Docstoc

RNA

Document Sample
RNA Powered By Docstoc
					         ‫مقدمه‬
                      ‫‪ 10-5 ‬میکروگرم ‪RNA‬‬

                  ‫08-58% ‪ RNA‬ریبوزومی‬              ‫‪‬‬


‫‪RNA %20-15 ‬های کوچک (‪)tRNA, snRNA‬‬

                      ‫حدود 1-5% ‪mRNA‬‬               ‫‪‬‬
                            ‫‪ ‬اندازه های مختلف‬
            ‫‪ ‬معموال دارای دم پلی ‪ A‬در انتهای ’3‬
                   ‫‪ ‬جداسازی ‪:RNA‬‬
               ‫‪ ‬دست نخورده(‪)intact‬‬
                          ‫‪ ‬خلوص باال‬


      ‫‪ ‬کاربرد های ‪ RNA‬استخراج شده:‬
               ‫‪ ‬تعیین سطح بیان ژن ها‬
         ‫‪ ‬برای کلون و تهیه ‪cDNA‬‬
‫‪ ‬بررسی و تحلیل عملکرد و متابولیسم ‪RNA‬‬
‫‪ ‬روند استخراج ‪ RNA‬در خیلی از مواقع باید روی نمونه های مختلف از بافت‬
  ‫های مختلف انجام گیرد، به همین علت به گونه ای طراحی شده هست که‬
              ‫چندین پروسه استخراج ‪ RNA‬بتواند هم زمان انجام گیرد.‬
‫مشکالت در استخراج ‪RNA‬‬
                             ‫ناپایداری از نظر شیمیای ی‬          ‫‪.I‬‬


                      ‫حساسیت به ‪RNAase‬ها‬                       ‫‪.II‬‬
               ‫در زمان لیز کردن سلول، ازاد می شوند.‬        ‫‪‬‬
                                ‫موجود بر روی پوست‬          ‫‪‬‬
                         ‫به سختی غیر فعال می شوند.‬         ‫‪‬‬
   ‫پایداری که بر اثر پل های دی سولفید به وجود می اید‬   ‫‪‬‬
        ‫عدم نیاز به کاتیون های دو ظرفیتی برای فعالیت‬   ‫‪‬‬
                         ‫عوامل موثر در انتخاب روند استخراج ‪:RNA‬‬        ‫‪‬‬
                          ‫‪ ‬نوع سلولی که ‪ RNA‬از ان استخراج می شود.‬
                                                 ‫‪ ‬کاربرد نهای ی ‪RNA‬‬


‫‪ ‬امروزه با اینکه پروتکل های مختلفی برای استخراج ‪ RNA‬وجود دارد ولی در‬
    ‫اک ثر ازمایشگاه های پیشرفته از کیت های اختصاصی مربوطه استفاده می‬
                                                              ‫کنند.‬
‫نک ته مهمی که باید در تمام پروسه های استخراج ‪ RNA‬باید انجام‬
                       ‫شود!!!‬
                                               ‫‪ ‬مهار کنندهای انزیم ‪RNAase‬‬
‫‪ ‬کمپلکس های وانادیل ریبونوکلئاز مهار کننده های رقابتی ‪ ،RNAase‬ولی‬
                             ‫در محصول نهای ی این کمپلکس ها باید جدا شوند.‬
                                       ‫‪ ‬مهار کننده های پروتئینی ‪RNAase‬‬
   ‫پروتئین های نعل اسبی شکل و غنی از لوسین که در سیتوپالسم اک ثر بافتهای‬
                                                  ‫پستانداران دیده می شوند.‬
                    ‫‪ ‬استفاده از گوانیدینیوم تیو سیانات(یک دناتوره کننده قوی )‬
        ‫گوانیدینیوم تیو سیانات(‪)GTIC‬‬
  ‫‪ ‬ترکیب شیمیای ی برای غیر فعال سازی ویروس ها،مثل ویروس انفلونزا‬
                      ‫‪ ‬گوانیدینیوم اسید مزدوج گوانیدین با تیو سیانات‬
           ‫‪ ‬از بین برنده ی ساختار سه بعدی و دناتوره کردن پروتئین ها‬
‫‪ ‬استفاده برای لیز سلول ها ، غیره فعال سازی انزیم های ‪RNAase‬و‬
                                                     ‫‪DNAase‬‬
                          ‫‪ ‬توانای ی جداسازی ‪ rRNA‬از ریبوزوم ها‬
‫گوانیدینیوم تیو سیانات‬
                                   ‫‪ ‬محافظت در مقابل ‪RNAase‬‬
                                                  ‫‪ ‬استفاده از دستکش‬
                ‫‪ ‬استفاده از تیوب ها و سر پیپت های عاری از ‪RNAase‬‬
          ‫‪ ‬استفاده از مواد شیمیای ی که دارای برچسب عاری از ‪RNAase‬‬
‫‪ ‬ابزار مورد استفاده را در حرارت باال (۰۸۱ درجه سلسیوس برای چندین ساعت)‬
           ‫‪ ‬استفاده از ‪DEPC‬محلول در اب، ‪NaOH‬یا 2‪H2O‬‬
‫)‪DEPC(diethylpyrocarbonate‬‬

