas frescas, distintas de
la uva, sometidos a la fermentación alcohólica y que han sufrido procesos semejantes a los
exigidos para los vinos.
Los vinos de frutas se producen a escala industrial, en diversos países de Europa y muchas
otras partes del mundo, especialmente en aquellas zonas que no reúnen las condiciones
adecuadas para el cultivo de las cepas de uva utilizadas para la elaboración del vino.
El vino de fruta fortificado con alcohol según la Asociación de Productores de Sidra y Vinos de
Fruta de la Unión Europea, se define como: una bebida alcohólica obtenida por la
fermentación total o parcial de zumo fresco, concentrado o reconstituido, o pulpa de frutas
comestibles frescas o de otras partes de vegetales frescos, excepto uvas, con o sin adición de
agua, azúcar y alcohol agrícola. Al producto fermentado se le puede añadir zumo fresco,
concentrado o reconstituido, o aromas. El contenido alcohólico de los vinos de frutas tiene que
hallarse entre un 8 y un 20% v/v.; la mayoría tendrá un contenido alcohólico de 12 a 15% v/v.
Existe gran variedad de frutas utilizadas en la elaboración de vinos de frutas como por ejemplo
manzanas, cerezas, grosellas, peras, ciruelas y fresas, y de frutas cítricas, como arazá, naranjas.
Un vino de frutas que ha sido correctamente elaborado debe saber a la fruta de que está
hecho; es decir, un vino de fresas debe mantener el aroma fresco y agradable que caracteriza a
esta fruta. Cada una de las frutas le confiere a su vino unas características especiales que se
deben mantener.

   6.3. FERMENTACIÓN DE LOS ZUMOS DE FRUTAS
 La fermentación de los vinos de frutas se lleva a cabo fundamentalmente en cubas de
hormigón, acero o alternativamente en barriles de madera. Es frecuente que en este proceso
sea necesario ajustar la acidez del zumo mediante la adición de ácidos utilizados en la industria
alimentaria o, más comúnmente, por neutralización del exceso de acidez, con carbonato
cálcico.

   6.4. FERMENTACIÓN DE PULPA DE FRUTAS
La fermentación de la pulpa permite niveles de extracción más altos de antocianos y otros
pigmentos de frutas tales como arándanos, cerezas, fresas y facilita la extracción de los zumos
de la mayor parte de las frutas. Por esto la clarificación final del vino se simplifica por ello. Sin

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embargo, las elevadas tasas de levaduras en la fruta hacen necesario asegurar la adición de
inóculos de levadura pura de gran vigor, para competir eficazmente con la población salvaje.
Como la pulpa es una fuente de nutrientes más rica que el zumo, la fermentación es vigorosa y
no resulta necesaria la suplementación de nutrientes


    6.5. ARAZÁ
Fruta originaria de la Cuenca Amazónica Occidental. Domesticada y consumida inicialmente
por los pueblos indígenas. El Arazá es una de las frutales cuyos registros se remontan a los
principios de la fruticultura amazónica. Siendo identificado en el principio como un
ambientador natural, por su delicioso aroma algunos locales se abstenían de consumir y solo lo
utilizaban para aromatizar los ambientes.

Se desarrolla en zonas con temperaturas medias de 18 a 30ºC, con precipitaciones que van
desde los 1.500 a 4.000 mm/año y una altitud variable desde el nivel del mar hasta los 650
msnm. Se adapta en suelos con alta saturación de aluminio y bajos niveles de fertilidad, con un
pH de 4,5 a 5,5.

El fruto de arazá posee un alto contenido de humedad, alrededor del 90%, lo que contribuye al
incremento de la tasa respiratoria e incide directamente en la alta perecibilidad. Los
contenidos proteicos resultan moderadamente altos y pueden estar asociados a una alta tasa
metabólica, con un importante nivel de actividad enzimática.
Por otra parte, la fibra cruda constituye un interesante aporte a la dieta básica. El arazá aporta
una moderada cantidad de ácido ascórbico, entre otras vitaminas, favoreciendo de esta forma
la seguridad alimentaria en la región amazónica, ya que de otra manera el consumo de
vitaminas provendría siempre de frutos “importados” a la región.




