TP1_ De la culture cellulaire à l'expression de protéines impliquées

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TP1_ De la culture cellulaire à l'expression de protéines impliquées Powered By Docstoc
					 De la culture cellulaire à l’expression de protéines
impliquées dans la réorganisation du cytosquelette

            Nicolas Bertrand & Myriam Baratin




  TD1    Initiation à la culture cellulaire

  TD2     Les différentes méthodes de transfection cellulaire
          Les petites protéines G de la famille Rho

  TD3     Description des protocoles
       Initiation à la culture cellulaire



Culture primaire/secondaire

Les milieux de culture/maintien des lignées

Les paramètres physico-chimiques

Matériel et instruments

La congélation

Les contaminations
 1- culture primaire/secondaire


    Culture primaire

C'est une culture de cellules qui proviennent directement d'un tissu. Cette première culture pourra,
par la suite, donner lieu à des cultures dites "secondaires«

Traumatisme

Contamination

   Culture secondaire

Des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). Ce
sont des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en
voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.
Transformation cellulaire: acquisition de caractères
propres à la cellule maligne
     Autonomie de croissance
     Perte de l’inhibition de contact
     Immortalité
     Indépendance vis-à-vis des facteurs de
     croissance et des interactions avec la MEC
     Tumorigénicité chez la souris nude
                      Immortalisation cellulaire




                                                        Cellules tumorales
    Cellules post-crise
                                                          Hela: carcinome
Immortalisation spontanée
                                                    Raji: lymphome de Burkitt
  (fibroblastes murins)




                 Cellules immortalisées par l’expérimentateur
              (expression d’oncogènes viraux, de la télomérase)
How can cells be made immortal?
Several methods exist for immortalizing mammalian cells in culture. Viral genes, including Epstein-Barr
virus (EBV), Simian virus 40 (SV40) T antigen, adenovirus E1A and E1B, and human papillomavirus
(HPV) E6 and E7 can induce immortalization by a process known as viral transformation. Although the
process is reliable and relatively simple, these cells may become genetically unstable (aneuploid) and
lose the properties of primary cells. For the most part, these viral genes achieve immortalization by
inactivating the tumor suppressor genes that put cells into a replicative senescent state.
The preferred method to immortalize cells is through expression of the telomerase reverse
transcriptase protein (TERT), particularly those cells most affected by telomere length (e.g., human).
This protein is inactive in most somatic cells, but when hTERT is exogenously expressed the cells are
able to maintain telomere lengths sufficient to avoid replicative senescence. Analysis of several
telomerase-immortalized cell lines has verified that the cells maintain a stable genotype and retain critical
phenotypic markers.
Cell      Species Cell type             Year Estab.
line
MDCK      dog     kidney                1958
CHO       hamster ovary epithelial      1957
CV-       monkey kidney                 1964
1/COS
NIH 3T3   mouse    embryo fibroblast    1963
Rat-1     rat      embryo fibroblast    1968
HeLa      human    cervical carcinoma   1951
HEK-      human    embryonic kidney     1977
293
LNCaP     human    prostate tumor       1977
MCF7      human    mammary tumor        1973
Deux sources de cellules sont possibles :

1 - Les cellules circulantes (en suspension )
         sang
         moelle osseuse
         liquides physiologiques


2- Cas des cellules à partir de tissus ou d'organes (adhérentes)
Designations:           EL4
Depositors:             M Cohn
Biosafety Level:        1
Shipped:                frozen
Medium & Serum:         See Propagation
Growth Properties:      suspension
Organism:               Mus musculus (mouse)
                        lymphoblast
Morphology:

                        Disease: lymphoma
Source:                 Strain: C57BL/6N
                        Cell Type: T lymphocyte;
                        In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the
Permits/Forms:          transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the
                        permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location.

