Docstoc

Colilert-18 _ Quanti-Tray for Testing Fecal Coliforms in Waste Water

Document Sample
Colilert-18 _ Quanti-Tray for Testing Fecal Coliforms in Waste Water Powered By Docstoc
					Colilert‐18 & Quanti‐Tray for Testing  
  Fecal Coliforms in Waste Water


                Gil Dichter
World Wide Technical Support Manager, Water
            IDEXX Laboratories
          www.idexx.com/water
              OBJECTIVES
Define total coliforms, fecal and E.coli
Review of Waste Water Methods for Fecal Coliforms
MTF, MF &colilert‐18‐Quanti‐Tray
USEPA‐ATP Review of Colilert‐18‐Quanti‐Tray 
QC/QA
Q&A
Bacteria Hierarchy
• Family            • Enterobacteriaceae
• Genus (type of    • Escherichia, Klebsiella, 
  bacteria)           Citrobacter
• Species           • E.coli, E. hermanii,
                    • K. pneumoniae,  
                    • C. freundii
  Thermotolerant Coliforms [aka Fecal Coliforms]

 It is a subset of total coliforms
Defined as coliform bacteria that can grow at 44.5°C
Consists of the following coliforms:
 – E. coli
 – K. pnuemoniae
 –Enterobacter spp.
Coliform Bacteria Group

           Total Coliforms (35°C)


                  Fecal Coliforms /
                  thermotolerant        
     Klebsiella   (44.5°C)
   Total coliforms (35                     E.coli



                    Citrobacter
                  Enterobacter
     Definitions of Coliforms & E.coli
• Standard Methods for the Examination of Water and 
  Wastewater, 21st Edition
   – 9221 MTF: Gram negative bacteria that ferment 
     lactose resulting in gas and/or acid formation 
     (turbidity) within 48 h at 35C. 
   – 9222 MF: Gram negative bacteria that develop red 
     colonies with a metallic sheen within 24 h at 35C on 
     m‐Endo medium.  Some members of the coliform 
     group produce red colonies without a metallic 
     sheen.
   Definitions of Coliforms & E.coli
  Standard Methods for the Examination of Water and 
  Wastewater, 21st Edition
   – 9223 Enzymatic: The total coliform group is defined as all bacteria 
     possessing the enzyme β‐D galactosidase cleaving the chromogenic
     substrate resulting in the release of the chromogen.
   – E.Coli is defined as giving a total coliform response and possessing 
     the enzyme β‐D glucuronidase, cleaving the fluorogenic substrate 
     resulting in the release of the fluorogen.
   – fluorogenic substrate resulting in the release of the 
     fluorogen.
• Fecal Coliform‐ possessing the enzyme β‐D galactosidase 
  cleaving the chromogenic substrate resulting in the release of 
  the chromogen at 44.5±C°
What Factors Impact the Speed, Sensitivity, and 
  Specificity of Water Microbiology Tests?
1. Starting Inoculum ‐ a lower concentration equals longer detection time

2. Metabolic State of Target Organism ‐ Injured bacteria take longer to detect

3. Natural Growth Rate of the Target Organism ‐ E. coli double every 20 
   minutes but Legionella double every 3 hours

4. The Presence of Non‐target Organisms ‐ competition for nutrients & need 
   for inhibitors

5. Presence of “Toxic” Components in Test Matrix ‐ salt, chlorine, ozone…….

6. Nutritional Content of Reagent ‐ amino acids, vitamins, minerals, and 
   other factors

7. Natural Diversity of Target and Non‐target Strains – mutant (or variant) 
   populations
    Standard Bacterial Growth Curve

  (A) Lag Phase
  (B) Log or 
Exponential Phase
  (C) Stationary Phase
  (D) Decline (Death) 
Phase
   Requirements for an Indicator 
           Organism
  Present when pathogens are present
  Absent in uncontaminated waters
  Present in higher numbers than pathogens in 
contaminated water
  Better survival in water than pathogens 
  Easy and Safe to analyze
  Rapid results 
  Inexpensive
  Accurate
Multiple Tube Fermentation 
           (MTF)
Most Probable Number (MPN)
Most Probable Number Assay
Multiple Tube Fermentation Method (Total Coliforms‐LTB 
                      & BGLB)
Fecal Coliform/E. coli Multiple Tube Method ‐
             EC medium + MUG
Membrane Filtration

