FeSBE2004 Setor 20

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FeSBE2004 Setor 20 Powered By Docstoc
					       - Setor 20 - Membranas, Bioenergéticas,
                 Canais e Transporte
Número Final: 20.001

Mecanismos moleculares envolvidos na inibição da Na+-ATPase pela
Angiotensina-(1-7) via receptor AT2 Cavalcante, F. F. * ; Camargo, A. S. de * ; Lara, L.
S. ; Lopes, A. G. ; Caruso-Neves, C. ; IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl. C - sala 34, UFRJ .
  **

Objetivo: A angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] exerce efeito bifásico sobre a atividade
Na+-ATPásica de túbulo proximal (Caruso-Neves et al, 2000). Baixas concentrações de
Ang-(1-7), de 10-11 a 10-9M, promovem estímulo da enzima, enquanto altas concentrações a
inibem. Foi observado que a fase estimulatória envolve a ativação do receptor AT 1.. No
entanto, na presença de losartan, um antagonista deste receptor, a Ang-(1-7) inibe de
maneira dose dependente a atividade Na+-ATPásica, envolvendo a ativação de receptores
AT2,. Assim sendo, o objetivo deste estudo foi investigar os mecanismos moleculares
envolvidos neste fenômeno.


Métodos e Resultados:

Os estudos foram realizados em membrana basolateral de túbulo proximal de rim de porco.
A atividade ATPásica foi medida segundo Grubmeyer e Penefsky (J. Biol. Chem. 256:
3718-3727, 1981). Observou-se o acoplamento da proteína G ao receptor AT2, uma vez que
GDPβs (n=4) reverte o efeito inibitório da enzima pela Ang-(1-7) e GTPgs (n=6) mimetiza
sua inibição. Estes dados sugerem o envolvimento da via GMPc/PKG pois: 1) LY5823, um
inibidor de guanilato ciclase (n=8) e KT5823 um inibidor de PKG (n=10) revertem o efeito
inibitório; 2) a Ang-(1-7) aumenta em 200% a atividade de PKG, sendo esse efeito
revertido pelo PD123319, um antagonista do receptor AT2 (n=7). 3) GMPc mimetiza o efeito
da Ang-(1-7) (n=8).


Conclusões: Estes dados sugerem que a inibição da atividade Na+-ATPásica por Ang-(1-7)
ocorre via receptor AT2, com envolvimento de proteína G, guanilato ciclase, GMPc e PKG.


Apoio Financeiro: CNPq , PADCT , PRONEX , FINEP , FAPERJ , FAPESP , FUJB

Número Final: 20.002

Modulação da atividade Na+-ATPásica por bradicinina: papel da via
PLC/PKC/PLA2/COX Gomes-Quintana, E. ** ; Líbano-Soares, J. D. * ; Gracindo Roubach, R. * ;
Torres, R. A. G. ; Caruso-Neves, C. ; Lopes, A. G. ; Biofísica, UFRJ ; IBCCF, UFRJ ; Instituto
               *

Biofísica Carlos Chagas Filho - BL. C, UFRJ .
Objetivo: Dados obtidos em nosso laboratório indicam que a bradicinina (BK) em baixas
concentrações (10-9M) inibe a atividade Na+-ATPase de túbulo proximal de rim de porco
através da interação com receptores do tipo B 2 (Biochim. Biophys. Acta 1431:
483-491,1999). Este processo é mediado pela ativação da via de sinalização
PLA2/COX/PGE2. O presente estudo teve como objetivo estudar o curso temporal da
atividade da fosfolipase A2 (PLA2), bem como a sua interação com a fosfolipase C (PLC) e a
proteína cinase C (PKC), além de evidenciar o envolvimento da ciclooxigenase (COX) na
modulação da atividade da Na+-ATPase.


Métodos e Resultados: A atividade Na+-ATPásica foi medida segundo o método de
Grubmeyer e Penefsky (J. Biol. Chem. 256 :3718-3721,1981) e seu valor expresso em
nmoles Pi x mg-1 x min-1. A atividade PLA2 foi medida segundo método de Yang et al.
(Analytical Biochem., 269, p, 278-288, 1999). Foi observado que BK 10-9M aumenta tanto a
atividade da PKC como da PLA2 ao seu valor máximo aos 5 minutos de reação. No entanto,
a reversão do efeito de ativação foi alcançado aos 10 e 20 minutos para PKC e PLA2,
respectivamente. A confirmação que a ativação de PLC e PKC antecede a de PLA2 foi obtida
por experimentos utilizando U73122 50 nM e Calfostina C 10-9 M (inibidores de PLC e PKC).
Utilizando o inibidor da COX, indometacina 10-4 M, observou-se que o efeito inibitório do
ácido araquidônico 10-8 M sobre a Na+-ATPase foi revertido.


Conclusões: Os dados apresentados indicam que a interação da bradicinina com o receptor
B2 inibe a atividade Na+-ATPásica envolvendo a ativação da via PLC/PKC/PLA2/COX.


Apoio Financeiro: CNPq , FINEP , FAPERJ , FAPESP , FUJB , PADCT , PRONEX

Número Final: 20.003

Regulação da Na+-ATPase renal em ratos espontaneamente
hipertensos. Pacelle Queiroz Madeira, E. ** ; Melo, H. K. * ; Lara, L. S. ** ; Caruso-Neves, C. ;
Lopes, A. G. ; IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl. C - sala 34, UFRJ .
Objetivo: O rim é de fundamental importância na regulação da pressão arterial. A
reabsorção transcelular de Na+ no túbulo proximal ocorre através de dois transportadores
ativos primários: a clássica (Na++K+)-ATPase e a Na+-ATPase. Dados obtidos em nosso
laboratório sugerem que a (Na++K+)-ATPase seja responsável pelo transporte em massa do
Na+, enquanto a Na+-ATPase pelo ajuste fino desse processo. Este trabalho teve por
objetivo estudar a atividade Na+-ATPásica e a sua modulação por Ang II, hormônio
envolvido na gênese da hipertensão arterial.
Métodos e Resultados: Foram utilizadas preparações de membrana basolateral de rim de
ratos normotensos (Wistar-Kyoto) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR). A atividade
Na+-ATPásica foi medida pelo método de Grubmeyer e Penefsky (J. Biol. Chem.
256:3718-3721,1981). Foi observado que em ratos SHR adultos a atividade Na+-ATPásica é
94% maior em relação aos ratos WKY. Através dos parâmetros cinéticos da enzima,
verificamos que o Km é menor nos ratos SHR (12,6 ± 1,52 mM WKY; 0,40 ± 0,13 mM SHR)
e a Vmax é maior (27,6 ± 0,9 WKY; 35,4 ± 1,79 nmoles Pi x mg-1 x min-1 SHR). Nos ratos
SHR ocorre aumento progressivo das atividades Na +-ATPásica e (Na++K+)-ATPásica com a
idade, pari passu ao desenvolvimento da hipertensão. Este dado não foi verificado nos ratos
controle (WKY). Verificamos que nos ratos WKY a Ang II promove um aumento dose
dependente da atividade Na+-ATPásica, enquanto nos ratos SHR, provoca decréscimo desta
resposta.