                                                             transfection host (Nucleofection technology from Lonza
Applications:
                                                             Roche FuGENE® Transfection Reagents)
Antigen Expression:                                          H-2b; Thy-1.2
Cytogenetic Analysis:                                        modal number = 39
                                                             EL4 was established from a lymphoma induced in a C57BL mouse by
                                                             9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene. [22448]
                                                             The cells are resistant to 0.1 mM cortisol and sensitive to 20 mcg/ml
Comments:                                                    PHA.
                                                             A subline (EL4.IL-2, ATCC TIB-181) that produces high levels of
                                                             interleukin-2 (IL-2, interleukin 2) is available.
                                                             Tested and found negative for ectromelia virus (mousepox).
                                                             ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is
                                                             ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Catalog No. 30-
                                                             2002. To make the complete growth medium, add the following
Propagation:
                                                             components to the base medium: horse serum to a final concentration of
                                                             10%.
                                                             Temperature: 37.0°C
                                                             Medium Renewal: Every 2 to 3 days
                                                             Cultures can be maintained by addition or replacement of fresh medium.
Subculturing:
                                                             Start cultures at 2 X 10 exp5 cells/ml and maintain between 1 X 10 exp5
                                                             and 1 X 10 exp6 cells/ml.
Preservation:                                                culture medium 95%; DMSO, 5%
                               American Type Culture Collection (ATCC)

                            a nonprofit organization in Rockville, Maryland


The ATCC Cell Biology Collection is the most comprehensive and diverse of its kind in the world,
consisting of over 3,400 cell lines from over 80 different species. It holds over 950 cancer cell lines,
1,000 hybridomas and several special collections including stem cells.
  Pourquoi mettre des cellules en culture?



• Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire

Conservation des caractéristiques du tissu initial



• Accessibilité
• Contrôle de l’environnement et de traitements
  appliqués
• Homogénéité des cellules
• Matériel en grande quantité
Cycle de croissance d'une lignée cellulaire en culture in vitro




 Immortalisation cellulaire:
 Acquisition de la capacité à se multiplier indéfiniment
                                     Culture continue

       Phase de latence                                  Phase stationnaire
                     Phase exponentielle
        Nombre de cellules




                                                                     Mort cellulaire


                                                          Temps (jours)
Phase de latence
pas de division cellulaire
dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire
Phase exponentielle
Phase de division cellulaire
Temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h)
Phase stationnaire
Epuisement du milieu = arrêt de la prolifération
Poursuite de la croissance cellulaire (repiquage)
ou mort cellulaire
Cellules de mammifères

A priori, se rapprocher le plus possible des conditions du milieu intérieur
       Reproduction et maintien d’un environnement physiologique
Paramètres physiologiques

Température 37°C, permissivité faible

Ions inorganiques aspect qualitatif et osmolarité

pO2 et pCO2

pH 7.2-7.5
 Système tampon: HCO3- avec CO2 atmosphérique (5-10%)
CO2 + H2O          HCO3- + H+

Indicateur coloré: Rouge de Phénol




Hygrométrie 85% (évaporation)

Lumière visible à éviter
                     Fourniture d’aliments essentiels


Métabolisme énergétique

Biosynthèse

Catalyse enzymatique (vitamines, oligoéléments)




                           Surface de culture


 Cas des cellules adhérentes avec dépendance à l’ancrage
                 Mise à disposition de molécules de transport

Pour      Hormones

          Oligoéléments

          Lipides



                 Mise à disposition de facteurs d’adhérence


En fonction de la capacité des cellules utilisées à produire ces facteurs en plus ou moins
grande quantité



                 Mise à disposition de molécules informatives


 Hormones

 Facteurs de croissance
                   Reproduire l’environnement physiologique


Les milieux

La base: milieu synthétique
         - acides aminés
         - sels minéraux
         - NRJ (glucose/glutamine)
         - Vitamines (fragiles, ne pas autoclaver)

                a.a. e sen
Les Suppléments sa.a. tiels les
            besoin en      pour
                                       a.a. synthétisés par des    a.a. synthétisés par les
                                      cellules spécialisées dans cellules dans l'organisme et
          Indéfini: sérum et l'organisme donc à rajouter
        -cellules dans l'organisme(albumine/transferrine/hormones)lture   en cu
                          extrait de tissusen culture
                  en culture
                   arginine                   glutamine                    glycine
                         milieu conditionné stéine
                   histidine                   cy                           alanine
        - Défini: Facteurs de croissancene
                  isoleucine                   tyrosi                        serine
                     leucine                                 asparagine
                      lysine                              acide aspartique
Les   antibiotiquesthionine
                  mé                                      acide glutamique
           - Éliminerlacomplètement le contaminant microbien line
                 phény lanine                                  pro
                    thréonine
           - Ne pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules
                  tryptophane
           - Compatible avec les autres éléments du milieu
                      valine
             - Large spectre d’action
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X) liquid (high glucose)

