Polarographische Bestimmungvon Cystin und Cystein nebeneinander

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Application Bulletin
Von Interesse für:     Allgemein Analytik, Biologie, Lebensmittel                      B 1, 3, 4, 7, 8, 13




                    Polarographische Bestimmung
                 von Cystin und Cystein nebeneinander

Zusammenfassung
                       Nach dem Abbau biologischer Proben (z.B. Milch, Wolle etc.) ist es oft wichtig, das
                       Verhältnis Cystin/Cystein zu kennen. Im Bulletin werden polarographische Bestim-
                       mungsmethoden der beiden Aminosäuren nebeneinander beschrieben. Gearbeitet
                       wird in perchlorsaurer Lösung an der DME. Bei Proben mit einem hohen Protein-
                       gehalt muss in alkalischer Lösung gearbeitet werden.


                     Methode 1: Proben, die wenig Protein enthalten

Zusammenfassung
                       Proben ohne Proteine können im perchlorsauren Medium bestimmt werden. Die
                       Bestimmungsgrenze ist stark matrixabhängig und liegt für beide Substanzen bei ca.
                       1 mg/L.


Geräte und Zubehör
                       • 746 VA Trace Analyzer mit 747 VA Stand oder
                       • 757 VA Computrace

                       Elektroden
                       • Arbeitselektrode (WE):
                         Multi-Mode-Elektrode 6.1246.020
                       • Referenzelektrode (RE):
                         Ag/AgCl/Lithiumacetat:
                         Ag/AgCl-Elektrode 6.0728.020 (c(KCl) = 3 mol/L)
                         + Elektrolytgefäss 6.1245.010
                         mit Elektrolytlösung Lithiumacetatlösung c(CH3COOLi) = 1 mol/L
                       • Hilfselektrode (AE): Platin:
                         Platinstift-Elektrode 6.0343.000
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Reagenzien
              Alle verwendeten Reagenzien sollten von höchstmöglicher Reinheit sein (p.a. oder
              suprapur). Es sollte nur Reinstwasser verwendet werden.
              •   Perchlorsäure, w(HClO4) = 70%
              •   Cystin, puriss p.a., CAS 56-89-3
              •   Cystein, puriss p.a., CAS 52-90-4
              •   Lithiumacetat Dihydrat, MicroSelect, w(LiOOCCH3·2 H2O) ≥ 99.0 %,
                  CAS 546-89-4

          Gebrauchsfertige Lösungen
              • Grundelektrolyt:
                c(HClO4) = 0.1 mol/L
              • Cystin-Standardlösung: ß(Cystin) = 1 g/L in Perchlorsäure
                0.1 g Cystin werden in 20 mL dest. Wasser aufgeschlämmt, durch Zugabe von
                0.86 mL Perchlorsäure gelöst und mit dest. Wasser auf 100 mL aufgefüllt.
              • Cystein-Standardlösung: ß(Cystein) = 1 g/L in Perchlorsäure
                0.1 g Cystein werden in 20 mL dest. Wasser aufgeschlämmt, durch Zugabe von
                0.86 mL Perchlorsäure gelöst und mit dest. Wasser auf 100 mL aufgefüllt.

Analyse

              Messlösung:
              10 mL (verdünnte) Probe
              + 10 mL Grundelektrolyt
              Das Polarogramm wird mit den folgenden Parametern aufgenommen:
               working electrode              DME
               stirrer speed (rpm)            2000
               mode                           DP
               purge time                     300 s
               equilibration time             30 s
               pulse amplitude                50 mV
               start potential                200 mV
               end potential                  -800 mV
               voltage step                   6 mV
               measure time                   20 ms
               pulse time                     40 ms
               voltage step time              0.6 s
               sweep rate                     10 mV/s
               peak potential Cystin          -490 mV
               peak potential Cystein         -80 mV
              Die Ermittlung der Konzentration erfolgt durch Standardaddition.