Conclusões: Estes dados mostram que nos ratos SHR adultos a atividade Na +-ATPásica é
máxima em concentrações intracelulares de Na+, justificando o aumento de sua atividade
comparado aos ratos controle. Além disso, o efeito de Ang II sobre a Na +-ATPásica é
diferente nestes ratos sugerindo a ativação de diferentes vias de sinalização. Podemos
concluir que alterações na atividade Na+-ATPásica poderiam estar envolvidas no aumento da
pressão arterial nos ratos SHR.


Apoio Financeiro: PADCT , PRONEX , FINEP , CNPq , FAPERJ , FAPESP , FUJB , FAPESP

Número Final: 20.004

COLCHICINA INIBE AÇÃO DA AVP NO TRÁFEGO DE VESÍCULAS
ÁCIDAS SUBCELULARES, EM CÉLULAS MDCK. Morethson, P. * ; Oliveira-Souza, M.
; Malnic, G. ; Mello-Aires, M. ; Fisiologia - ICB, Instituto de Ciências Biomédicas ; Fisiologia e
Biofísica, Instituto de Ciências Biomédicas ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram efeito estimulatório da
AVP sobre a migração exocitótica de vesículas ácidas subcelulares carregadoras de
H+-ATPase. O objetivo do presente trabalho foi investigar o envolvimento do citoesqueleto
nesse efeito hormonal, em células MDCK (originárias de néfron distal de cão).
Métodos e Resultados: O movimento das vesículas ácidas foi monitorado por meio de
microscópio confocal (Zeiss LSM 510, objetiva 63X) durante o período de recuperação do pH
intracelular após pulso ácido por NH4Cl. Os experimentos foram realizados na vigência de
meio extracelular sem Na+ e com baixa concentração de K+, para inibição do trocador
Na+/H+ e da H+/K+ ATPase, respectivamente. Como marcador das vesículas ácidas foi usado
o acridine orange (5m, 30s) , substância difusível que se concentra em organelas
subcelulares ácidas e emite fluorescência após excitação a 490 nm. As células foram
pré-tratadas com colchicina (10M, 2h, 37°C), agente desorganizador dos microtúbulos,
sendo a AVP (10-12 ou 10-6M) aplicada após o pulso ácido. O movimento vesicular foi
monitorado em 10 células, durante 10 minutos, pelo deslocamento da densidade de
fluorescência da região basolateral para a apical. O processo foi quantificado pela inclinação
da reta traçada com as razões da densidade de fluorescência apical/basolateral (DFap/DFbl)
ao longo do tempo. Na situação controle, a razão DFap/DFbl foi de 0.081 ± 0.003/min; na
presença de AVP 10-12M foi de 0.333 ± 0.039/min e na presença de AVP 10 -6M foi de 0.589
± 0.008/min. A colchicina inibiu o efeito estimulatório de ambas as doses de AVP, de modo
que a razão DFap/DFbl na vigência do hormônio mais colchicina não foi significativamente
diferente do controle.
Conclusões: Nossos resultados sugerem a participação do citoesqueleto no efeito
estimulador da AVP sobre a migração exocitótica de vesículas ácidas carregadoras de
H+-ATPase.
Apoio Financeiro: PRÓ-REITORIA DE PESQUISA , FAPESP , CAPES , CNPq

Número Final: 20.005

AVP REGULA A VELOCIDADE DE RECUPERAÇÃO DO pHi EM CÉLULAS
EPITELIAIS DO CÓLON Aziz, R. M. ** ; Beloto-Silva, O. * ; Mello-Aires, M. ; Enfermagem,
Centro Universitário de Santo André ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: Verificar o efeito da Arginina Vasopressina (10-12 - 10-6 M; AVP) sobre a
velocidade de recuperação do pH intracelular (pHi) em células epiteliais colônicas (T84) e os
receptores envolvidos com o processo.
Métodos e Resultados: As medidas de pHi são feitas por microscopia de fluorescência,
através da sonda intracellular, BCECF-AM, em monocamadas de células, sobre lamínulas de
vidro. Para analisar a recuperação do pHi, avaliamos a velocidade de extrusão celular de H +
nos dois primeiros minutos (dpHi/dt), após pulso ácido por NH 4Cl, na vigência de solução
externa controle ou experimental. Encontramos que as células T84 apresentam pHi basal
inicial de 7.19±0.005 (n=30) e dpHi/dt controle de 0.125±0.005 (n=30) pH/min. A dpHi/dt
é significantemente aumentada na presença de AVP (10 -12 - 10-9 M) e diminuída na
presença de AVP (10-8 - 10-6 M). A adição do antagonista do receptor V 1 (10-5 M) bloqueia o
efeito estimulador da AVP (10-10 M) e reduz o efeito inibidor da AVP (10 -6 M). Por outro lado,
o antagonista do receptor V2 (10-5 M) não altera a estimulação dada por AVP (10-10 M) mas
reduz o efeito inibidor da AVP (10-6 M). Para confirmar a hipótese de que a estimulação dos
receptors V2 tem efeito inibidor dose-dependente mediado por AMPc, estudamos o efeito da
dDAVP (análogo da AVP que, especificamente, se liga em receptors V 2). A dpHi/dt não é
alterada na presença de dDAVP (10-12 ou 10-10 M), mas é reduzida na presença de dDAVP
(10-8 ou 10-6 M). Para demonstrar o envolvimento do AMPc no efeito da AVP, utilizamos o
8-Br-AMPc (10-5 M; análogo permeante do AMPc), provocando um aumento do AMPc
intracellular e, mimetizando um efeito semelhante ao que ocorre via estimulação V 2.
Verificamos que o 8-Br-AMPc reduz o efeito estimulador da AVP (10-10 M).


Conclusões: Nossos dados sugerem que a AVP atua, dose-dependentemente, na
estimulação ou redução da velocidade de recuperação do pHi nas células T84, via ativação
dos receptors V1, sendo que os receptores V2 tem efeito inibidor, dose-dependente, mediado
por AMPc.