Contains 4500 mg/L D-glucose, L-glutamine and 25 mM HEPES buffer but no sodium pyruvate
or phenol red.


Glycine                      75                30                     0.4

L-Arginine hydrochloride     211               84                     0.398

L-Cystine 2HCl               313               63                     0.201
L-Glutamine                  146               584                    4
L-Histidine hydrochloride-
                             210               42                     0.2
H2O
L-Isoleucine                 131               105                    0.802
L-Leucine                    131               105                    0.802

L-Lysine hydrochloride       183               146                    0.798

L-Methionine                 149               30                     0.201

L-Phenylalanine              165               66                     0.4

L-Serine                     105               42                     0.4
L-Threonine                  119               95                     0.798
L-Tryptophan                 204               16                     0.0784

L-Tyrosine disodium salt
                             261               104                    0.398
dihydrate

L-Valine                     117               94                     0.803
Vitamins
Choline chloride            140   4       0.0286
D-Calcium pantothenate      477   4       0.00839
Folic Acid                  441   4       0.00907
Niacinamide                 122   4       0.0328
Pyridoxine hydrochloride    206   4       0.0194
Riboflavin                  376   0.4     0.00106
Thiamine hydrochloride      337   4       0.0119
i-Inositol                  180   7.2     0.04
Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2)
                            111   200     1.8
(anhyd.)
Ferric Nitrate
                            404   0.1     0.000248
(Fe(NO3)3"9H2O)
Magnesium Sulfate (MgSO4)
                            120   97.67   0.814
(anhyd.)
Potassium Chloride (KCl)    75    400     5.33
Sodium Bicarbonate
                            84    3700    44.05
(NaHCO3)
Sodium Chloride (NaCl)      58    4750    81.9
Sodium Phosphate
                        138       125     0.906
monobasic (NaH2PO4-H2O)
Other Components
D-Glucose (Dextrose)    180       4500    25
HEPES                   238       5958    25.03
Technical Resources - Media Formulations
Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (1X) liquid




   Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a defined media formulation designed to
   reduce significantly the amount of serum required for cultivating mammalian cell in vitro. This
   enhanced standard basal formulation allows for a 50 - 80% reduction in the required serum
   supplementation with no cell adaptation needed. Suitable for the growth of maintenance of a variety
   of common cell lines including MDBK Hep-2 COS-7 A549 MDCK WI-38 and others this medium
   supports cell growth and morpholigical characteristics of both adherent and non-adherent cell lines.
   It is formulated without L-glutamine for increased stability. Supplementation with L-glutamine is
   required. Recommended concentration of serum is 1 - 5%; the concentration must be adjusted for
   each individual cell line to achieve optimal results.
Amino Acids
Glycine                      75   37.5   0.5
L-Alanine                         8.9    ∞
L-Arginine hydrochloride          84     ∞
L-Asparagine                      13.2   ∞
L-Aspartic acid                   13.3   ∞
L-Cystine 2HCl                    63     ∞
L-Glutamic Acid                   14.7   ∞
L-Histidine hydrochloride-
                                  42     ∞
H2O
L-Isoleucine                      105    ∞
L-Leucine                         105    ∞
L-Lysine hydrochloride            146    ∞
L-Methionine                      30     ∞
L-Phenylalanine                   66     ∞
L-Proline                         11.5   ∞
L-Serine                          52.5   ∞
L-Threonine                       95     ∞
L-Tryptophan                      16     ∞
L-Tyrosine disodium salt
                                  104    ∞
dihydrate
L-Valine                          94     ∞
Vitamins
Ascorbic Acid phosphate                        2.5       ∞
Choline chloride                               4         ∞
D-Calcium pantothenate                   477   4         0.00839
Folic Acid                               441   4         0.00907
Niacinamide                                    4         ∞
Pyridoxine hydrochloride                       4         ∞
Riboflavin                                     0.4       ∞
Thiamine hydrochloride                         4         ∞
i-Inositol                                     7.2       ∞
Inorganic Salts

Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.)        111   200       1.8

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O)                 0.1       ∞

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.)             97.67     ∞

Potassium Chloride (KCl)                       400       ∞

Sodium Bicarbonate (NaHCO3)                    3700      ∞

Sodium Chloride (NaCl)                         6400      ∞

Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4-H2O)         125       ∞

Proteins
AlbuMAX® II                                    400       ∞
Human Transferrin (Holo)                       7.5       ∞

Insulin Recombinant Full Chain                 10        ∞

Trace Elements
Ammonium Metavanadate                          0.0003    ∞
Cupric Sulfate                                 0.00125   ∞
Manganous Chloride                             0.00005   ∞
Sodium Selenite                                0.005     ∞
Other Components
D-Glucose (Dextrose)                           4500      ∞
Ethanolamine                                   1.9       ∞
Glutathione (reduced)                    307   1         0.00326
Phenol Red                                     15        ∞
Sodium Pyruvate                                110       ∞
Each Advanced™ medium is the standard published basal formulation,
supplemented with NEAA and sodium pyruvate. We’ve also added
these ingredients to allow serum reduction:



                •Ethanolamine
                •Glutathione (reduced)
                •Ascorbic acid phosphate
                •Insulin
                •Human (holo) transferrin
                •AlbuMAX™ (a lipid-rich bovine serum albumin)
                •Trace salts sodium selenite, ammonium matavanadate,
                cupric sulfate, and manganous chloride
                           Contaminations



Contaminants biologiques
Bactéries
Levures/moisissures
Virus
Mycoplasmes

Contaminants chimiques
Endotoxines
Qualité du plastique
Reste de détergent
Trace d’aluminium
Résidus désinfectants

Contamination croisée
Autres cellules
                             Mycoplasme



Micro-organisme procaryote de type bactérien, dépourvu de paroi rigide
(possédant une simple membrane) et capable de multiplication autonome.
Un antibiotique[1] (du grec anti : « contre », et bios : « la vie ») est une substance qui a une action
spécifique de bloquage ou même de destruction des bactéries. Pour les autres micro-organismes, on
utilise le terme d'« antifongique » s'il s'agit de lutte contre les champignons, ou d'« antiviral » s'il s'agit
de lutte contre les virus.
Cette substance peut avoir une action toxique directe, c'est-à-dire bactéricide ; son efficacité peut être
également limitée à empêcher le développement des micro-organismes (action bactériostatique).
Beta-lactamine



Beta-lactamine
 Aminoside




       Antibiotiques doivent:
       Eliminer complètement le contaminant microbien
       Ne doivent pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules
       Compatible avec les autres éléments du milieu
       Large spectre d’action
Les pénicillines sont des antibiotiques bêta-
lactamines. À la base, la pénicilline est une toxine qui
provient de la moisissure penicillium provenant du
champignon Penicillium notatum et qui est inoffensive
pour l'homme.
                         Les pénicillines ont pour formule chimique :

                               R-C9H11N2O4S

                         où R est une chaîne variable.




Les pénicillines A sont des aminopénicilline à spectre
élargi. L'ampicilline et surtout l'amoxicilline sont ses
deux principaux représentants.
                                                                        Pénicilline G




Les pénicillines et les autres antibiotiques β-lactames agissent par inhibition de la formation des
liens inter-peptidoglycanes dans la paroi cellulaire bactérienne. La moitié bêta-lactame des
pénicillines se lie à l'enzyme (transpeptidase) qui devrait se lier aux molécules de peptidoglycane
des bactéries et empêche ainsi la multiplication des bactéries.
  La streptomycine est un antibiotique antibactérien
  cytostatique et cytotoxique. Il appartient à la classe des
  aminosides (ou aminoglycosides)

  Il fut isolé à partir d'une souche d'actinobactérie
  Streptomyces griseus




 Action par fixation sur la petite sous-unité des ribosomes eubactériens: synthèse protéique aberrante.