Bemerkungen

              • Die Peakpotentiale beider Substanzen verschieben sich mit zunehmender Kon-
                zentration nach leicht negativeren Werten. Der Wert ist evt. im Menu
                “SUBSTANCES” zu korrigieren.
              • Bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen von Cystin und Cystein müssen un-
                ter Umständen zwei Analysen in verschiedenen Verdünnungen für die jeweilige
                Verbindung durchgeführt werden.
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Abbildungen


================== METROHM 746 VA TRACE ANALYZER (5.746.0101) ==================
 Method: AB191_1 .mth         OPERATION SEQUENCE
 Title : Det of cystine and cysteine (low protein content)
--------------------------------------------------------------------------------

      Instructions     t/s    Main parameters               Auxiliary parameters
      -------------   -----   -------------------------     -------------------------
 1    SMPL>M                  V.fraction           mL       V.total              L
 2    DOS>M                   Soln.name   electrol             V.add         10 mL
 3    PURGE
 4    STIR            300.0   Rot.speed         2000 /min
 5    (ADD
 6      PURGE
 7      STIR          30.0    Rot.speed         2000 /min
 8      0PURGE
 9      0STIR         20.0
10      (REP
11         SEGMENT            Segm.name   POL
12      REP)1
13      PURGE
14      ADD>M                 Soln.name   Cystine           V.add         0.025 mL
15      ADD>M                 Soln.name   Cysteine          V.add         0.025 mL
16    ADD)2
17    END

 Method: AB191_1               SEGMENT
                                    POL
--------------------------------------------------------------------------------

      Instructions   t/s      Main parameters               Auxiliary parameters
      ------------- -----     -------------------------     -------------------------
 1    DME
 2    DPMODE                  U.ampl             -50   mV   t.meas         20.0   ms
                              t.step            0.60   s    t.pulse        40.0   ms
 3    SWEEP           101.4   U.start            200   mV   U.step            6   mV
                              U.end             -800   mV   Sweep rate       10   mV/s
 4    0MEAS                   U.standby                mV
 5    END


               Abb. 1 Methode einer Bestimmung von Cystin und Cystein nach Methode 1 mit
                      dem 746 VA Trace Analyzer
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================== METROHM 746 VA TRACE ANALYZER (5.746.0101) ==================
 Determ.       : 06111056             User: mj                    Date: 1999-06-11
 Modified      : 1999-06-11 11:12:06 Run : 18                     Time: 10:56:21
 Sample table: -
--------------------------------------------------------------------------------
  Pos. Ident.1/S1       Ident.2/S2    Ident.3/S3    Method.call    Sample size/S0
         cysHClO4                                                         10.0 mL
--------------------------------------------------------------------------------
 Method : AB191/1
 Title    : Determination of Cystine and Cysteine
 Remark1 : 10 mL background electrolyte + 10 mL sample
 Remark2 : background electrolyte: HClO4 c = 0.1 mol/L
--------------------------------------------------------------------------------
  Substance : Cysteine                                          Comments
  Mass conc.:      2.873 mg/L            Mass     : 28.73 µg    ------------------
  MC.dev.    :     0.121 mg/L (4.22%)    Add.mass :    25 µg
  Cal.dev. :       -                     V0.sample:    10 mL

              VR    U/mV      I/nA     I.mean     Std.dev. I.delta    Comments
              ---   -----    ------    ------     ------- -------     ------------------
              00    -80      -92.07    -92.09      0.0219
              01    -79      -92.11
              10    -88      -175.9    -176.9       1.432    -84.84
              11    -87      -177.9
              20    -92      -254.5    -252.3       3.016    -75.41
              21    -91      -250.2

  Substance : Cystine                                                 Comments
  Mass conc.:    5.798 mg/L                 Mass     : 57.98 µg       ------------------
  MC.dev.   :    0.090 mg/L (1.55%)         Add.mass :    25 µg
  Cal.dev. :     -                          V0.sample:    10 mL

              VR    U/mV      I/nA     I.mean     Std.dev. I.delta    Comments
              ---   -----    ------    ------     ------- -------     ------------------
              00    -483     -48.28    -48.25      0.0341
              01    -482     -48.23
              10    -487     -68.13    -68.30      0.2406    -20.05
              11    -487     -68.47
              20    -489     -89.29    -88.88      0.5862    -20.58
              21    -492     -88.46

 Substance    Techn.        Y.reg/offset        Slope        Nonlin.       Mean deviat.
 ---------    --------      ------------        ----------   ----------    ------------
 Cysteine     std.add.        -9.352e-08        -3.284e-05                  3.016e-09
 Cystine      std.add.        -4.813e-08        -8.373e-06                  3.830e-10

