Presentazione di PowerPoint - Clinica Pediatrica Trieste by co2Sqr

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									                     L’intolleranza al glutine

  Alberto Tommasini, Laboratorio Immunologia Pediatrica, IRCCS Burlo Garofolo
                              tommasini@burlo.trieste.it




Lez.16: 15/01/2007   www.pediatria.univ.trieste.it/didattica/biol/ppt/genfunz_06_16.ppt
Che cosa è la celiachia Intolleranza al glutine




            1900 Intolleranza alimentare
            1940 I derivati del frumento
Che cosa è la celiachia Intolleranza al glutine


   Grano (orzo, segale e avena)
   Glutine (massa coesiva elastica-proteine di deposito)




        Pane                       Additivi       Pasta
                    Pizza
                COLLOSITA’ = LIEVITAZIONE
Che cosa è la celiachia alimenti privi di glutine

                             Alimenti privi di glutine
                             - mais
                             - patate
                             - riso
                             - carni
                             - pesce
                             - frutta
                             - verdura
                             - legumi
                             - alimenti speciali
Che cosa è la celiachia Perché il glutine
                                             200 anni
30%   Glutine



2%




      Infezioni                             DQ2/DQ8
Quanto è frequente     IL PASSATO

                       IL PASSATO
                       Rara 1:1000/ 1:10000
                       Quadro clinico: ben
                       caratterizzato;
                       enteropatia glutine-dipendente

                       Patogenesi: non compresa

                       Diagnosi: lungo iter; 3 biopsie
 Arresto di crescita
 Distrofia             “Celiachia”
 Diarrea
 Meteorismo            Prevenzione: ritardare
                       l’introduzione del glutine.
Che cosa comporta        enteropatia

                              Alimenti privi di glutine




       Villi normali (enorme       Atrofia dei villi
       superficie di assorbimento)
Quanto è frequente   IL PRESENTE

                     Frequente 1:100/1:250 (testing, screening)
                     Quadro clinico: polimorfo; enteropatia
                     NON necessaria silente/latente/potenziale
                     G.I. = “casi atipici”
                     Patogenesi: alterata risposta immune
                     geneticamente determinata.
                     Diagnosi: semplificata; autoanticorpi
                     (EMA, htTG)
                     1 (o NO?) biopsia.
                     “Genetic gluten Intolerance”
                     Prevenzione: glutine “tanto e subito”
                     Screening di massa?
Che cosa comporta                Quadro clinico polimorfo

          Ca intestino                           Alopecia
                          I:1              I:2

                                    Diarre
                                    a
          II:1     II:5         II:2        II:3                  II:4
                                    cronica
                                                     “sempre stanca”, 2 aborti
                                                     EMA+, tTG+

                 III:1 III:2      III:3      III:4
                                                     Anemia              epatite C, EMA+,
                      Sjögre                         tTG+
                      n
                    EMA+,      IV:1 IV:2                  IV:3
                    tTG+
             Tiroidite, Alopecia
             1 aborto EMA+, tTG+

                                             V:1       V:2
                                          diarrea
                           Non solo intestino:
  varietà delle patologie associate alla celiachia in un’unica famiglia
Che cosa comporta         Malattie associate

 MALABSORPTION               Alimenti privi
                            AUTOIMMUNITY               di glutine
                                                           OTHER

 Iron deficient anaemia     Duhring dermatitis             Down syndrome
 Short stature              Autoimmune Ataxia              Williams syndr
 Osteopenia                 Coeliac Hepatitis              Turner syndr
                            CEC                            IgA defect
                            Multiple miscarriages
                            Dental Enamel Defect
                            Alopecia
                            Biliary Cyrrosis
                            IDDM
                            Autoimmune thyreopathy
                            Sjogren, JCA
                            Autoimmune hepatitis
                            Macroamylasemia
                            Idiopathic dilatative cardiomyopathy
                            Infertility/pregnancy
Che cosa comporta                     Manifestazioni autoimmuni