Apoio Financeiro: FAPESP , CNPq , CAPES

Número Final: 20.006

VIAS DE SINALIZAÇÃO ENVOLVIDAS NA AÇÃO DA AVP SOBRE O
TROCADOR Na+/H+ EM CÉLULAS EPITELIAIS COLÔNICAS Aziz, R. M. ** ;
                    ; Mello-Aires, M. ; Enfermagem, Centro Universitário de Santo André ;
                *
Beloto-Silva, O.
Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: O presente estudo verifica as vias de sinalização intracelular envolvidas no efeito
da Arginina Vasopressina (AVP) sobre a velocidade de recuperação do pH intracelular,
mediada pelo trocador Na+/H+, em células epiteliais colônicas (T84).
Métodos e Resultados: As medidas de pH intracellular (pHi) e cálcio citosólico ([Ca 2+]i)
são feitas por microscopia de fluorescência, através das sondas intracelulares, BCECF-AM e
Fluo 4-AM, respectivamente, em monocamadas de células, sobre lamínulas de vidro. Para
analisar a recuperação do pHi, avaliamos a velocidade de extrusão celular de H + nos dois
primeiros minutos (dpHi/dt) após pulso ácido por NH 4Cl, na vigência de solução externa
controle ou experimental. Nossos experimentos revelam que as células T84 apresentam pHi
basal inicial de 7.18±0.001 (n=52) e dpHi/dt controle de 0.12±0.001 (n=52). A velocidade
de recuperação do pHi aumenta na presença de AVP (10 -12 - 10-9 M) e diminui com AVP
(10-8 - 10-6 M). A adição de Staurosporine (10-5 M; inibidor da PKC) reduz o efeito
estimulador da AVP (10-10 M) e não altera o efeito inibidor da AVP (10 -6 M). W13 (10-5 M;
inibidor do complexo Ca2+-calmodulina quinase) reduz o efeito estimulador da AVP (10 -10 M)
e reverte o efeito inibidor da AVP (10-6 M). H89 (10-4 M; inibidor da PKA) não altera o efeito
estimulador da AVP (10 -10 M) mas reduz o efeito inibidor da AVP (10 -6 M). A AVP (10-12 –
10-6 M) eleva a [Ca2+]i em relação ao grupo controle [97±1 (n=32)], sendo este efeito
dose-dependente. A adição de Staurosporine, W13 ou H89 não altera o efeito estimulador
da AVP sobre a [Ca2+]i.


Conclusões: Nossos resultados indicam que nas células epiteliais colônicas, PKC, cálcio
citosólico (via complexo Ca2+-calmodulina quinase) e PKA são fatores moduladores do efeito
bifásico da AVP sobre a atividade do trocador Na+/H+.
Apoio Financeiro: FAPESP , CNPq , CAPES

Número Final: 20.007

ANP e URODILATINA INIBEM, VIA GMPc/PKG, A ATIVIDADE
Na+-ATPásica PRESENTE EM MEMBRANA BASOLATERAL DE RIM DE
PORCO. Vives, D. * ; Lopes, A. G. ; Caruso-Neves, C. ; Fisiologia Renal - IBCCF, UFRJ ; IBCCF,
UFRJ .
Objetivo: , O peptídeo atrial natriurético (ANP) e a urodilatina (URO) são hormônios
envolvidos na regulação da excreção renal de sódio. Recentemente foi observado em nosso
laboratório que estes hormônios inibem a atividade da Na +-ATPase insensível à ouabaína e
não modulam a atividade (Na++K+)ATPase em preparação de membrana basolateral de rim
de porco [Caruso-Neves et al. (Biochim Biophys Acta. 1660:93-8, 2004)]. O presente
trabalho teve por objetivo estudar os mecanismos moleculares envolvidos na inibição da
atividade Na+-ATPásica em membrana basolateral de rim de porco por ANP e URO.
Métodos e Resultados: , A atividade ATPásica foi medida pelo método descrito por
Grubmeyer e Penefsky (J. Biol. Chem. 256: 3718-3727, 1981). Foi observado que o efeito
inibitório do ANP e URO (ambas 10-11M) sobre a atividade Na+-ATPásica é revertido por:1)
LY83583 (inibidor de guanilato ciclase), sendo a reversão máxima obtida na concentração
de 10-6M; 2) KT5823 (inibidor de PKG) na concentração de 10 -10M. A adição de ANP 10-11M
ou URO 10-11M aumenta a atividade de PKG de 0,87±0,12 para 3,73±0,73 ou 1,97±0,44
pmol Pi-histona x mg-1 x min-1, respectivamente. Isto corresponde a um aumento de 429%
para ANP e 226% para URO. Este efeito foi mimetizado por GMPc 10 -10M e revertido por
LY83583 10-6M.
Conclusões: , Estes dados indicam que ANP e URO inibem a Na+-ATPase através da
ativação do sistema GMPc/PKG. Estes efeitos são compatíveis com a ação de ANP e URO
sobre a excreção renal de sódio, indicando que a Na +-ATPase é um alvo de ação destes
peptídeos.
Apoio Financeiro: CNPq , PADCT , FAPESP , FAPERJ , FUJB , FINEP

Número Final: 20.008

A INIBIÇÃO DO EFEITO ESTIMULATÓRIO DA ANGIOTENSINA II (ANG
II) SOBRE A ATIVIDADE Na+-ATPásica DE TÚBULO PROXIMAL
PROMOVIDA POR ADENOSINA ( Ado) ENVOLVE A VIA ( Ptn Gs/
AMPc/ PKA). Perez Gomes, C. ** ; Caruso-Neves, C. ; Santos, G. P. do N. * ; Leão Ferreira, L. R. ;
Lopes, A. G. ; Biologia Celular e Molecular, UFF ; IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl. C - sala 34, UFRJ ;
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ .
Objetivo: Os sistemas renina-angiotensina e purinérgico são importantes moduladores da
Na+-ATPase presente na membrana basolateral de túbulo proximal (TP), regulando a
excreção renal de sódio e homeostase do volume extracelular. Nossos dados preliminares
demonstraram que a Ado (via receptor A2) reduz o efeito estimulatório da Ang II sobre a
atividade Na+-ATPásica de forma dose-dependente. Este trabalho teve como objetivo
identificar a via de sinalização intracelular envolvida nesta modulação.


Métodos e Resultados: Os ensaios de medida da atividade Na+-ATPásica foram realizados
em membranas basolaterais de TP de rim de porco pré-incubadas com Ang II 10-8M por 30
minutos, segundo o método descrito por Grubmeyer e Penefsky (J. Biol. Chem.
256:3718-3727, 1981). Nesta condição, a atividade Na +-ATPásica aumentou 126% (de
7,6±1,6 para 17,2±2,9 nmoles Pi x min-1 x mg-1). Por outro lado, a adição de Ado 10-6M e
DPCPX 10-6M (antagonista de receptor A1) ao meio de ensaio reverteu completamente o
efeito estimulatório da Ang II. Sendo assim, todos os experimentos seguintes foram
realizados na presença de DPCPX. A adição de iPKA 10-8M (peptídeo inibidor de PKA) ou
GDPßs 10-8M (inibidor ptn G) ao meio de ensaio bloqueou o efeito inibitório da Ado,
enquanto GTPУs 10-8 M, CTX (toxina da cólera) 10-8M, Forskolin 10-6M (estimulador da
adenilato ciclase) e AMPc 10-7M mimetizaram, isoladamente e de modo não aditivo, o efeito
da Ado.


Conclusões: Estes dados demonstram que a redução do efeito estimulatório de AII sobre a
atividade Na+-ATPásica por Ado (via receptor do tipo A2) envolve a via (ptn Gs / AMPc /
PKA). Este resultados sugerem um papel para o receptor A 2 como possível alvo
farmacológico na modulação dos efeitos da Ang II sobre a reabsorção renal de sódio.