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   6.6. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL FRUTO DE ARAZÁ EN ESTADO MADURO




   6.7. BIOQUIMICA DE LA FERMENTACION:
Podemos definir la fermentación alcohólica como el proceso bioquímico por el cual las
levaduras transforman los azúcares del mosto en etanol y CO2.
Para que la fermentación alcohólica tenga lugar, el mosto ha de hallarse en condiciones de
limitación de oxígeno. En condiciones de aerobiosis las levaduras se multiplican
abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consigue 1 g de levadura
por cada 4 g de azúcares consumidos. En anaerobiosis las levaduras realizan la fermentación,
es decir degradan los azúcares de forma incompleta generando etanol, CO2 y energía. En estas
condiciones el rendimiento en biomasa es de tan sólo 1 g de levadura por cada 100 g de
azúcares consumidos.

   6.8. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA BIOQUÍMICA DE LA LEVADURA Y LA
         FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
La temperatura de fermentación es una de las características que deben tomarse en cuenta
para determinar el tipo de fermentación. De hecho, dependiendo del tipo de vinificación que
se quiera realizar, se utilizará una temperatura u otra y por tanto, puede ser de gran interés
tener cepas que fermenten bien a las temperaturas elegidas. Así, las vinificaciones en blanco
se llevan a cabo a una temperatura baja, favoreciendo la retención de aromas, característica
distintiva de un buen vino blanco. Las fermentaciones de vinos tintos, en cambio, se realizan a
temperatura ambiente, pero sin dejar que la temperatura supere los 30°C, favoreciendo la
extracción de los polifenoles, responsables del color de los vinos

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   6.9. PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
Durante la fermentación anaeróbica, además de etanol y CO2 se produce cierta cantidad de
otros compuestos que en gran medida contribuyen al sabor y aroma final del vino.
Se identifica los siguientes:
Glicerol. Cuantitativamente es el segundo componente mayoritario del vino después del
etanol y agua. Se encuentra en cantidades de 6 a 10 g/L y a él se atribuyen los caracteres de
suavidad y aterciopelado del vino. Se genera a partir de la fosfodihidroxiacetona por reducción
y de fosforilación de la misma.
Acetaldehído. Aparece durante la F.A. por descarboxilación del ácido pirúvico, aunque
también puede proceder de la oxidación del etanol. En exceso provoca en el vino la
denominada maderización o gusto oxidado.


   6.10.       CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE LEVADURAS
Algunas caracteristicas deseables y no desableas en la selección de levaduras para la
produccion de vinos de calidad




7. MARCO METODOLOGICO
   7.1. DESCRIPCION DEL PROCESO PARA LA ELABORACION DEL VINO
        Recepción: consiste en cuantificar la fruta que entrará a proceso. Esta operación debe
          hacerse utilizando recipientes adecuados y balanzas calibradas y limpias.
        Lavado: se hace para eliminar bacterias superficiales, residuos de insecticidas y
          suciedad adherida a la fruta. Se debe utilizar agua clorada.
        Selección: se elimina la fruta que no tenga el grado de madurez adecuado o presente
          golpes o magulladuras.
        Preparación de la fruta: la eliminación de la cáscara permite ablandar más
          rápidamente la fruta, así como obtener un producto de mejor calidad.(Esta operación
          depende de la fruta de la cual se quiera hacer vino), puede realizarse manual o
          mecánicamente. Si se hace mecánicamente, existen en el mercado una variedad de
          modelos de peladoras o bien construirse de forma casera. La preparación puede
          incluir un escaldado que permita por una parte desactivar la acción enzimática y por
          otra ablandar los tejidos de la fruta para facilitar la extracción de la pulpa.
        Extracción de la pulpa: se hace por medio de un despulpador o bien licuando la fruta.
        Extracción del jugo: se hace con una prensa manual o hidráulica. O bien la pulpa
          obtenida en la fase anterior, se hace pasar por un colador, para obtener el jugo. En
          esta parte la pulpa debe estar a 70 C, para evitar el oscurecimiento y garantizar el
          sabor, el olor y el color.

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            Preparación del mosto: al jugo obtenido en la etapa anterior se adiciona una solución
             de agua azucarada al 20%, levadura al 2% en relación al mosto. El nutriente, que
             puede ser fosfato de amonio, se agrega en una proporción de 1 gramo por litro
             aproximadamente.
            Fermentación: en este paso se coloca una trampa de aire, para evitar su oxidación a
             vinagre. La mezcla se deja fermentar en barriles, entre 3 y 7 días como mínimo, a una
             temperatura de 30C. La fermentación se interrumpe cuando ya no hay producción
             de gas.
            Trasiego: consiste en separar la parte superior del fermento, mediante succión.
             Durante el fermento existe una separación de fases, quedando el vino en la parte
             superior y residuos de fruta o levadura en la parte inferior.
            Filtrado: se hace pasar la mezcla fermentada por una tela fina o colador, previamente
             esterilizado, para eliminar la levadura y la pulpa residuales.
            Estandarizado: es una etapa opcional que se hace agregando alcohol, en diferentes
             proporciones, según la clase de vino que se requiera. Si es un vino generoso, el
             volumen de alcohol está entre el 15 y 25%, pero si es una bebida espirituosa el
             contenido es de 30 a 50%.
            Envasado: por lo general, se hace en botellas de vidrio. Los envases deben esterilizarse
             sumergiéndolos en agua caliente (95 °C) durante 10 minutos.
            Sellado: el sellado puede hacerse manual o mecánicamente. Es frecuente que el
             tapón de la botella sea de corcho.