     Methods
Membrane Filter Apparatus
       Membrane Filtration‐
      applicable to all methods
•   May required media prep
•   Extensive QC
•   Minimum of 20 steps
•   20‐80 colonies (20‐60 for m‐FC)
•   Risk of confluent growth
•   Risk of clogged filters
•   Risk of overlapping colonies
•   Risk of air bubbles under membrane
•   Difficult to read 
    m‐Endo: Method
• Standard Methods 9222B&C
• Incubate for 24 hours at 35‐37°C
• Read at 24 hours for presumptive results
    – Dark red or pink with metallic/green sheen
• HPC Interference at 120 colonies or more
    – Transfer colonies to BGB to confirm 
      coliforms (up to 48 hours)
       • Positives produce gas and turbidity
• Transfer positives to EC (+Mug)  for 24 hours at 44.5°C
    –    Positives produce, turbidity/gas, and/or 
        fluorescence
• Results with confirmation‐ could take up to 3 days
m‐Endo Plate
Multiple Tube Fermentation Method (Total Coliforms‐LTB 
                      & BGLB)
Fecal Coliform/E. coli Multiple Tube Method ‐
             EC medium + MUG
                                 m‐FC
• Enriched lactose medium
• Contains aniline blue
• Larger colonies than m‐Endo; 
  range is 20‐60 colonies
• Incubate in water bath at 44.5 
  ±0.2°C for 24 hours in plastic
   bag
• Blue colonies are positive
• Atypical‐ grey to green colonies
• Confirm as per section 9020 
  Standard Methods
ONPG Positive Reaction
       Colilert & Colilert‐18
MUG Positive Reaction
     Colilert & Colilert‐18
Quantification
Separation of Snap Packs
   Quanti‐Tray Demonstration




Add Colilert/Colilert-   Pour mixture into a
18 to sample and shake   Quanti-Tray
to dissolve
Quanti‐Tray Demonstration
                     cont.




Seal and incubate at 35°C for 18 or 24
hours for total coliforms & E.coli and
44.5°C  for fecal coliforms for 18 hours
   Incubate Samples at 35ºC ± 0.5ºC
for 18‐22 hours for Colilert‐18 or 24‐28 
hours for Colilert (TC &/or EC) or 44.5 ±
        0.2ºC forColilert‐18 (FC) 
Or A Water Bath for Fecal Coliforms at 
            44.5±0.2ºC
           Quanti‐Tray Demonstration
                           cont.




Count positive wells and
refer to MPN table
  51‐Well Quanti‐Tray MPN Table
No of Wells   MPN per 100 95% Lower     95% Upper
giving        ml           Confidence   Confidence
positive                   Limits       Limits
reaction


         0          <1              0        3.7

         5          5.3         2.3         12.3

     15            17.8        10.8         29.4

     25            34.4        23.3         51.2

     45            109.1       78.6        158.7
               Quanti‐Tray 2000 MPN Table
No of large    No of small    MPN per    95% Lower     95% Upper
wells giving   wells giving   100ml      Confidence    Confidence
positive       positive       sample     Limit         Limit
reaction       reaction

     10              2           13.2            7.1       22.0

     30             12            64         46.8          85.1

     47             40           509.9       393.4         652.5
Colilert‐18 & Quanti‐Tray for Fecal 
Coliform Testing
a. Review of ATP 
b. Process to obtain approval for use
Colilert®‐18 Fecal Coliform Protocol Addendum
Quanti‐Tray® Enumeration Procedure
1. Add contents of one snap pack to a 100 mL room temperature water sample in 
a sterile vessel.
2. Cap vessel and shake until dissolved.
3. Pour sample/reagent mixture into a Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 and seal 
in an IDEXX Quanti‐Tray Sealer. 
4. Place the sealed tray in a 44.5˚C ±0.2˚C incubator for 18 hours (prewarming to 
35˚C is not required). For incubation in a water bath, submerge the Quanti‐Tray, 
as is, below the water level using a weighted ring.
5. Read results according to the Result Interpretation table below. Count the 
number of positive wells and refer to the MPN table provided with the Quanti‐
Tray to obtain a Most Probable Number.
Result Interpretation
Less yellow than the comparator when incubated at 44.5°C ±0.2°C. Negative for 
fecal coliforms
Yellow equal to or greater than the comparator when incubated at 44.5°C ±0.2°C. 
Positive for fecal coliforms
    Colilert‐18 Fecal Coliform ATP Study
• The study was based on USEPA ATP protocol (40CFR136)
• Colilert‐18/Quanti‐Tray compared against m‐FC to determine 
  fecals in waste water
• Based on the ATP Study, the EPA determined that Colilert‐18 is 
  a suitable method for the detection of fecal coliforms in 
  wastewater.
Protocol Summary 
•  Primary wastewater effluent samples from 10 different 
  locations within the New England area were approved 
  for use as sources of fecal coliform bacteria for this 
  study. 
• Effluent samples were collected, processed and tested 
  at a certified laboratory within six hours.    
              Colilert‐18 ‐Fecal Coliform ATP Study