 Effet bactéricide.




Le spectre d'action de la streptomycine est assez large puisqu'elle peut agir sur certains bacilles gram
négatifs (comme Escherichia coli) ou certains cocci gram positifs (comme le Staphylococcus aureus). Cet
antibiotique agit également sur Mycobacterium tuberculosis, et fut d'ailleurs le premier antibiotique contre
la tuberculose.
La tétracycline est un antibiotique produit par une
bactérie du genre Streptomyces. Elle est indiquée
contre nombre d'infections bactériennes.




   La tétracycline empêche la fixation de l'aminoacyl-ARNt
   entrant dans le site A du ribosome.
   Effet bactériostatique.
   Spectre : bactéries Gram positif et Gram négatif
Matériel et instruments
Matériel et instruments
Matériel et instruments
Matériel et instruments
NON!!!
                             Matériel et instruments

PSM: Poste de Sécurité Microbiologique (de type II)




                                 Ne pas introduire trop d'objets  perturbe le flux & la sécurité
                                 manipulateur
                                 Ne pas introduire d'objet poussiéreux  colmate le filtre
                                 Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile
                                 Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche
                                 Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de
                                 l'enceinte stérile
                                 L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite
                                 Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile
                            Matériel et instruments

Microscope inversé à contraste de phase
Matériel et instruments
Matériel et instruments
              Matériel et instruments

Étuve à CO2
Technique Aseptique pour culture cellulaire

Hygiène: cheveux attaches
Se laver les mains avant après. Port de gants blouse
Ethanol 70% mais attention à la perméabilité
La peau contient naturellement des bactéries et des champignons qui adorent
les milieux de culture
Tout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile flasques pipettes
Environnement: PSM poste de sécurité microbiologique
Nettoyage des hottes:
          TFD7 ou RBS détergent désinfectant
          Eau
          Ethanol
          Nettoyer les flacons à mettre sous la hotte
                           Congélation/Décongélation

Buts
Préserver
Éviter sénescence
Limiter risque de contamination
Minimiser les variations génétiques (perte ou doublement des chromosomes)

Agents cryo-protecteurs
DMSO
Glycérol

Quand/Comment
Phase exponentielle, suspension entre 106 et 108 cellules par mL
On congèle dans le milieu complet
Temps d’équilibration avec les cryoprotecteurs à la température du laboratoire
Congélation graduelle à -40°C/-80°C lentement (1 ou 4°C par min) puis dans
l’azote liquide (-196°C)


Décongélation
rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité

   Pendant ces phases, on limite les autres stress appliqués aux cellules
Fourchette de température critique -15°C/-60°C

Jusqu’à -5°C, pas de congélation du milieu ni des liquides intracellulaires

Entre -5°C et -15°C, le milieu commence à congeler mais pas les liquides intracellulaires

            conséquence: les cellules se déshydratent (l’eau intracellulaire sort)

Le refroidissement lent permet une déshydratation efficace et limite la congélation intracellulaire
qui entraîne la mort de la cellule. Plus les cellules sont grandes et plus le refroidissement en
général doit être lent.

Cette première condition doit être remplie mais n’est pas suffisante.
En effet, il semble que les changements de forme induit par la perte d’eau et ceci en présence de
quantité de glace extracellulaire croissantes sont anisotropes (distorsion), ce qui provoquerait des
lésions cellulaires. D’autre part, l’augmentation de concentration des solutés serait aussi délétère.
Le refroidissement est lent, on augmente la durée d’exposition aux forces de distorsion.
Les agents cryoprotecteurs agiraient en diminuant le problème: ils permettent d’augmenter la
fraction non congelée et donc limite la déshydratation et l’action des forces de distorsion.

La vitesse de décongélation est importante aussi. En général, une décongélation et un
réchauffement trop lent sont délétères pour la survie des cellules.

				
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posted:2/16/2013
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