 Final results                              +/- Res.dev.    %         Comments
 ---------------------------------          -----------------         ------------------
   Cysteine =   2.8726 mg/L                    0.121     4.22
    Cystine =   5.7979 mg/L                    0.090     1.55

                Abb. 2 Beispiel einer Bestimmung von Cystin und Cystein nach Methode 1 mit
                       dem 746 VA Trace Analyzer
                                                                     Application Bulletin                                                                  Nr. 191/2 d
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                   De t e r m : 0 6 1 1 1 0 5 6 Id : c y s HC lO 4                                  De t e r m : 0 6 1 1 1 0 5 6 Id : c y s HC lO 4
                       S u b s ta n c e : Cy s te in e V R( **)                                     S ta n d a r d a d d itio n c u r v e : Cy s te in e




                                                                                   I (nA )
I (nA )




                                                                                             -300
          -250

                                                                                             -250
          -200
                                                                                             -200

          -150
                                                                                             -150


          -100                                                                               -100


                                                                                             -50
          -50



                 150   100       50         0      -50      -100     -150                             1       2       3       4     5      6       7        8       9
                                                                        U ( mV )                                                                  r h o ( e f f ) ( mg /L )



                                Abb. 3 Kurvenbeispiel Cystein




                   De t e r m : 0 6 1 1 1 0 5 6 Id : c y s HC lO 4                                  De t e r m : 0 6 1 1 1 0 5 6 Id : c y s HC lO 4
                        S u b s ta n c e : Cy s tin e V R( **)                                       S ta n d a r d a d d itio n c u r v e : Cy s tin e
I (nA )




                                                                                   I (nA )




          -100

                                                                                             -120

          -80
                                                                                             -100


          -60                                                                                -80


                                                                                             -60
          -40

                                                                                             -40

          -20
                                                                                             -20


                                                                                             0
                   -200      -300     -400       -500      -600      -700                                 2       4       6        8        10       12          14
                                                                        U (mV )                                                                   r h o ( e f f ) ( mg /L )



                                Abb. 4 Kurvenbeispiel Cystin
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             Methode 2: Proben mit hohem Proteingehalt


Zusammenfassung
              Proben mit Eiweiss können nicht mit Perchlorsäure als Elektrolyt bestimmt werden,
              da Proteine in sauren Lösungen ausfallen. Stattdessen wird in Ammoniumpuffer bei
              pH 9.6 gearbeitet.
              Die Bestimmungsgrenze liegt für Cystein bei ca. 50 µg/L, Cystin bei ca. 1 mg/L. Die
              Bestimmung verläuft bei Cystein bis 180 mg/L, bei Cystin bis 300 mg/L linear.

Geräte und Zubehör
              • 746 VA Trace Analyzer mit 747 VA Stand oder
              • 757 VA Computrace

Reagenzien
              Alle verwendeten Reagenzien sollten von höchstmöglicher Reinheit sein (p.a. oder
              suprapur). Es sollte nur Reinstwasser verwendet werden.
              • Ammoniak, suprapur, w(NH3) = 25%
              • Salzsäure, suprapur, w(HCl) = 30%
              • Cystin, puriss. p.a., CAS 56-89-3
              • Cystein, puriss. p.a., CAS 52-90-4
              • Natronlauge, c(NaOH) = 2.0 mol/L
          Gebrauchsfertige Lösungen
             • Grundelektrolyt:
                Ammonium-Puffer c(NH4Cl) = 1 mol/L und c(NH3) = 2 mol/L (pH 9.6)
              • Cystin-Standardlösung: ß(Cystin) = 1 g/L
                0.100 g Cystin werden in 5 mL Natronlauge gelöst und mit dest. Wasser auf 100
                mL aufgefüllt.
              • Cystein-Standardlösung: ß(Cystein) = 1 g/L
                0.100 g Cystein werden in 20 mL Ammonium-Puffer gelöst und mit dest. Was-
                ser auf 100 mL aufgefüllt.