           ‫غیر فعالسازی نوکلئاز ها‬




      ‫تغییر کوواالن ریشه های هیستیدین‬
RNA ‫انواع راه های استخراج‬
            Extraction/Precipitation‫ رسوب دهی‬
                     Organic Isolation 
          Inorganic Isolation Methods 


 Adsorption Chromatography ‫ کروماتوگرافی تمایلی‬
                           Extraction/Precipitation Method
Step 3: Organic extraction
                  Mix thoroughly with                                              Aqueous

                  an equal volume of
                  organic solvent                     Centrifuge               Collect aqueous phase
                 e.g. phenol, chloroform, or
                 phenol:chloroform                                                 Interphase

                                                                                    Organic



                                                    Perform additional extractions for increased purity




 Crude lysate containing                       The aqueous phase contains water-
 nucleic acids and other                       soluble molecules, including nucleic acids.
 cell constituents                             Proteins and lipids become trapped in the
                                               organic phase, and are thus separated
                                               away. Insoluble debris become trapped in
                                               the interphase between the two layers
                            Extraction/Precipitation Method


Step 4: Nucleic Acid Precipitation

   Before After
           After

                             Supernatant          70% EtOH

                        Centrifuge               Wash              Centrifuge

                                  Pellet

                                                                                        Dissolve pellet
                                                                                        (H2O, TE, etc.)
Add alcohol and salt to                    • Pellet down nucleic acids.
precipitate nucleic acids                  • Wash pellet with 70% ethanol to remove
from the aqueous fraction                    residual salts and other contaminants.
                                           • Discard ethanol and allow pellet to dry.
  mRNA ‫راه های جداسازی‬
                 Oligo dT-cellulose .I
Poly(U) Sepharose Chromatography .II
        Poly(U)-coated Paper Filter   .III
               Magnetic Separation    .IV
                ‫‪Oligo dT-cellulose‬‬
                                                               ‫رایج ترین‬   ‫‪‬‬
  ‫رزین: از ۰۱ تا ۰۳ نولکوتید ساخته شده که به صورت کوواالن به سطح ذرات‬      ‫‪‬‬
    ‫التکس-پلی استیرن متصل شده است و اتصال مناسب و سریع ‪poly A‬‬
                            ‫‪mRNA‬را تضمین می کند.(درجه کارای ی %۰۹)‬
‫جدا کردن ‪ mRNA‬از ‪ Oligo dT‬با استفاده از اب یا بافر با غلظت باال‬            ‫‪‬‬
               ‫‪Magnetic Separation‬‬
‫در این روش از ذرات سوپر پارا مغناطیس استفاده می شود که از تعدادی موادی مثل پلی‬    ‫‪‬‬
  ‫استیرن، اهن اکسید، و پلی ساکارید ها ساخته شده است. این مواد وقتی در مجاورت‬
   ‫سطح مغناطیسی قرار می گیرند، خاصیت مغناطیسی پیدا می کنند و با برداشتن ماده‬
             ‫مغناطیس از مجاورتشان، خاصیت مغناطیسی خود را از دست می دهند.‬

                                                      ‫از این ذرات می توان برای:‬   ‫‪‬‬
                                         ‫‪Immunosuppression‬‬              ‫1.‬
                                             ‫‪Cell separation‬‬            ‫2.‬
‫‪ :RNA/DNA Separation‬جداسازی :‪mRNA‬ذرات مغناطیسی با ‪oligo-dT‬‬              ‫3.‬
                                                   ‫پوشیده می شود‬
‫‪Phenol-chloroform Extraction‬‬


                    ‫یک روش استخراج مایع در مایع است.‬   ‫‪‬‬


     ‫‪ ‬مورد استفاده برای جداسازی ‪DNA ،RNA‬و پروتئین‬
                            ‫روش تهیه:‬
‫تولید مخلوط ۲ فازی: حجم مساوی از فنول و کلروفرم همراه با مقداری اب‬         ‫•‬


‫جداسازی فاز با سانتریفوژ یک مخلوطی از محلول اب و یک محلول حاوی‬             ‫•‬
‫فنول اشباع با اب، کلروفرم و محلول مواد دناتوره کننده (گوانیدینیوم تیو‬
      ‫سیانات): بعد از سانتریفوژ باز ابی در باال می ماند و فاز ارگانیک در‬
                                                    ‫پایین(اساسا کلروفرم)‬
‫‪ ‬تمام ‪RNA‬در فاز ابی می ماند و ‪ DNA‬و پروتئین در وسط و بعد هم فاز الی‬


