Trabajo Practico No 2 Preparacion de medios de cultivo y by TsaZdafc

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									                                       Trabajo Practico Nº 2:

             PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACION
                            POR CALOR HUMEDO


Objetivos:

Que el alumno aprenda a:
    - Conocer, diferenciar, clasificar y preparar (pesada, preparación esterilización y
         conservación) los diferentes medios de cultivo utilizados en el laboratorio de
         microbiología.

                                  FUNDAMENTOS TEÓRICOS

                                        Medios de Cultivo

       Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener
microorganismos en un laboratorio, y esto sólo es posible si se dispone de los medios de cultivo
adecuados.

         Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes, en los que crecen y se
multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar las diferentes especies
bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo estudios complementarios.
         Los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos,
evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar agua y alimentos, en microbiología industrial y
otras actividades.
         Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energía, carbono, nitrógeno,
fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio adecuado dependerá de la
especie que se quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. El
conocimiento del hábitat normal de un microorganismo es a menudo útil para elegir un medio de
cultivo apropiado, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural. Un medio se
utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos específicos o para facilitar la
identificación de una especie en particular. En estos casos, la función del medio estará también
determinada por su composición.


Agentes gelificantes.

         El agar es un polímero sulfatado de azúcares, obtenido de algas marinas, compuesto
principalmente por D-galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y ácido D-glucurónico. Es un buen agente
solidificador porque, una vez que se funde en agua hirviendo, puede enfriarse hasta una temperatura
de 40 a 42º c, sin endurecerse, y no fundirá de nuevo hasta que no se alcance una temperatura de 80
a 90ºC. Es también excelente porque la mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo.
Puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la
industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis
en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce se utiliza en trabajo
microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.
         La gelatina es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es
hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es
bajo (licua a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es
la temperatura óptima de crecimiento para muchos microorganismos.


       Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más
importantes son aquellos que se basan en:

                                  Líquidos
         Consistencia
                                  Sólidos
                                  Semisólido
                                  Complejos
         Composición              Sintéticos
                                  Semisintéticos

                                  Enriquecimiento o Multiplicación
                                  Selectivos o Inhibidores
                                  Enriquecidos
                                  Diferenciales
     Utilización o función
                                  Identificación
                                  Transporte


    1. Según su consistencia

Medios Líquidos.
        Son los que se presentan en este estado, denominándose por ello caldos. Contienen los
nutrientes antes citados, con adición de algún tampón, capaz de mantener el pH adecuado. Se utiliza
fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una
determinada concentración.
        Ejemplos: caldo nutritivo, caldo tioglicolato, agua peptonada, etc.

Medios Sólidos.
         Se prepara añadiendo un agente gelificante a un medio líquido determinado. Los más
usados son gelatina y agar.
Este conjunto, convenientemente esterilizado, se vierte en una placa de Petri o en tubos. Las
exigencias nutritivas y las condiciones físico-químicas son similares a las de los medios líquidos.
Pero, a diferencia de ellos, presentan la posibilidad de obtener colonias aisladas, siempre que la
cantidad de inóculo esté suficientemente diluida. En este caso se puede observar la existencia de
colonias separadas unas de otras, y cada una constituye un clon (conjunto de bacterias que
provienen de una célula madre, con el mismo patrimonio hereditario y las mismas características
fisiológicas).
         Ej.: agar nutritivo, agar EMB, CLDE y todos los medios de aislamiento primario y de
identificación.

Medios Semisólidos.
         Se preparan a partir de medios líquidos, agregando un agente solidificante en una
proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la
movilidad de las bacterias.
    Ej.: agar cepa, SIM, medios base para utilización de aminoácidos.
    2. Según su composición.