   7.2. PREPARACIÓN DEL MOSTO:
        7.2.1. CONSIDERACIONES DE LA MATERIA PRIMA (ARAZÁ) PARA EL MOSTO EN LA
              ELABORACION DE VINO DE ARAZÁ:




Composición y propiedades de los sustratos de la materia prima (Arazá) a ser fermentados

Sólidos solubles totales                              4.34 °Bx
pH                                                    2.88
Acidez total                                          2.661 % Ac. Cítrico
Nitrógeno                                             152.7 mg/100 g pulpa
Fósforo                                               9.0 mg/100g pulpa
Potasio                                               215.3 mg/100g pulpa
Calcio                                                19.3 mg/100g pulpa
Magnesio                                              10.3 mg/100g pulpa
Sodio                                                 0.8 mg/100g pulpa
Manganeso                                             13 ppm /100g pulpa

Cobre                                                 5 ppm/100g pulpa

Hierro                                                87 ppm/100g pulpa
Zinc                                                  11 ppm/100g pulpa




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Según la tabla anterior el arazá no aporta con un contenido significativo de azúcar que las
bacterias puedan fermentar por lo que vamos a proceder a la chaptalización para alcanzar los
200 g/ L de azúcar en el mosto.
El arazá cuenta con la cantidad necesaria de nitrógeno por lo que no va a ser añadido en el
mosto.

El pH no será corregido pues al valor indicado en la tabla el proceso de fermentación no se
verá afectado por el crecimiento de otros microorganismos acompañantes en el inicio a la
fermentación.

   7.2.2        MEZCLA EN LAS SIGUIENTES PROPORCIONES:
        1L de pulpa
        2L de agua
        0.22mg /L de levadura
        100 de azúcar para alcanzar 22°Bx
        100 mg/L NH4SO4


   7.2.3       CARACTERIZACIÓN ESPERADA DEL VINO DE ARAZÁ
        Características físicas vino de arazá

                        Aroma y Sabor         Arazá
                        Color                 Blanco

        Características químicas vino arazá
Sólidos solubles totales                        10 °Bx
pH                                              3-3.5
°GL                                             Esperado 14°
                                                Mín 11.5°
Azúcar residual                                 1-2 g/L
Acidez volátil                                  0.2g/L
Acidez total                                    5-8 g/L
Extracto seco                                   20-25g/L
Densidad                                        0.990-0.995 g/cc

    7.3. FUNDAMENTO DE LOS METODOS DE AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CONSERVACION DE
         LAS CEPAS FERMENTADORAS EN EL VINO DE ARAZÁ
          7.3.1. AISLAMIENTO
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a
partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales como agua, suelo, plantas y desechos,
la elección del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo
exprese en ese ambiente las propiedades que son de interés.
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas se podrían encontrar organismos adaptados a la
degradación de estos productos químicos; o en larvas de insectos muertos agentes causales de
la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para
el mismo
Aislamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento
permita la máxima expresión del material genético del organismo.



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          7.3.2. ENRIQUECIMIENTO DEL CULTIVO
Esta técnica consiste en incrementar en una población mixta el número de organismos de
interés en relación al resto. De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado
de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones
inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratos
específicos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se
modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos periódicos en
medio fresco. Esto lleva a que el organismo de interés sea el dominante de la población, lo cual
facilita su posterior aislamiento en medio sólido.

       7.3.4    SELECCIÓN
Para seleccionar una cepa de S. cerevisiae para utilizarla como iniciador de fermentación se
parte de un número elevado de cepas diferentes aplicando una selección masiva por
competencia.
Este método de selección se basa en la propia competencia entre las cepas por los nutrientes
del medio, para elegir aquéllas que tengan una mejor capacidad fermentativa.
En nuestro caso también se empleó para la selección la temperatura de fermentación, el pH
del mosto, la cantidad de minerales y nitrógeno que las levaduras necesitan para su
crecimiento, la resistencia al alcohol producido y la finalización correcta del proceso y los
análisis organolépticos del vino.