                       IDDM                                  Autoimmune Thyroidopathies
 7%                                                7%
                                           6,2%
 6%          p<0.01                                6%
                                                                                     p<0.01
                                    4,7%           5%
 5%
 4%   3,5%                                         4%
                                                               n.s.                            3,1%
 3%                       n.s.                     3%
 2%                                                2%   1,3%   1,2%
                             0,8%                                     1,0%             0,7%
 1%                                                1%                         0,3%
              0,0%    0,0%
 0%                                                0%
      CD      Crohn   Controls <2   2-10   >10          CD      Crohn Controls <2       2-10   >10


                                                                            ETA’
                                                  ATTITUDINI              diagnosi IDDM
                                              GLUTINE
                                                                             2.7a              2.4%
                                           TANTO E SUBITO

                                             POCO GLUTINE                    8.4a              20%
Quanto è frequente           testing

 Cercare l’intolleranza al glutine in soggetti con un’ampia gamma di
 sintomi, anche in assenza di sintomatologia intestinale
  19 pediatri di famiglia
  20.200 bambini
  Celiaci noti:10 (1:2020)

  EMA quando:
  - anemia sideropenica,
  - DAR,
  - malattie autoimmuni,
  - bassa statura,
  - S.Down,
  - ipertransaminasemia,
  - parenti.
Quanto è frequente            Screening



 •Trieste: SCREENING DI POPOLAZIONE CON TEST ELISA IN
 SCOLARI SANI (n.3665) ( Tommasini et al ADC 2004 )
                     1:90

 •Baltimora-Trieste: ( 13145 americani) (Fasano et al Arch Int Med 2003 )
 SOGGETTI SANI        1:133 (31/4126)
 SOGGETTI “A RISCHIO” 1:28 (319/9019)

 •Trieste: PROGETTO BRASILE- SU 1030 BAMBINI
 OSPEDALIZZATI ( Trevisiol et al JPGN 2002 )
                      1:49 ( 1:400 in donatori di sangue.)
Cause e meccanismi        risposta immune: infezione da glutine


    Anticorpi anti-glutine (AGA)
    Linfociti T anti glutine produttori di INFgamma

    Risposta simile a quella verso un agente infettivo
    continuamente somministrato

    Che cosa rende il frumento tossico per qualcuno?

    Perché solo per qualcuno?

    Quali prospettive terapeutiche?
Cause e meccanismi   la teoria immune
Cause e meccanismi         la teoria immune: HLA




 L’85 % dei celiaci
 ha l’HLA DQ2, il
 10% il DQ8:
 Ruolo
 patogenetico
 dell’HLA?

                 peptide
Cause e meccanismi            la teoria immune: HLA




       Biopsia di soggetti celiaci in GFD
       - incubate per 18 h con digesto peptico-triptico di gliadina
       - isolamento di cellule CD25+ e allestimento di linee e cloni T
       - misura della risposta proliferativa specifica al glutine
       - inibizione dell’attivazione con anticorpi anti-specifici HLA
           T riconoscono il glutine in maniera ristretta dal DQ2
Cause e meccanismi          la teoria immune: HLA




        Streptavidina-RPE



                             HLA              Peptide
Cause e meccanismi   Ruolo della transglutaminasi




 JEM 2000
Il modello celiachia         Alterata immunità - ambiente

                                  G            G
                                           G
                                                           G

                                           G

                                                           G

                                      G                    G
                       tTG
                             tTG

                             NH   2

                                      GD
               Danno
                                          GD


                        IFN-

                             TNF-                 IFN-

                                                      TNF-
                                                       Metalloproteinasi
Il modello celiachia   Alterata immunità - ambiente



                                                                              Peptide di
                                          Idrolisi dell’antigene              gliadina
                                                                        MHC         TCR

                                      Anti glutine




                                                                    B                          Th


                                                                   Anti tTG
                         Gliadina



                                                                                           B
                          Transglutam inasi
Il modello celiachia           Studio con librerie anticorpali



  1) Amplificare l’mRNA                                             C-DNA
     che codifica le regioni                       Ag      scFv
     variabili delle Ig.
                                               T
                                               a
                                            scFv   gene3
                                                             scFv
                                               g
                                           VH K
                                            V
  2) Clonare i c-DNA
    in vettori fagici.