Medios complejos.
        Son aquellos que contienen ingredientes cuya composición no es exactamente definida, y
por consiguiente no es rigurosamente constante. Además, no se conoce exactamente la proporción
de cada uno de sus componentes. Esto tiene ciertos inconvenientes en condiciones experimentales,
donde la reproducibilidad no podrá ser exacta. En la práctica estos medios dan excelentes resultados
y son los más empleados.
        Ejemplo: caldo nutritivo.
Medios Sintéticos
        Son aquellos que poseen exclusivamente componentes químicos definidos (se conocen
todos los componentes) disueltos en agua destilada, donde la proporción de cada uno de sus
componentes es conocida exactamente. Entre ellos se encuentran los medios mínimos, pues en ellos
se intenta comprobar el crecimiento de una bacteria determinada, con muy pocos nutrientes. Los
medios definidos son ampliamente usados en investigación, pues a menudo se quiere conocer qué
está metabolizando el microorganismo experimental.
        Ejemplos: medio basal de sales y una fuente de carbono determinada.

Medios Semisintéticos.
    Cuando alguno de sus componentes no tiene composición definida. En estos casos, se añaden
factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo, extracto
de levaduras, peptona cono fuente de nitrógeno, glucosa como fuente de carbono.


    3. Según su utilización o función.

Medios de Enriquecimiento.
        Se basan en la libre competencia por los sustratos. Son siempre líquidos que favorecen o
permiten la multiplicación de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de otras. Pueden ser: de
enriquecimiento propiamente dichos, que se basan en las propiedades metabólicas del
microorganismo, o de enriquecimiento selectivo, en cuyo caso se agrega un agente de selección
que puede ser, un colorante, un antibiótico, etc. Este agente de selección no favorece el desarrollo
del microorganismo a enriquecer, sino que inhibe a la flora acompañante.
     Ejemplos:
      agua peptonada alcalina, se utiliza para V cholera (donde el pH alcalino inhibe a todas las
         enterobacterias menos al Vibrio)
      caldo selenito, actúa inhibiendo el desarrollo de casi todas las enterobacterias menos de
         Salmonella y Shigella.
      caldo tioglicolato
      caldo infusión cerebro corazón (BHI)

Medios Selectivos (o Inhibidores)
        Pueden ser sólidos o líquidos, a los que se les agrega uno o más agentes de selección.
Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares, en los que la “selectividad” se consigue
alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo compuestos químicos, que sean nocivos
para las bacterias cuyo crecimiento no interesa. Los medios inhibidores pueden considerarse una
variante más restrictiva de los medios selectivos. Las posibilidades de selección son infinitas y
existen decenas de medios selectivos especiales disponibles.
     Ejemplos:
       - Agar Endo, eosina azul de metileno (EMB o Levine), agar MacConkey. (Las sales biliares
  o colorantes como la fucsina básica y el cristal violeta, componentes de estos medios, favorecen el
  crecimiento de bacterias gramnegativas, al inhibir el crecimiento de bacterias grampositivas).
       - Agar salmonella-shigella (SS): medio selectivo para recuperar Salmonella spp y Shigella
  spp. (Las sales biliares, el citrato de sodio y el verde brillante son inhibidores de los grampositivos
  y de algunos gramnegativos. Las posibles colonias de Shigella aparecen amarillas y las posibles de
  Salmonella aparecen negras).
       - Agar Tayer Martin: el medio base es agar chocolate con agregado de antibióticos para
  inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes:
       - trimetroprima para inhibir Proteus spp y otros gramnegativos,
       - vancomicina para inhibir grampositivos y
       - nistatina para inhibir levaduras.
Medios Diferenciales.
           Son siempre sólidos y se utilizan para diferenciar colonias. Son medios que diferencian
entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa según las
características biológicas del microorganismo. A estos medios se les agrega, por ejemplo, un
indicador de pH que permite diferenciar a microorganismos que fermentan un determinado hidrato
de carbono.
     Ejemplos:
     - Eosina azul de metileno (EMB- Levine): permite diferenciar bacilos gram negativos
           fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las bacterias no fermentadoras dan colonias
           transparentes y las fermentadoras rosa o rojas, y E coli da colonias con brillo verde
           metálico. Estas coloraciones son producidas por la presencia del indicador de pH eosina
           amarilla y del colorante azul de metileno (éste inhibe el desarrollo de la mayoría de los
           gram positivos y junto a la eosina sirve como indicador de fermentación ya que a pH ácido
           los colorantes precipitan).
     - El agar MacConkey es tanto diferencial como selectivo, contiene lactosa y colorante rojo
           neutro, las colonias fermentadoras de lactosa aparecen de color rosa a rojo y son fácilmente
           distinguibles de las no fermentadoras.
     - Agar MacConkey-sorbitol. Es un medio diferencial que permite sospechar en 24 hs la
           presencia de E coli O157 en materia fecal, dado que esta especie no fermenta el sorbitol.
     - El agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) sirve para diferenciar patógenos entéricos. La
           mayoría de los no patógenos fermentan lactosa, sacarosa o xilosa y producen colonias
           amarillas. Shigella spp. no fermenta estos azúcares y da colonias rojas. Salmonella spp y
           Edwarsiella spp fermentan xilosa pero producen lisina decarboxilasa produciendo
           cadaverina que neutraliza los ácidos de la fermentación y dan colonias rojas con centros
           oscuros porque producen ácido sulfúrico.
     -      Agar cisteína lactosa deficiente en electrolitos (CLDE), contiene lactosa y permite
           diferenciar las bacterias fermentadoras de lactosa (colonias amarillas) de las no
           fermentadoras (colonias incoloras).