Apoio Financeiro: FAPERJ , FAPESP , FINEP , FUJB , CNPq , PADCT , PRONEX

Número Final: 20.009

MODULATION OF VALINOMYCIN CONDUCTANCE BY PALMITIC ACID IN PLANAR
LIPID BILAYERS EVIDENCES FATTY ACID FLIP-FLOP

Abdulkader, F. ; Brunaldi, K. ; Miranda, M. A. ; Curi, R. ; Procopio, J. ; Biofísica e Fisiologia -
               **             **                *

ICB1, USP ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo:

The aim of the present work is to evaluate the steady-state and temporal evolution of fatty
acid distribution in neutral lipid bilayer membranes (DPhPC) by monitoring the
valinomycin-induced membrane conductance in the presence of potassium. Fatty acids are
added to the aqueous medium whence they partition into the membrane phase.


Métodos e Resultados:

Addition of palmitic acid (PA) to the medium increases the membrane conductance to the
valinomycin-potassium complex indicating the generation of a negative surface potential
(SP) most probably due to the insertion into the membrane of negatively charged residues.
Upon insertion of palmitic acid (PA) into the membrane, a negative SP is generated by the
palmitate anions adsorbed, which increases potassium conductance by locally rising
potassium concentration. Addition of PA to one of the membrane bathing solution (CIS)
rises membrane conductance about 5 times, which amounts to a SP of – 39.1 ± 11.4 mV
and a surface charge density of 6.2 ± 2.8 mC/m2 (n = 8). Acidification of the opposite
bathing solution (TRANS) markedly rectifies the current-voltage characteristics, although
the reversal potential remains approximately 0 mV. Such findings are compatible with the
protonation of fatty acid residues in TRANS, generating a SP asymmetry across the
membrane, which causes the potassium conductance rectification in the absence of
potassium electrochemical gradients.


Conclusões:

PA adsorbs to neutral membranes, generating negative surface charges, and rapidly
equilibrates between the two leaflets. This effect may have a role in the modulation of
membrane potentials of living cells.


Apoio Financeiro: FAPESP

Número Final: 20.010

EFECTO DE TRIÓXIDO DE ARSÉNICO SOBRE LA ACTIVIDAD DEL
INTERCAMBIADOR Na+ / H- EN CÉLULAS EPITELIALES. Ramirez, M. A. ** ;
Beltran, G. A. R. ; Malnic, G. ; Biomedicina, Universidad de Antofagasta ; Fisiologia e Biofísica
                **

ICB1, USP .
Objetivo: Se sabe que arsénico produce cáncer colónico, y que células normales
transformadas en malignas experimentan una elevada actividad del intercambiador Na +/H+
con la consecuente alcalinización intracelular. En este trabajo pretendemos probar si
trióxido de arsénico altera el pH celular debido a una hiperactividad del intercambiador
Na+/H+.


Métodos e Resultados: Células colónicas humanas (T84) y de riñón (MDCK) fueron
incubadas durante 48 hrs en medio de cultivo suplementado con trióxido de arsénico (0.33
– 0.5 mM). Durante el experimento las soluciones utilizadas estaban ausentes de
CO2/HCO3-, las que fueron tamponadas con HEPES, ajustadas a pH 7.4. La medición de las
variaciones del pH celular fueron relizadas utilizando el fluoróforo sensible a pH BCECF-AM,
a 37°C.

Tanto las células T84 como MDCK presentan un pH intracelular (pHi) basal de 7.17. Después
de 48 hrs de incubación con trióxido de arsénico (0,33-05 mM), en ambas líneas celulares
se observó un aumento en el pHi a un valor aproximado de 7.26. En condiciones control, y
después del pulso ácido con NH4Cl, la velocidad de recuperación fue 0.13±0.014 (n=9) en
células T84 y 0.27±0.045 (n=4) en células MDCK. Después de 48 hrs de incubación con
trióxido de arsénico, la velocidad de recuperación, post-carga ácida, fue de 0.204±0.014
unidades de pH/min en células T84, es decir, un aumento del 56% en relación a su valor
control, y de 0.35±0.04 unidades de pH/min en células MDCK. Es probable que la vía p 42/p44
MAPK (ERK 1/2) sea, en parte, la responsable de este aumento en la actividad del
intercambiador Na+/H+ bajo el efecto de arsénico.


Conclusões: Trióxido de arsénico altera el pH basal en dirección hacia una alcalinización
intracelular. En ambas líneas celulares, se observa un aumento en la velocidad de
recuperación del pH celular debido a una hiperactividad del intercambiador Na +/H+,
posiblemente modulado por la vía p42/p44 MAPK.


Apoio Financeiro: Universidad de Antofagasta

Número Final: 20.011

EFEITOS DA TOXINA TERMOESTÁVEL DE E. COLI, STA, SOBRE A
FUNÇÃO DO PERMUTADOR Na / H INSENSÍVEL A HOE E S3226, EM
CÉLULAS T84. Beltran, G. A. R. ** ; Nogueira, C. ; Beloto-Silva, O. * ; Malnic, G. ; Enfermagem,
Centro Universitário de Santo André ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: Investigamos os efeitos de Sta sobre a velocidade de recuperação do pHi
(dpH/dt) mediada por uma isoforma do permutador Na/H(NHE-X) insensível a HOE(25uM) e
S3226(0,1uM)
Métodos e Resultados: As medidas do pHi foram realizadas por microscopia de
fluorescencia, através de sonda intracellular fluorescente, BCECF-AM. As medidas dos níveis
intracelulares de AMPc, foram realizadas através de imunoensaio sendo a concentração de
AMPc padronizada por mg de proteína (método de Lowry). A dpH/dt após pulso de NH4Cl foi
de 0,134±0,0051 (n=33). HOE-694 (1uM-inibidor de NHE-1) reduz a dpH/dt em 45%
(dpH/dt=0,074±0,089; n=12). HOE-694(25uM, inibidor de NHE-1-2) reduz a dpH/dt em
18% (dpH/dt=0,050±0,0049; n=24). A velocidade do pHi remanescente (NHE-X=43%) não
diferiu da observada na condição controle quando foi utilizado S3226(0,1uM-inibidor
NHE-3), mas foi completamente abolida na presença de 25uM de EIPA(0,0039±0,0012,
n=7). Células preincubadas com Sta(0,25uM-30 minutos) mostraram uma redução da
dpH/dt de NHE-X em 73%(0,014±0,00015; n=8) quando comparado com seu controle(HOE
25uM =0,051±0,010; n=8). Este efeito inibitório promovido por Sta sobre dpH/dt foi
revertido com H89(0,1mM-inibidor da proteína quinase A-PKA). Por outro lado
forskolina(10uM-ativador de Adenilato ciclase), mimetizou o efeito de Sta sobre a
dpH/dt(0,017±0,0031; n=8). Os estudos de imunoensaio indicaram que o tratamento com
Sta(0,25uM), aumentou os níveis intracelulares de AMPc quando comparados a solução
controle(Sta=152,3±15,6; n=10 v/s C=31,0±5,0; n=5, pmol AMPc/ug proteína/poço).
Conclusões: Células T84 apresentam as isoformas NHE-1-2 do permutador Na/H. Apos
inibição destas por HOE-694(25uM), observou-se uma velocidade de recuperação
remanescente de 43%, a qual foi abolida com a utilização de EIPA(25uM). Também
mostramos que a dpH/dt de NHE-X foi reduzida por Sta através de aumentos dos níveis de
AMPc, via PKA.
Apoio Financeiro: FAPESP , CNPq , CAPES