Características deseables y no deseables de cepas que van a ser aisladas
       Alta tolerancia al etanol
       Total degradación de los azúcares fermentables
       Resistencia al SO2
       Capacidad fermentativa a bajas temperaturas
       Máxima reducción de la fase de latencia
       Degradación del ácido málico
       Capacidad fermentativa a altas presiones
       Producción de SO2
       Producción de H2S
       Producción de acidez volátil
       Producción de acetaldehído y piruvato

Primer paso:
Para seleccionar una levadura propia de una fruta, el primer paso es conocer la flora autóctona
de esta fruta.
Se ha confirmado que muchas cepas de Saccharomyces llevan a cabo las fermentaciones
alcohólicas espontáneas, aunque muy pocas son predominantes al final de fermentación.
Para realizar un estudio ecológico, se debe hacer un seguimiento de fermentaciones
espontáneas que se realicen en el proceso fermentativo a estudiar. Evidentemente es muy
importante que se trate de fermentaciones espontáneas, pero no sólo eso, sino que se elijan
para este estudio, si es posible, mostos que no hayan sido inoculados, porque así se garantiza
que las cepas que se aislarán serán cepas autóctonas de esta fruta.

Segundo paso:
Una vez que se tiene una colección de cepas aisladas de la fermentación de la fruta, el
siguiente paso es la identificación de estas cepas. Aunque la especie principal y responsable de
la fermentación alcohólica es Saccharomyces cerevisiae, en las fermentaciones espontáneas,
también se encuentran otras especies, sobretodo en las primeras fases del proceso (cepas de
Candida, Hansenioaspora, Metschnikowia, etc.). Por tanto, la primera diferenciación que debe

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realizarse es a nivel de especie, mediante medios selectivos, concretamente en el medio lisina.
Se utiliza este medio porque las cepas de Saccharomyces no pueden crecer en un medio donde
la lisina sea la única fuente de nitrógeno. La mayoría de las cepas de no Saccharomyces, en
cambio, crecen sin problema.

Proceso de selección
Los criterios utilizados hasta ahora para la selección de cepas consistían en una sucesión de
pruebas para determinar la ausencia o presencia de determinados caracteres que se
consideraban importantes en cepas vínicas. Estas pruebas se realizaban inicialmente con todas
las cepas, para según se iban aplicando los diferentes criterios, ir descartando cepas. Algunos
de los criterios más utilizados son: factor killer, tiempo de fermentación, capacidad
fermentativa en mostos con elevadas concentraciones de azúcares, formación de H2S,
formación de espuma, etc.

6. Fermentaciones masivas por competencia.
Se elige un número definido de cepas de Saccharomyces, se inoculan en un mismo
fermentador y se hace un seguimiento de cómo evolucionan estas cepas a lo largo de la
fermentación.
La población inicial de todas las cepas es la misma, para que todas tengan las mismas
posibilidades de imposición.
El número de cepas a analizar dependerá de las cepas aisladas, pero no sería aconsejable
utilizar un número superior a 20 cepas.

7. Medio de fermentación
Las fermentaciones se hacen a escala de laboratorio, es decir, en pequeños fermentadores.
Para ello, lo ideal es utilizar mosto concentrado diluido, ya que tiene todos los nutrientes
necesarios para una correcta fermentación. Además, al utilizar este mosto concentrado se
puede regular la concentración de azúcares, lo cual ya supone una característica adicional de
selección al poderse fijar unas condiciones más o menos restrictivas de fermentación.

8. Fermentaciones individuales en el laboratorio
Aunque parezca de poca importancia, se trata de un paso básico, ya que el hecho de que una
cepa se haya impuesto en una fermentación masiva, no garantiza que pueda realizar una
fermentación completa por ella sola. Además, se tiene que analizar las características
organolépticas del vino obtenido con cada cepa, cosa que hasta ahora no se había podido
hacer, porque al ser un conjunto de cepas no se podía saber qué cepa era la que
proporcionaba las diferentes características, ya fueran favorables o desfavorables.