                                                              Antigene
                                   C-DNA
  3) Selezione dei fagi
  che riconoscono                             Ciclo fagico
                                                                  Lavaggio
  la tTG.
Il modello celiachia               Studio con librerie anticorpali



• Gli anti TTG nel celiaco sono prodotti solo e soltanto dai linfociti della
  mucosa intestinale (Marzari et al. J. Immunol, 2001).

•   “Epitope mapping” ovvero esiste una specificita’ epitopica degli anti TTG
    nel celiaco (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001 ).

• Anche altri autoanticorpi, quando presenti nel celiaco, sono prodotti dai
  linfociti della mucosa intestinale ( Boscolo S. et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr.
    2001).

• La produzione di autoanticorpi da parte dei linfociti intestinali prescinde
  dalla presenza e dalla gravita’ della lesione istologica e puo’ NON essere
  rilevabile nel siero (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001 ).
Il modello celiachia          Epitope mapping


            N1             CORE         L     C1             C2

        1        139 140          454   478        585 586        687
  tTG
    1
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    9
   10
   11
   12                                          Sblattero D et al Eur J Biochem 2002
Il modello celiachia       Epitope mapping



SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI ANTI-tTG: profilo di
riconoscimento dei frammenti di tTG




                       Celiaci                  Soggetti con altre malattie
                       (VERI POSITIVI)          (FALSI POSITIVI)

                                  Sblattero D. and Not T., J. Immunol.
Il modello celiachia   Epitope mapping




  Atassia da glutine    PBL library




                        IBL library
Il modello celiachia     Intolleranza latente e autoimmunità



        Roberto (un diabete manifesto, una
               celiachia latente ?)
 •   IDDM a 15 anni (atleta)
 •   Screening: EMA, tTG negativo
 •   DQ8
 •   Biopsia intestinale: morfologia normale
 •   Libreria fagica da linfociti intestinali: significativa
     produzione di anti tTG con specificità epitopica della
     celiachia
Intolleranza e autoimmunità


    Reazioni autoimmuni

    Associazione con malattie autoimmuni
Intolleranza e autoimmunità Poliendocrinopatia e tolleranza


 APECED : POLIENDOCRINOPATIA AUTOIMMUNE
          CON DISPLASIA ECTODERMICA E CANDIDIASI
          (paratiroidi, surrene, fegato etc.)

            • Gene AIRE: Educazione nel timo dei linfociti T regolatori
              Science 2002

 IPEX :    POLIENDOCRINOPATIA AUTOIMMUNE
           CON ENTEROPATIA X-LINKED
           (pancreas, tiroide, intestino etc)

           • Gene FOXP3: Funzione dei linfociti T reg
             Science 2003

 APSII :   POLIENDOCRINOPATIA AUTOIMMUNE DI TIPO II
           (surrene, pancreas,….)

           • Nessun gene identificato, ma difetto funzionale dei T reg
Intolleranza e autoimmunità Poliendocrinopatia e tolleranza
Intolleranza e autoimmunità   Poliendocrinopatia e tolleranza




 • Generati nel timo dove acquisiscono la tolleranza
   verso antigeni self (funzione di AIRE)
 • Scarsa capacità proliferativa e bassa produzione di
   citochine linfotrope
 • Esprimono gli antigeni CD4 e CD25, FOXP3, CTLA-4
    (polimorfismi associati alla celiachia!)
 • Esplicano azione soppressoria per contatto cellulare
Intolleranza e autoimmunità Celiachia e funzione regolatoria