Número Final: 20.012

TRANSPORTADORES MEMBRANAIS ENVOLVIDOS NA REGULAÇÃO DA
EXTRUSÃO CELULAR DE H+ NO SEGMENTO S3 DO TÚBULO RENAL
PROXIMAL DE RATOS Dellova, D. C. A. L. ** ; Malnic, G. ; Mello-Aires, M. ; Fisiologia e
Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: O presente trabalho teve como objetivo estabelecer quais os transportadores
membranais responsáveis pela regulação do pH intracelular (pHi) do segmento S3.
Métodos e Resultados: Com auxílio de microscópio estereoscópico, o segmento S3 de
ratos Wistar, machos, com cerca de 90 g, foi microdissecado a partir da papila renal. O pHi
foi avaliado por sonda intracelular fluorescente sensível a H+ (BCECF/AM), utilizando
microscópio de fluorescência invertido, acoplado a sistema de aquisição de dados por
câmara de vídeo. Em cada segmento estudado, inicialmente foi medido o pHi basal; depois
foi avaliada seqüencialmente a velocidade de recuperaçãodo pHi, após pulso intracelular
ácido por NH4Cl na vigência de solução externa controle (Na+=140 mM) ou na vigência de
solução externa isenta de Na+. Nossos dados indicam que o pHi basal do segmento S3 é
7.06±0.019 (n=54). Após o primeiro pulso intracelular ácido, o pHi caiu para 6.37±0.08,
sendo a velocidade de recuperação do pHi ao valor basal, na presença de Na+ extracelular,
de 0.158±0.08 pHi/min. Depois do segundo pulso intracelular ácido, o pHi caiu para
6.31±0.16, e a velocidade de recuperação do pHi na ausência de Na+ extracelular foi
0.094±0.01 pHi/min (nessa situação o pHi se estabilizou em 6.80, não retornando ao valor
basal inicial).
Conclusões: Nossos resultados indicam que a regulação do pHi no segmento S3 é feita em
parte pelo trocador Na+/H+, pois na ausência de Na+ extracelular a velocidade de
recuperação do pHi foi menor. Nossos dados também sugerem a existência de outro (s)
mecanismo (s) de extrusão celular de H+, tipo H+-ATPase ou H+/K+-ATPase, uma vez que
na ausência de Na+ ocorreu uma certa recuperação do pHi. Achamos porém mais provável
que ocorra apenas a H+-ATPase, pois a H+/K+-ATPase é pouco expressa no túbulo
proximal de animais em estado normal do equilíbrio ácido-base.
Apoio Financeiro: FAPESP , CNPq

Número Final: 20.013

MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DA NA+-ATPASE RENAL POR
ADENOSINA VIA RECEPTOR A2A Wengert, M. ** ; Kaufman, J. * ; Leão-Ferreira, L. R. ;
Lopes, A. G. ; Caruso-Neves, C. ; Biologia Celular e Molecular, UFF ; IBCCF, UFRJ .
Objetivo: Resultados anteriores do laboratório demonstraram que adenosina promove
efeito bifásico sobre a atividade Na+-ATPásica: baixas concentrações (10-12-10-8M) inibem
a enzima, enquanto altas concentrações (10-7-10-5M) podem reverter o efeito inibitório ou
estimular a enzima, quando o receptor A1 é bloqueado com o antagonista seletivo DPCPX.
Os efeitos inibitório e estimulatório são mediados pelos receptores A1 e A2,
respectivamente. O efeito estimulatório envolve proteína Gs e tem PKA como efetor da
modulação da atividade da enzima. O objetivo deste trabalho foi identificar o subtipo de
receptor A2 envolvido no estímulo da atividade Na+-ATPásica por adenosina.
Métodos e Resultados: A expressão dos subtipos A2a e A2b foi avaliada por
imunodetecção utilizando anticorpos específicos, através de western blot. Nossos resultados
demonstram a presença de ambos os tipos de receptores em membrana basolateral isolada
e seus pesos moleculares são similares, entre 35 - 50KDa. A caracterização farmacológica
do receptor envolvido foi realizada através de ensaios da atividade Na+-ATPásica conforme
descrito por Grubmeyer e Penefsky (J. Biol. Chem. 256: 3718-3727, 1981). Todos os
ensaios foram realizados na presença de DPCPX 10-6M, para prevenir o efeito inibitório da
adenosina via receptor A1. A incubação da membrana basolateral com adenosina 10-6M
promove um aumento de 92% na atividade Na+-ATPásica (de 11,2 para 21,5 nmoles Pi x
min-1 x mg-1). Este efeito é mimetizado por SCH 10-7M, um agonista seletivo para
receptor A2a, e não aditivo ao estímulo promovido por adenosina. Por outro lado, a
incubação com DPMA 10-7M, um antagonista específico de receptor A2a reverte o efeito da
adenosina.
Conclusões: Esses dados indicam que adenosina estimula a atividade Na+-ATPásica via
receptor do tipo A2a acoplado a uma proteína Gs.
Apoio Financeiro: CNPq , FAPERJ , FAPESP , FINEP , FUJB , PADCT , PRONEX

Número Final: 20.014

CARACTERIZAÇÃO DO MECANISMO MOLECULAR ENVOLVIDO NO
EFEITO DE ADENINA E GUANINA SOBRE A Na+-ATPase DE TÚBULO
PROXIMAL.
             *              **                   *                    *
Novaes, J. A. ; Wengert, M. ; Assaife-Lopes, N. ; Freitas-Oliveira, C. ; Leão-Ferreira, L. R. ; Lopes,
A. G. ; Caruso-Neves, C. ; Biologia Celular e Molecular, UFF ; IBCCF, UFRJ .
Objetivo: Resultados do laboratório demonstraram que o nucleosídeo purínico adenosina
(Ado) pode inibir de modo dose-dependente (1012M a 10-8M) a atividade Na+-ATPásica em
membrana basolateral isolada de túbulo proximal de rim de porco, sendo este efeito
mediado pelo receptor A1. Por outro lado, observamos também que bases nitrogenadas
purínicas, tais como guanina e adenina, sendo esta última um derivado metabólico da
adenosina, podem inibir de modo dose-dependente (10-10M a 10-5M) a atividade
Na+-ATPásica, promovendo efeito máximo similar aquele observado para Ado. Este trabalho
teve como objetivo investigar o mecanismo molecular envolvido nos efeitos inibitórios de
adenina e de guanina sobre a atividade Na+-ATPase.