Medios Enriquecidos.
        Son medios a los que se le agrega un nutriente extra (además de las sustancias nutritivas
normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos
exigentes). Pueden ser líquidos o sólidos. En estos medios no crece un determinado grupo de
bacterias sino todas. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos
biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, líquido ascítico, etc.) que aportan dichos factores. En
ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento
del mismo, por ejemplo Polivitex, Isovitalex, etc.
        Ejemplos: agar sangre, agar chocolate, caldo infusión cerebro-corazón, caldo tristona-
soya.
Medios de Identificación.
         Son los medios destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para
reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios
para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser
metabilozado y el indicador que nos muestre el resultado.
         Ejemplos.: agar citrato de Simons, agar sulfhídrico-indol-movilidad (SIM), agar manitol
salado, agar DNAsa, agar triple azúcar hierro (TSI), y en general, cualquier medio al que se le
haya añadido un elemento diferencial, son medios utilizados para identificación.
         Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de
identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente identificar los
gérmenes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos
específicos.


Medios de Transporte.
         Se usan para transporte de aquellas muestras que no van a procesarse de inmediato o que
deban ser trasladadas de un laboratorio a otro, y que puedan contener microorganismos
“fastidiosos” para su desarrollo por lo que se debe impedir el sobrecrecimiento de bacterias que
colonizan con frecuencia piel y mucosas. Estos medios son generalmente semisólidos, tamponados
y sin sustancias nutritivas.
         Ejemplos: Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.


                                 PARTE EXPERIMENTAL

    La preparación de un buen medio de cultivo es fundamental para un buen diagnóstico
bacteriológico. El éxito de la preparación está influenciado por una serie de factores como:

       Exactitud de la pesada y perfecta medición del volumen de agua
       Control de pH
       Correcta disolución del medio de cultivo
       Correcta esterilización
       Correcta conservación del medio de cultivo
       Correcto fraccionamiento.

    Para la preparación de medios se parte de mezclas deshidratadas de los compuestos que la
integran. Habitualmente sólo es necesario añadir agua y esterilizar en autoclave, pero en algunas
ocasiones es necesario añadir después de la esterilización algún componente termolábil que no
hubiera resistido el calor.

    Los medios deshidratados presentan ventajas:
    - son muy estables,
    - su utilización es muy simple, pudiendo prepararse poco tiempo antes de su utilización,
    - una pequeña cantidad del producto permite la preparación de una importante cantidad de
        medio, no necesitando un gran volumen de almacenamiento,
    - son económicos.
                      ACTIVIDADES A REALIZAR POR EL ALUMNO.