Después de haber hecho las pruebas en el laboratorio y por tanto, haber comprobado qué
cepas presentan:
• Buena capacidad fermentativa (estudio de la velocidad y duración la de fermentación)
• Resistencia a altas concentraciones de azúcares (debido a las características particulares de
la zona de selección)
• Resistencia a altas concentraciones de etanol
• Producción de glicerol, ésteres, alcoholes superiores
• Baja acidez volátil
• Resistencia a SO2

Se realiza una cata, y se eligen las cepas que además de fermentar correctamente, tengan un
mejor perfil cromático, aromático y gustativo.



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      7.3.4     MANTENIMIENTO O CONSERVACIÓN DE LOS CULTIVOS
Los objetivos de la conservación de los cultivos se podrían resumir en los siguientes aspectos:
        a. preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus propiedades
        bioquímicas;
        b. preservar los niveles de su productividad inicial;
        c. lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Esto último
        puede ser un factor esencial en la selección de un método de preservación.

En todo trabajo de Microbiología se deben conocer las características de la población con la
cual se va a trabajar (propiedades morfológicas y bioquímicas).
En este sentido, tanto en la conservación como en el desarrollo del cultivo, ya sea el que
suministra o el que recibe la cepa, deberían usar las mismas técnicas metodológicas.
Tanto para el mantenimiento, preparación y propagación de inóculos se deben usar métodos
reproducibles que no produzcan variaciones o pérdidas de las características de la cepa
empleada.

El conocimiento de las características del cultivo es esencial en la elección de un método de
preservación. La identidad del cultivo puede conocerse en base a sus características de
crecimiento en uno o más medios específicos, tomando en consideración propiedades macro y
microscópicas exhibidas, o en base a una evaluación más exhaustiva empleando muchos
ensayos bioquímicos, biológicos, inmunológicos y genéticos.
En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibilidad de
determinar en cada etapa si ha habido o no alteración genética. En la mayoría de las
situaciones solamente se pueden notar cambios mensurables m observables tales como
pigmentación, morfología, reacciones fermentativas, propiedades microscópicas, etc. El
análisis de estos parámetros junto con la determinación cuantitativa del recuento de colonias
antes y después del proceso de mantenimiento brinda la información necesaria para la
correcta evaluación de la técnica de conservación a elegir.


   7.4 TECNICA A UTILIZAR EN EL AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CONSERVACION DE CEPAS DE
       LA FERMENTACION PARA ELABORACION DE VINO DE ARAZÁ

             7.4.1. TECNICA PARA AISLAMIENTO
El aislamiento se realiza según características morfológicas de las levaduras que fermentan el
mosto.
Se aislara cepas del proceso de fermentación del mosto de arazá.

            7.4.2. METODO DE ENRIQUECIMENTO
El método de enriquecimiento básicamente es el mosto propio hecho de arazá que contiene
todos los nutrientes como son:
Nitrógeno (mg/100g de pulpa): 152,7
Fósforo mg/100g de pulpa): 9,0
Potasio mg/100g de pulpa): 215,3
Azucares: 0.54% debido al bajo contenido de azucares debemos colocar como nutriente hasta
llegar a 24˚Brix que son los óptimos para que se realice una buena fermentación con un
optimo rendimiento en obtención de alcohol




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            7.4.3. TECNICA DE AISLAMIENTO EN MEDIO SELECTIVO
       Se realiza en medio de cultivo especifico para levaduras Medio YPDA con un pH
        ajustado de 3.4-5 con HCl o semejante al medio de enriquecimiento ya que la fruta es
        muy acida.
       La siembra es por estriado.
       Esta técnica nos permitirá selección puras de cepas de levaduras fermentadoras de
        mosto de arazá

           7.4.4. CONSERVACION
Se conserva las cepas a -80˚C en crioviales con un agente crioprotector como la glicerol al 5%.
Primeramente se lleva a una temperatura de -30˚C por dos horas y luego a la temperatura de -
80˚C


8. BIBLIOGRAFIA:
       Guía completa de alimentos, Könemann Verlagsgesellschaft mbH, Bonner Str.126, D-
        50968 Köln, Alemania, 1999. Pág. 129
       Selección de levaduras: Mas, M. J. Torija, G. Beltrán, M. Novo, N. Hierro, M.,
        Poblet, N. Rozés y J. M. Guillamón-Unitat De enologia del Centro de
        Referencia en Tecnología de los Alimentos. Facultad de Enología de Tarragona
       biologia.edu.ar/aislamiento de cepas/htm




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9. ANEXOS:
DIAGRAMA DE FLUJO DE ELABORACION DE VINO DE ARAZÁ




                                     15
Esquema del aislamiento e identificación de las cepas de levaduras que llevan a
cabo la fermentación alcohólica




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