Métodos e Resultados: A incubação de membrana basolateral com adenina 10-5M ou
guanina 10-5M reduziu a atividade Na+-ATPásica de 13,21±2,21 para 4,29±1,03 (68%) ou
4,68 ± 1,18 (65%) nmolPi.mg-1.min-1, respectivamente. A medida da atividade ATPásica
foi determinada pelo método descrito por Grubmeyer e Penefsky (1981). As inibições
promovidas pelas bases purínicas em conjunto com Ado não são somatórias e podem ser
revertidas pelo antagonista de receptor A1, DPCPX, de forma dose-dependente, com efeito
máximo na concentração de 10-7M. A fim de verificar o possível envolvimento de um
receptor acoplado a proteína G, o ensaio foi realizado na presença de um inibidor de
Proteína G, GDP(beta)S (10-6M e 10-9M). A inibição da Na+-ATPase por adenina ou guanina
foi revertida pelo inibidor em ambas as concentrações.


Conclusões: Os resultados acima indicam que as bases purínicas, adenina e guanina,
exercem efeito modulatório sobre a atividade Na+-ATPásica via um receptor acoplado a
proteína G e sensível a DPCPX, de modo semelhante a Ado.


Apoio Financeiro: PADCT , PRONEX , FINEP , FAPERJ , FAPESP , FUJB , CNPq

Número Final: 20.015

A MUTATIONAL STUDY IN THE TRANSMEMBRANE DOMAIN OF CCC2P,
THE YEAST CU(I)-ATPASE: DIFFERENT ROLES FOR EACH CPC
CYSTEINE Lowe, J. ; Vieyra, A. R. ; Catty, P. ; Guillain, F. ; Mintz, E. ; Cuillel, M. ; SEFIRM, 0 ;
DBMS - BMC, CEA/Grenoble - França ; Biofísica CCS , UFRJ ; IBCCF - BL. G, UFRJ .
Objetivo: Ccc2p is homologous to the human Menkes and Wilson copper ATPases and is
herein studied as a model for human copper transport. Most studies to date have sought to
understand how mutations in the human Menkes or Wilson genes impair copper
homeostasis and induce disease. Here, we analyse whether eight conserved amino acids of
the transmembrane domain are important for copper transport.
Métodos e Resultados: Wild-type Ccc2p and variants were expressed in a delta-CCC2
yeast strain to check whether they were able to restore copper transport by
complementation assays. Wild-type Ccc2p and variants were also expressed in Sf9 cells
using baculovirus to study their enzymatic properties on membrane preparations. The latter
system allowed us to measure a copper-activated ATPase activity of about 20 nmol/mg/min
for the wild-type Ccc2p at 37° C. None of the variants was as efficient as the wild type in
restoring copper homeostasis. The mutation of each cysteine of the 583CPC585 motif into a
serine resulted in non functional proteins which could not restore copper homeostasis in
yeast and had no ATPase activity. Phosphorylation by ATP was still possible with the C583S
variant, although it was not possible with the C585S variant, suggesting that the cysteines
of the CPC motif have a different role in copper transport.
Conclusões: The cysteine 583 would be necessary for copper dissociation and/or enzyme
dephosphorylation and C585 would be necessary for ATP phosphorylation, suggesting a role
in copper binding.
Apoio Financeiro: CAPES , COFECUB , Région Rhône-Alpes (Emergence 2001) , Programme
de Toxicologie Nucléaire du CEA

Número Final: 20.016
EFEITO DA NISTATINA E DO METIL-B-CICLODEXTRINA NA
PERMEABILIZAÇÃO INDUZIDA POR ATP EXTRACELULAR EM
MACRÓFAGOS Sarmento Vieira, F. * ; Marques, C. S. * ; Bolzan, M. F. * ; Persechini, P. M. ;
Coutinho-Silva, R. ; Biofísica CCS , UFRJ ; IBCCF, UFRJ ; Imunobiofísica - IBCCF, UFRJ ;
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ .
Objetivo: Os “lipid rafts” de membrana são microdomínios dinâmicos agregados de
colesterol, proteínas e esfingolipídios. Recentemente foi demonstrado que alguns
receptores, tais como TLR 4 e CD14, encontram-se associados aos “lipid rafts” em resposta
a estimulação com LPS, sendo portanto, estes domínios de extrema relevância em
fenômenos de sinalização e ativação celular. Sabe-se que drogas como a nistatina e a
metil-b-ciclodextrina (MCD) são capazes de romper a integridade dos “lipid rafts”, podendo
modular respostas celulares. Os receptores purinérgicos P2 induzem modulação da resposta
imune e participam de processos de sinalização e ativação celular sendo potencializados por
LPS.Investigar a presença de receptores purinérgicos (P2X7) nos “lipid rafts” a partir da
verificação da possível modulação da permeabilização da membrana induzida por ATP, por
nistatina ou por MCD.
Métodos e Resultados: Utilizou-se macrófagos peritoneais residentes de camundongo
(Suíço; machos) e linhagem de macrófagos (J774/G8). As células foram tratadas por 10
min com nistatina 10 e 50µg/ml ou MCD 10mM a 37ºC. Posterior ao tratamento foi feito um
ensaio de permeabilização, no qual as células foram incubadas ou não com ATP 5mM, na
presença de um corante fluorescente Brometo de Etídeo (BE), a 37ºC por 10 min. Para
medir a taxa de permeabilização celular utilizou-se microscopia óptica de fluorescência para
análise dos macrófagos peritoneais (contagem de aproximadamente 1000 células por
experimento), e citometria de fluxo, células J774, utilizando BE 10µg/ml e 2.5µg/ml
respectivamente. Os gráficos foram gerados e os dados analisados utilizando os programas
GraphPad Prism 3.0 e Winmdi. : Observou-se que o pré-tratamento com nistatina levou a
uma inibição de 59 ± 7% (n = 5) na permeabilização induzida por ATP em macrófagos
peritoneais. Já em macrófagos J774 a inibição foi de 39 ± 5 % (n = 8). O pré-tratamento
com MCD inibiu a permeabilização em 45 ± 2% (n = 3). Observou-se também a diminuição
em torno de 5 vezes na intensidade de fluorescência nas células positivas.
Conclusões: A nistatina e o MCD, possivelmente, ao romper a integridade dos “lipid rafts”,
modulam a resposta de macrófagos peritoneais e de linhagem à ATP extracelular. Isso
sugere que o receptor P2X7, responsável pela permeabilização da membrana plasmática,
está associado aos "lipid rafts".
Apoio Financeiro: CNPq , FAPERJ