Los alumnos separados por comisiones se encargaran de la preparación de los medios de cultivos
asignados por el jefe de trabajos prácticos.

        Para la preparación de los medios de cultivos se deberán tener en cuenta las indicaciones
del fabricante.

Procedimiento general:

       pesar la cantidad de medio de cultivo indicada por el fabricante.
       colocar las cantidades pesadas en un frasco adecuado (previamente limpio y rotulado) que
        será el recipiente en el cual se va a esterilizar el medio de cultivo.
       disolver el medio de cultivo agregando agua destilada hasta completar el volumen total y
        calentar a baño maría hasta disolución total del medio.
       Verificar rápidamente el pH y ajustarlo, si es necesario, al valor indicado por el fabricante.
        Es indispensable efectuar esta verificación, pues el pH del agua destilada puede variar
        según las condiciones de obtención y almacenamiento. El ajuste debe hacerse a temperatura
        ambiente.
       Una vez preparados los medios deben esterilizarse. La mayoría de los medios de cultivo se
        esterilizan en autoclave, durante 15 minutos, a 121ºC.
       Los medios sólidos se reparten cuando todavía están fundidos y se dejan solidificar en su
        envase definitivo (placa o tubo).
       Si los medios de cultivos no son fraccionados en el momento, deberán conservarse a 4ºC
        (heladera) por periodos variables. Deben ser etiquetados y se debe aclarar la fecha de su
        esterilización.
       Si hay que añadir sustancias de enriquecimiento termolábiles, se hace después de la
        esterilización, y con el medio más frío pero aún fundido. La adición debe ser aséptica y
        lenta, para conseguir homogeneidad.
       Los medios solidificados en placa deben ser puestos a temperatura ambiente y despojados
        de la humedad que pudiesen tener antes de su utilización.

   Los medios deshidratados son muy higroscópicos, es indispensable que los frascos
permanezcan abiertos solo el tiempo necesario para la obtención del producto. Su conservación
debe hacerse en lugar fresco y seco y no deben utilizarse los medios hidratados ambientalmente.

    Los medios deben someterse a un control de calidad que abarcará los siguientes aspectos:
    o Control de esterilidad: se efectúa incubando algunas placas del lote escogidas al azar y
        verificando la ausencia de crecimiento bacteriano.
    o Control de composición: se realiza para comprobar que el medio posee los componentes
        que lo caracterizan de manera que permita el crecimiento de determinados gérmenes.
    o Control de caducidad: se realiza para utilizar las placas durante el tiempo que garantice su
        correcta utilización. Por término medio las placas preparadas pueden conservarse entre 15
        días y dos meses.


Bibliografía.

  1. Microbiología Clínica. Módulo 1. Taxonomía y Fisiología Microbiana. Recolección y
     transporte de muestras para el diagnóstico de infecciones. AAM- Colegio de Bioquímicos
     de la Provincia de Entre Ríos- Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas Universidad
     Nacional del Litoral. 1997.
2.   Microbiología Clínica. Módulo 2. Procesamiento inicial de las muestras para el
     diagnóstico mocrobiológico. AAM- Colegio de Bioquímicos de la Provincia de Entre Ríos-
     Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas Universidad Nacional del Litoral. 1997
3.   Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiología. Cuarta Edición. 1999.
4.   Fumarola A, Rodríguez-Torres A, García-Rodríguez JA, Piedrota-Angulo G. Microbiología
     y Parasitología Médica. Segunda Edición. 1987.
5.   Díaz Martín GA. Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Medios de cultivo.
     Apuntes. Segundo curso: Laboratorio de Diagnóstico Clínico Unidad Temática 14-1, Bloque
     temático III. 2004-2005.
6.   Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiología en práctica. Manual de técnicas de
     laboratorio para la enseñanza de la microbiología básica y aplicada. Ed. Atlante. 2000.
     Cap. 7, 47-50.

								
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