        Diluizione del CFSE durante la divisione cellulare
Intolleranza e autoimmunità                                             Funzione dei CD4+CD25+



                                                                1:0   2:1 1:2                       0:1
                                   anti CD3
 Soppressione della proliferazione di cellule effettrici                  Soppressione della proliferazione di cellule effettrici
                                   anti CD28
        da parte di linfociti CD4+CD25+ (2:1)                                    da parte di linfociti CD4+CD25+ (1:2)
                                                                                               60
                                                                                               40
                       50
  % di soppressione




                                                                           % di soppressione
                                                                                               20
                                                                                               0
                                                                                           -20
                       -50                         CD25+/CD25- 1:2
                                                  CD25+/CD25- 1:2                                                  Solo CD25-
                                                                                                                 Solo CD25-
                                                                                           -40
                                                                                           -60
                      -150                                                                 -80
                             Pazientepotenziale
                             CD florida CD          Controlli                                       CD florida    CD potenziale   Controlli

                             celiaco
                                    p = 0,02                                                                     p = 0,01
Intolleranza e autoimmunità       Difetto di tolleranza

  Abbiamo dimostrato che nei celiaci la funzione regolatoria
  appare deficitaria (anche in assenza di altre malattie
  autoimmuni associate). Non sappiamo se il difetto dipenda
  dalle cellule T reg o dalla suscettibilità alla soppressione delle
  cellule effettrici.
  E’ possibile che questo difetto contribuisca all’intolleranza al
  glutine stessa (pre-esistente al glutine).
  E’ anche possibile che il difetto sia condizionato dalla risposta
  infiammatoria mucosale anti-glutine (conseguente al glutine).
  Ciò spiegherebbe la dipendenza del rischio di autoimmunità
  dal tempo di esposizione al glutine.
  La risposta a questi quesiti può venire dall’analisi della
  funzione T reg negli stessi soggetti esaminati dopo un congruo
  periodo di dieta senza glutine.
Come si può curare




          DALLA CONOSCENZA DEI PEPTIDI TOSSICI
          A NUOVE TERAPIE



          Induzione di tolleranza

         - peptidasi batteriche

         - riso transgenico?
Come si può curare             Induzione di tolleranza




       Modello del topo trasgenico DQ8

       La somministrazione nasale di gliadina ricombinante diminuisce
       la risposta T cellulare alla Gliadina somministrata per via sistemica


       Ma il modello è molto diverso
       - Interessa la risposta sistemica alla gliadina e non quella mucosale
       - una ridotta risposta non è l’obiettivo
Come si può curare      Peptidasi




       Il peptide tossico di 33 aa, che viene deaminato
       dalla transglutaminasi e riconosciuto dall’HLA
       DQ2, potrebbe essere specificamente scisso da
       peptidasi batteriche che potrebbero essere
       utilizzate per pretrattare il cibo
Come si può curare               Peptidasi




   Digestione inefficace dei peptidi         Efficace completamento della
   tossici da parte degli enzimi del         Digestione con Prolyl
   brush border intestinale                  endopeptidasi batterica
Come si può curare       Riso transgenico

       STRATEGIE ADOTTATE PER “DETOSSIFICARE” IL
                      FRUMENTO

 • Breeding e selezione di linee di frumento a basso
   contenuto in gliadine
 • Modificazioni per eliminare le sequenze antigeniche


                      PROBLEMATICHE

 Elevato numero di geni distribuiti su 42 cromosomi
 Elevata variabilità genetica
 Diffusione di varietà coltivate
Come si può curare      Riso transgenico


                               STRATEGIA


                                  Utilizzare un cereale non
                                          allergenico
                                           Oryza sativa



  Migliorare le proprietà
  tecnologiche introducendo
  le sequenze gluteniniche
  con le migliori
  caratteristiche reologiche

								
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