Número Final: 20.017

ÁCIDO LISOFOSFATÍDICO E ÁCIDO ARAQUIDÔNICO MODULAM A
ATIVIDADE DA CA2++MG2+-ATPASE DE MEMBRANA BASOLATERAL
DE TÚBULOS PROXIMAIS RENAIS: PAPEL FISIOLÓGICO DA PLA2 E
DOS RECEPTORES EDG2 Valverde, R. R. H. F. ** ; Tortelote, G. G. * ; Lemos, T. * ; Volpe, I. * ;
Einicker-Lamas, M. ; Vieyra, A. R. ; Biofísica CCS , UFRJ ; IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl - G, UFRJ .
Objetivo: A Ca2++Mg2+-ATPase de membrana plasmática pode ser modulada por
diferentes proteínas kinases e lipídeos sinalizadores. Resultados anteriores de nosso
laboratório demonstraram que na membrana basolateral de túbulos proximais renais (MBL)
existe uma diacilglicerol kinase capaz de gerar ácido fosfatídico (PA), que pode ser substrato
de fosfolipase A2 (PLA2) dando origem a dois importantes lipídeos sinalizadores: o ácido
liso-fosfatídico (LPA) e o ácido araquidônico (AA), que podem agir tanto pela ativação de
receptores específicos (EDG2) quanto de forma direta sobre a Ca2++Mg2+-ATPase. Este
trabalho tem por objetivo mostrar através de Western blotting a presença tanto de PLA2
quanto de receptores EDG2 na MBL, e estudar os efeitos de LPA e AA sobre a atividade da
Ca2++Mg2+-ATPase.
Métodos e Resultados: O trabalho foi realizado utilizando-se frações purificadas MBL de
túbulos proximais de rim de porco. Mostramos através de Western blotting, utilizando-se
anticorpos policlonais contra PLA2 e EDG2, que ambos encontram-se associados à MBL.
Foram utilizadas concentrações crescentes de LPA e AA (10 nM; 50 nM; 500 nM e 1 µM) e a
atividade da Ca2++Mg2+-ATPase foi avaliada. Enquanto o LPA apresenta um efeito
estimulatório na atividade ( 40%), sendo a concentração de 50 nM aquela onde se obtem
a maior ativação; o AA numa concentração de 500 nM apresenta uma ativação significativa
( 40%) (atividade controle = 20,7 1,9 nmol Pi x mg-1 x min-1 (n=5)).
Conclusões: Estes resultados mostram que a PLA2 pode ter um papel importante na
regulação da concentração intracelular de Ca2+ nas células renais uma vez que o LPA e o
AA, produtos de sua atividade, apresentam efeito modulatório sobre a Ca2++Mg2+-ATPase.
A presença de receptores para LPA (EDG2) e da própria PLA2 em frações purificadas de MBL
indica que pode existir uma via local de produção de lipídeos sinalizadores acoplada à
receptores específicos na própria MBL.
Apoio Financeiro: CNPq , PROFIX , PRONEX , CAPES , FAPERJ , FUND.JOSÉ BONIFÁCIO

Número Final: 20.018

EFEITO DO ÁCIDO CAPRÍLICO NO TRANSPORTE DE H+ EM
BICAMADAS LIPÍDICAS PLANAS. Miranda Filho, M. de A. ** ; Brunaldi, K. ** ; Abdulkader,
      ; Curi, R. ; Procopio, J. ; Fisiologia e Biofísica ICB1, Instituto de Biociências da USP ;
  **
F.
Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biomédicas ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: Caracterizar através de parâmetros elétricos a permeação de H + induzida pelo
ácido caprílico (AC) em Bicamadas Lipídicas Planas (BLP).


Métodos e Resultados: BLP foram formadas a partir de DPhPC pura (dissolvidos em
n-decano). BLPs eram formadas sobre um orifício em um frasco de polipropileno, definindo
dois compartimentos: CIS e TRANS, com igual composição (KCl 5mM + Trizma 5mM +
KH2PO4 + 5 mM, pH=7.4). Gradientes de H+ foram obtidos com a adição de H2SO4 ao
compartimento CIS. AC era adicionado em ambos compartimentos (4mL, solução etanólica).
As medidas elétricas [voltagem espontânea (V m), condutância (G) e corrente de
curto-circuito (CCC)] foram obtidas através de um eletrômetro digital. A permeabilidade a
prótons (PH+) foi calculada pela seguinte relação: PH+= CCC/(F x D[H+]), onde F=constante
de Faraday e D[H+]=diferença de concentração de prótons. O nT foi calculada através da
seguinte relação: nT=Vm/EH+, onde EH+=potencial de equilíbrio do H+. Os resultados obtidos
experimentalmente foram analisados por um programa computacional que calculava as
condutâncias da via de H+ (GH+) e da via de vazamento inespecífica (Gleak) (a partir da CCC
e do Vm) e, estatisticamente, pelo programa Prism 3.0. Nossos resultados indicam que a
adição do AC - ((n=6), nT=0,18±0,18, GH+=1,61±1,36, Gleak=8,49±5,25, PH+=2,34 x
10-6±2,78 x 10-6) a membranas de DPhPC pura (nT=0,19±0,13, GH+=2,33±1,13,
Gleak=10,92±6,29, PH+=3,51 x 10-6±3,34 x 10-6) não altera a nT, as GH+ e Gleak, a CCC e a
PH+.


Conclusões: (1) as membranas de DPhPC pura são parcialmente seletivas ao H +; (2) o AC
não altera a seletividade a H+ de membranas de DPhPC pura. Provavelmente em razão de
sua curta cadeia acila (8:0), o AC seria incapaz de realizar flip-flop através dos hemifolhetos
opostos da membrana e, portanto não atuaria como transportador de H +.
Apoio Financeiro: CAPES

Número Final: 20.019

EFEITO DA CARDIOLIPINA NO TRANSPORTE DE H+ PELO ÁCIDO
PALMÍTICO EM BICAMADAS LIPÍDICAS PLANAS Miranda Filho, M. de A. ** ;
Brunaldi, K. ; Abdulkader, F. ; Curi, R. ; Procopio, J. ; Fisiologia e Biofísica ICB1, Instituto de
            **