• If necessary, effluent samples were diluted to approximately 
  20‐50 organisms per 100 mL of sample.  
• Each sample was analyzed by Colilert‐18 and SM9222D in 
  replicates of 20 after incubation at 44.5 ±0.2°C.  
• Sensitivity of fecal coliform detection was determined by 
  comparing the number of presumptive positive responses for 
  the Colilert‐18 against the number of presumptive positive 
  responses from m‐FC
• Specificity was determined by confirming the identity of at 
  least 200 presumptive positive and 200 presumptive negative 
  determinations from each test method.  
                    Colilert ‐18 Fecal Coliform ATP Study
  Statistical comparability of the fecal coliform counts was determined 
by each method following the ATP guidelines.  
  False positive and false negative rates were determined for each 
method 
  Normality: Analysis of data indicated fecal coliform recovery by both 
methods was consistent with a normal distribution with p‐values, in 
excess of p= 0.10 for all samples; results confirmed that the 
assumption of normality was met for both test methods.
  Variance across 10 effluent sites: variances across the ten sites were 
similar using the  Bartlett’s test with Colilert‐18 having a p‐value of 
0.308; however SM9222D variance was not homogeneous across the 
ten sites with a p‐value of 0.006, additional analysis using Levene’s test 
shows good internal consistency (p >0.05) with Colilert‐18 test but not 
with SM9222D; SM9222D had the lowest overall precision across the 
ten effluent samples;
                    Colilert‐18 Fecal Coliform ATP Study
•   Mean values for the 10 sites‐ mean values within 95% CI
     Colilert‐18          M‐FC
      51.7/100mL           37.8/100mL

•   Test of variance equality for each method across the 10 sites based on Bartlett's test & 
    Levene's test p‐values

                                p-value               p-value
                            (Bartletts's Test)     (Leven's test)
           Method               p > 0.05              p > 0.05
          Colilert-18             0.308                0.619
          SM9222D                 0.006                0.042
•   False Positive and False Negative Rates
          Method              Colilert-18         SM9222D


      False Positive             0%                  0.5%
          Rate

      False Negative            7.0%                21.5%
           Rate
            Colilert‐18 Fecal Coliform ATP Study
• Comments on study findings:
  – The EPA determined that Colilert‐18 is a suitable method for 
    the detection of fecal coliforms in wastewater when incubated 
    at 44.5°C.
  –  The high false negative rate for SM9222D is hypothesized to be a result 
    from SM9222D detecting fecal coliform bacteria via active lactose 
    fermentation, which was found to be absent in 16.5% of the strains 
    encountered in this study. These strains of anaerogenic fecal coliforms 
    primarily belonged to the Escherichia and Klebsiella genus, and represent 
    true fecal coliform bacterial and should have been detected.
  – Read subjectivity: Analysts performing the study noted that m‐FC can be 
    highly subjective due to the varying morphological characteristics of the 
    colonies.  Other fecal coliform colonies on m‐FC plates may lack the blue 
    color, due to non‐target organisms competing for nutrients and interfere 
    with the growth of fecal coliforms. 
 Process to Obtain Approval for Use of 
Colilert‐18/Quanti‐Tray for Fecal Coliform
• USEPA Region 10 process
• Region 10 contact:
  – Ginna Grepo‐Grove, R10 Quality Assurance 
    Manager
  – (206) 553‐1632 ‐ Office Phone Number
  – (206) 553‐8210 ‐ Fax Number
                     QA/QC
• Read results at 24 hours. Window to 28 hours 
  for Colilert For Colilert‐18 it is 18 hours up to 
  22 hours
• Be consistent with time to read results and 
  reading of Y/F wells
• Use Comparator as indicated as indicated in 
  the package insert
• Proficiency Testing
   Quality Control for Colilert, Colilert‐
              18 & Colisure
  Use of positive and negative 
controls
  – Required each time for MF and MPN 
  testing
  – For Colilert, test upon receipt of 
  each lot of product
 Quanti‐Cult
  – 3 sets of a positive Coliform
  – 3 sets of  positive coliform/E/coli
  – 3 sets of a negative control
 ATCC Strains
                     QA/QC con’t
–Incubator
    Maintain the temperature specified by the method 
      – 35°C±0.5°C (dry incubator).  The thermometer should 
      be immersed in water or glycerine to the stem mark on 
      each shelf of use 
      – 44.5°C±0.2°C (circulating water bath) Thermometer 
      immersed in water  Have a gable cover for optimum 
      operation
      – Record thermometer readings at least twice/day (AM 
      & PM), record and initialed by analyst
    Place incubator in an area where R.T. is maintained 
 between 16 and 27°C
            Internal Requirements for Products

• IDEXX is an ISO 9001‐2009 certified facility
• IDEXX manufactures under 6 Sigma
  – = or< 3.4 defects/million opportunities
  – Goal is to improve processes to that level of quality or 
    better
• All manufacturing follows approved 
  manufacturing documentation 
• All products must meet strict QC requirements
• QA responsible to review all batch records 
  prior to releasing the product for sale.
              Certificates of Quality
• Obtain a C of Q for all our products from our 
  website
  – http://www.idexx.com/water/certificates/
  – Indicates all the testing performed for the specific 
    product and lot
  – Signed by QC for completion date of testing along with 
    QA approval
     • All products are under quarantined until the batch records are 
       reviewed and approved by QA
     • Once approved by QA, the specific product and lot is released 
       for distribution
    Material Safety Data Sheets
•   Colilert
•   Colilert‐18
•   Vessels
•   Quanti‐Trays
•   Comparator
 IDEXX Support
  1‐800‐321‐0207
   ‐ #1 Customer Support
   ‐ #2 Technical Service
    ‐#3 Select extension

‐www.idexx.com/water
That’s all folks!

  Thank You 

  Questions

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:10
posted:1/11/2013
language:Latin
pages:58