            ‫‪ ‬جداسازی ‪RNA‬از فاز ابی با رسوب دهی با ۲-پروپانول یا اتانول‬


   ‫‪ ‬نک ته: در غیاب گوانیدینیوم تیو سیانات ‪DNA‬هم در فاز ابی باقی می ماند.‬
     ‫مزیت ها و معایب روش استخراج با فنول-کلروفرم:‬
    ‫مدت زمان الزم برای انجام ان طوالنی تر از کروماتوگرافی(بر پایه سیلیکا)‬   ‫‪‬‬


‫‪ ‬مقدار ‪RNA‬مفید به دست اماده نسبت به روشه ستونی بیشتر است. (یک‬
      ‫ستون ‪ ،RNA‬برای خالص سازی گونه های ‪RNA‬ی ی کمتر از ۰۰۲‬
       ‫نوکلئوتید مانند ‪miRNA ،siRNA‬و ‪tRNA‬مناسب نیست.)‬
            ‫خالص سازی نوکلئوتید به روش ‪column-based‬‬

                                 ‫یک روش استخراج فاز جامد است‬    ‫‪‬‬


                  ‫باعث خالص سازی سریع نوکلئیک اسید ها می شود.‬   ‫‪‬‬


  ‫‪ ‬پایه این روش اتصال نوکلئیک اسید ( )‪absorption‬به فاز جامد‬
‫(سیلیکا یا ...) بر اساس ‪pH‬و محتوای نمکی بافر (بافر تریس، ‪EDTA‬‬
                                             ‫یا بافر فسفات)‬
                 Basic Principle

        Nucleic acids within a crude lysate are
               bound to a silica surface



      The silica surface is washed with a solution
     that keeps nucleic acids bound, but removes
                   all other substances



The silica surface is washed with a solution unfavorable
to nucleic acid binding. The solution, containing purified
             DNA and/or RNA, is recovered.
                 ‫رسوب دهی با اتانول‬



‫یک روش برای خالص سازی و تخلیص ‪DNA ،RNA‬و پلی ساکارید‬         ‫‪‬‬
                      ‫ها مانند پک تین و غیره از محلول ابی‬
‫اساس رسوب دهی‬

                ‫- قانون کولون‪‬‬



    ‫هوا= 1‬   ‫- ثابت دی الکتریک‬
  ‫آب=1.08‬
                 ‫اساس رسوب دهی‬


‫دو ذره باردار در آب نیروی کمتری به هم وارد می کنند‬   ‫‪‬‬


   ‫‪ ‬به علت ایجاد پوشش آبی اطراف ذره باردار و کاهش‬
                          ‫تمایل دو ذره نسبت به هم‬
               ‫اساس رسوب دهی‬
                   ‫‪ ‬ثابت دی الکتریک اتانول=3.42‬
                    ‫‪ ‬ثابت دی الکتریک آب= 1.08‬

‫با افزودن اتانول به محلول آبی اسید نوکلئوتیک تمایل‬   ‫‪‬‬
‫گروه های فسفات اسید نوکلئیک را به یون های مثبت‬
‫موجود در محلول بیشتر کرده و باعث تجمع و رسوب‬
                                      ‫آن می شود.‬
‫بررسی اسیدهای نوکلئیک‬
         ‫از طریق اسپکتروفوتومتری‬    ‫‪‬‬
                         ‫‪ ‬کمیتی‬
                         ‫‪ ‬کیفیتی‬
             ‫رنگ های فلوئورسنت‬      ‫‪‬‬
                  ‫‪ ‬ژل الکتروفورز‬
    A260        1.0  50 g/ml
DNA
    A260/A280   1.6 - 1.8
    A260        1.0  40 g/ml
RNA
    A260/A280   ~2.0
             ‫تجزیه و تحلیل نوکلئیک اسید از طریق‬
                   ‫اسپک تروفتومتری ‪UV‬‬




‫با اندازه گیری مقدار نور جذب شده توسط نمونه در طول موج خاص ، ممکن است بتوان‬   ‫‪‬‬
 ‫غلظت ‪ DNA‬و‪ RNA‬را براورد کرد. اوج جذب در اسیدهای نوکلئیک ~ 062‪nm‬‬
                     ‫میزان خلوص نمونه‬
                                                                    ‫1.‬
‫‪‬‬   ‫‪A260/A280 ratio‬‬                ‫‪ dsDNA‬برای 8.1~‬
                                   ‫‪ ssRNA‬برای 0.2~‬