Analyse
              Messlösung:
              10 mL (verdünnte) Probe
              + 1 mL Grundelektrolyt (NH3/NH4Cl-Puffer pH 9.6)
              Der Cystinpeak ist stark pH-abhängig und verschiebt sich bei zunehmendem pH-
              Wert in negativer Richtung.
                                        Application Bulletin                         Nr. 191/2 d
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               Das Polarogramm wird mit den folgenden Parametern aufgenommen:
                   working electrode                     DME
                   stirrer speed (rpm)                   2000
                   mode                                  DP
                   purge time                            300 s
                   equilibration time                    30 s
                   pulse amplitude                       50 mV
                   start potential                       -250 mV
                   end potential                         -1750 mV
                   voltage step                          6 mV
                   measure time                          20 ms
                   pulse time                            40 ms
                   voltage step time                     0.8 s
                   sweep rate                            7.5 mV/s
                   peak potential Cystin                 -1000 mV
                   peak potential Cystein                -500 mV
               Die Ermittlung der Konzentration erfolgt durch Standardaddition.

Bemerkungen

               • Bei einem pH-Wert über 10 wird der Cystinpeak sehr flach und unempfindlich.
               • Bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen von Cystin und Cystein müssen un-
                 ter Umständen zwei Analysen in verschiedenen Verdünnungen für die jeweilige
                 Verbindung durchgeführt werden.


Abbildungen

================== METROHM 746 VA TRACE ANALYZER (5.746.0101) ==================
 Method: AB191_2 .mth         OPERATION SEQUENCE
 Title : Det of cystine and cysteine (high protein content)
--------------------------------------------------------------------------------
      Instructions      t/s      Main parameters                Auxiliary parameters
      -------------    -----     -------------------------      -------------------------
 1    SMPL>M                     V.fraction          mL         V.total              L
 2    DOS>M                      Soln.name   buffer             V.add         1.000 mL
 3    PURGE
 4    STIR             300.0     Rot.speed          2000 /min
 5    (ADD
 6      PURGE
 7      STIR           30.0      Rot.speed          2000 /min
 8      0PURGE
 9      0STIR          20.0
10      (REP
11         SEGMENT               Segm.name    POL
12      REP)1
13      PURGE
14      ADD>M                    Soln.name    Cystine           V.add         0.050 mL
15      ADD>M                    Soln.name    Cysteine          V.add         0.025 mL
16    ADD)2
17    END
 Method: AB191_2               SEGMENT
                                    POL
--------------------------------------------------------------------------------
      Instructions   t/s         Main parameters                Auxiliary parameters
      ------------- -----        -------------------------      -------------------------
 1    DME
 2    DPMODE                     U.ampl           -50    mV     t.meas            20.0   ms
                                 t.step          0.80    s      t.pulse           40.0   ms
 3    SWEEP            201.6     U.start         -250    mV     U.step               6   mV
                                 U.end          -1750    mV     Sweep rate         7.5   mV/s
 4    0MEAS                      U.standby               mV
 5    END
               Abb. 5 Methode einer Bestimmung von Cystin und Cystein nach Methode 2 mit
                      dem 746 VA Trace Analyzer
                                                        Application Bulletin                                      Nr. 191/2 d
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B estim m u n g vo n C ystin u n d C ystein
               N a-caseinat
        -200n

                                          Cystin
                     Cystei
        -150n
i (A)




        -100n




        -50.0n



            0
                 -0.40 -0.60 -0.80 -1.00 -1.20 -1.40
                                      E (V )


  C ys tin                                                         Cystei
  c =    4 53. 062 m g/l                                           c =    30.728 mg/l
  + /-      5. 435 m g/l (1 .2 0%)                                 +/-     0.392 mg/l (1.28%)
                       -150n
                                                                                         -125n

                       -125n
                                                                                         -100n
                       -100n

                                                                                      -75.0n
i (A)




                                                                 i (A)




                       -75.0n

                                                                                      -50.0n
                       -50.0n


                       -25.0n                                                         -25.0n
             -0.0045                                                        -0.0003
                           0                                                                 0
            -5.00m              0               5.00m    10.0m           -400u   -200u           0        200u   400u

                                    c / (g/l)                                                    c / (g /l)

                          Abb. 6 Beispiel einer Bestimmung von Cystin und Cystein nach Methode 2 mit
                                 dem 757 VA Computrace

				
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Description: Nr. 191/2 d Application Bulletin