     ‫‪ ‬نسبت کمتر از 7.1 معموال الودگی پروتئین قابل توجهی نشان می دهند.‬
                 ‫میزان خلوص نمونه‬
                                                   ‫2.‬
‫‪‬‬   ‫082‪A260/A230 ratio of DNA and RNA =A260/A‬‬
    ‫)8.1 ≥ ‪ratio (and therefore‬‬
     ‫‪ ‬نسبت کمتر ممکن است آلودگی توسط مواد آلی نشان‬
            ‫دهد (مانند فنل ، الکل ، یا کربوهیدرات ها).‬
               ‫میزان خلوص نمونه‬
                                               ‫3.‬
 ‫‪ ‬کدورت می تواند منجر به اشتباه در خواندن شود.(به‬
                                  ‫دلیل تداخل نور )‬
‫‪ ‬نوکلئیک اسید نور با طول موج ۰۲۳ نانو متر را جذب‬
 ‫نمی کنند. پس، برای تصحیح اثرات کدورت می توان‬
   ‫میزان جذب نور در 023‪ A‬را از اعداد مربوط به‬
       ‫جذب های 082‪ A230 ،A260 ،A‬کم کرد.‬
        DNA / RNA ‫کمی سازی و انالیز‬
I.     Spectrometric determination at 260nm

II.    Gel Electrophoresis

III.   Agilent technology
                   ‫الک تروفورز‬
            ‫‪ ‬اسید نوکلئیک ها دارای بار منفی (-4‪)PO‬‬
       ‫‪ ‬الکتروفورز براساس اندازه جداسازی می کند.‬
  ‫‪ ‬ژل آگاروز، رایج ترین ژل برای الکتروفورز است.‬
         ‫’‪bromide/SYBR green ‘stains‬‬
‫‪ Ethidium‬‬
  ‫‪DNA & RNA‬‬
  ‫‪ Fluorescent colour under UV illumination‬‬
‫اماده سازی ژل اگاروز‬
                             ‫اگاروز: پودر سفید رنگ. پلی‬
                   ‫ساکارید(پلیمر گاالک توز) که از یک نوع‬
                        ‫جلبک دریای ی به دست می اید.‬


                   ‫‪1% (w/v) dissolves in‬‬
                   ‫‪Tris-acetate buffer at‬‬
                   ‫‪~60 °C and the‬‬
                   ‫03~ ‪solution sets at‬‬
                   ‫‪°C‬‬
                     ‫ژل اگاروز‬

             Markers (DNA Ladder)   _
                 Known Sizes


Largest (1,500bp)

Smallest (100bp)


                                    +
Agilent Technology
Electropherogram showing Agilent
       analysis of total RNA
                                 28S


               18S
Fluorescence




               Times (seconds)
         ‫هیبریداسیون و شناسای ی ‪DNA‬و ‪RNA‬‬
 ‫در الکتروفورز با ژل آگاروز در نوکلئیک اسید ها بر‬   ‫‪‬‬
‫اساس سایز جدا می شود ولی نوع ‪DNA‬و ‪RNA‬را‬
                             ‫نمی تواند تشخیص دهد.‬
‫پروب های نوکلئیک اسید برای شناسایی توالیهای مورد‬    ‫‪‬‬
                     ‫نظر ما در ژل استفاده می شود.‬
 ‫پروب یک توالی نوکلئیک اسید مشخص و شناخته شده‬       ‫‪‬‬
                                             ‫است.‬
                   ‫اساس ان جفت شدن باز ها هاست.‬     ‫‪‬‬
    RNA ‫و‬DNA ‫هیبریداسیون و شناسای ی‬
 ‫ بسیاری از پروسه ها در زیست مولکولی از وصل و روشهای زیر استفاده می‬
                                                             .‫کنند‬
 Southern       (DNA) or Northern (RNA)
  blotting
 In situ hybridisation
 Microarrays
 Antisense technologies
                                        nylon membrane and
                                          transferred DNA

            TREAT and BLOT GEL
              Transfer to nylon
                 membrane




                                   HYBRIDISATION OVEN
                                  Incubate filter and probe in
                                      hybridisation buffer
Southern/Northern
     Blotting
      and
  Hybridisation
                ‫سانتریفوژ شیب غلظتی‬
•   rate zonal/sucrose (size fractionation)
    • electrophoresis more common

•   isopycnic/CsCl (density)
    • DNA ~1.7 g/cm3
                                          1.74




                               density (g/cm3)
    • protein ~1.3   g/cm3
    • RNA > DNA                           1.72

    • ssDNA > dsDNA                       1.70
    • GC content
                                          1.68
                                                 20      40    60       80
                                                      % GC base pairs
Plasmid DNA
‫جداسازی نوکلئیک اسید ها توسط شیب غلظت ‪CsCl‬‬
pH & SALT

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:26
posted:12/23/2012
language:Persian
pages:47