Biociências da USP ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: Analisar os efeitos da cardiolipina no transporte de H+ induzido pelo ácido
palmítico (AP) em Bicamadas Lipídicas Planas (BLP).
Métodos e Resultados: BLP foram formadas a partir de DPhPC pura ou DPhPC com
cardiolipina (21%) (dissolvidos em n-decano). BLPs eram formadas sobre um orifício em um
frasco de polipropileno, definindo dois compartimentos: CIS e TRANS, com igual composição
(KCl 5mM + Trizma 5mM + KH2PO4 + 5 mM, pH=7.4). Gradientes de H+ foram obtidos
com a adição de H2SO4 ao compartimento CIS. AP era adicionado em ambos
compartimentos (4mL, solução etanólica). As medidas elétricas [voltagem espontânea
(Vm), condutância (G) e corrente de curto-circuito (CCC)] foram obtidas através de um
eletrômetro digital. O número de transferência de H+ (nT) foi calculado a partir da seguinte
relação: nT=Vm/EH+, onde EH+=potencial de equilíbrio do H+. Os resultados obtidos
experimentalmente foram analisados por um programa computacional que calculava as
condutâncias da via de prótons (GH+) e da via de vazamento inespecífica (Gleak) (a partir
da CCC e da Vm) e, estatisticamente, pelo programa Prism 3.0. Nossos resultados indicam
que membranas de DPhPC com cardiolipina (nT=0,19±0,1, GH+ =0,83±0,72, n=6 e
Gleak=2,98±1,85, n=6) apresentam a mesma seletividade a H+ do que membranas de
DPhPC pura (nT=0,18±0,16, GH+=3,74±4,50, n=6 e Gleak=24,45±28,35, n=6) e a adição
de AP não altera a seletividade de membranas de DPhPC com cardiolipina (nT=0,3±0,12,
GH+=0,87±0,49, n=6 e Gleak=1,36±0,71, n=6), fatores observados através dos valores
de nT, GH+ e Gleak.
Conclusões: (1) a incorporação de cardiolipina as membranas de DPhPC diminui a GH+
destas membranas; (2) a adição de AP as membranas de DPhPC com cardiolipina não altera
a GH+ e (3) as cardiolipinas estariam atuando como "seladoras de membrana", diminuindo
a probabilidade de formação de defeitos na matriz lipidica, por onde H+ poderiam se
difundir.
Apoio Financeiro: CAPES

Número Final: 20.020

MODULAÇÃO DA NA+-ATPASE DE TÚBULOS PROXIMAIS RENAIS POR
CERAMIDA E CERAMIDA-1 FOSFATO. Cabral, L. M. P. * ; Wengert, M. ** ;
Caruso-Neves, C. ; Vieyra, A. R. ; Einicker-Lamas, M. ; Biofísica CCS , UFRJ ; IBCCF, UFRJ ;
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ .
Objetivo:

Resultados anteriores do nosso grupo tem demonstrado que diferentes lipídeos de
membrana possuem potencial modulatório sobre as ATPases transportadoras de íons. O
objetivo deste trabalho foi identificar o efeito dos lipídeos sinalizadores ceramida (cer) e
ceramida 1-P (c1P) na atividade da Na+-ATPase insensível à ouabaína de membrana
basolateral (MBL) de túbulo proximal renal, assim como estudar o possível envolvimento de
uma proteína cinase C (PKC).
Métodos e Resultados:

O trabalho foi realizado utilizando-se frações purificadas de MBL de túbulos proximais de
rins de porco obtidas como descrito por Coka-Guevara e colaboradores (Eur. J. Biochem.,
263: 71-78.1999). O aumento da concentração de cer e c1P promoveu uma inibição da
atividade Na+-ATPásica que satura em valores de 45% e 44% em relação ao controle,
respectivamente. O efeito máximo foi obtido na concentração de 200 nM para cer e 100 nM
para c1P. Nesta condição a atividade diminuiu de 18,0±1,6 nmol Pi x mg-1 x min-1 para
8,2±1,4 nmol fosfato incorporado x mg-1 x min-1 na presença de cer, e para 7,9±1,8 nmol Pi
x mg-1 x min-1 na presença de c1P (n=5). Foi também observado que 200 nM de cer
aumenta em 118% a atividade da PKC (n=3). Este aumento da atividade da PKC foi
avaliado em ensaio de fosforilação de histona H8 na presença das concentrações de cer
descritas acima, comparando na presença do ativador (PMA) e do inibidor (calfostina C) de
PKC.


Conclusões:

A estimulação por cer da PKC (que aumenta a atividade Na+-ATPásica) constituiria um
mecanismo modulatório da inibição do transporte de Na+ por ceramidas..


Apoio Financeiro: CNPq , FAPERJ , FUND.JOSÉ BONIFÁCIO , PROFIX , PRONEX

Número Final: 20.021

MODULAÇÃO DO PROMOTOR DO GENE NHE3 POR PARATORMÔNIO.
Nogueira, C. ; Girardi, A. ; Rebouças, N. A. ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
                      **

Objetivo: Em trabalho prévio do mesmo laboratório, demonstramos que o efeito inibitório
que o tratamento crônico com paratormônio PTH exerce sobre a atividade de NHE3 em
túbulos proximais está associado com redução nos níveis de mRNA- e de proteína-NHE3. O
principal objetivo do presente estudo é investigar se o efeito do PTH se deve a regulação da
transcrição do gene NHE3.
Métodos e Resultados: Para avaliar a sensibilidade da região regulatória do gene NHE3 a
PTH, nós clonamos a região promotora do gene no vetor pGL3basic, de tal modo que o
promotor NHE3 exercesse o controle da transcrição do gene repórter luciferase (Firefly
luciferase). Utilizando PCR e depois digestão com endonucleases específicas, obtivemos os
seguintes constructos em pGL3, cuja numeração se baseia no mapeamento da região
promotora de NHE3 feito por Kandasamy e Orlowski: 1) – 2.095 a + 55 , que é nosso
constructo maior; 2) – 2,095 a –17, que inclui o ponto início de transcrição mapeado por
Cano, mas não o mapeado por Orlowski; 3) – 1.196 a +55; 4) – 467 a + 55; 5) – 152 a +
55. Células OKP, uma linhagem de túbulos proximais de rim de opossum que
endogenamente expressa recepor para PTH, foram transfectadas com os constructos em
pGL3 ou com pGL3-basic, que é nosso controle sem promotor. Para controle da eficiência de
transfecção, as células foram simultaneamente transfectadas com pRL-CMV, vetor contendo
o gene repórter Renila luciferase controlado pelo promotor CMV. Quatro horas após a
transfecção, já em meio sem soro, o meio era substituído por meio contendo PTH, 10 -7 ou
10-8 M. A atividade de luciferase era avaliada após 6, 16, 24 ou 48 horas.Observamos
repressão significativa da atividade do promotor pelo PTH apenas com o constructo – 152 a
+55, redução de 131,4 ± 31,7 para 73,0 ± 6,0 (atividade de luciferase firefly/renila do
constructo específico em relação a pGL3-basic); a inibição foi mais evidente com 6 e 16
horas, mas ainda estava presente com 24 horas. A atividade do promotor foi
significativamente mais elevada com o constructo – 152 a +55 que com os demais
constructos (contructo – 2.095 + 55: 18,1 ± 48,4; constructo – 152 a + 55: 131,4 ± 31,7),
mostrando que existem importantes elementos inibitórios da atividade do promotor à
montante da posição – 152.
Conclusões: PTH excerve efeito inibitório sobre o promotor do gene NHE3 que só pode ser
detectado com constructos compreendendo a região – 152 a + 55; acima da posição – 152
existem elementos inibitórios importantes que parecem se sobrepor ao efeito inibitório do
PTH, dificultando a visualização desse efeito quando avaliamos regiões mais extensas do
promotor.
Apoio Financeiro: FAPESP

Número Final: 20.022

PARTICIPAÇÃO DO ÍON CLORETO NA REGULAÇÃO DO VOLUME E pH
DE CÉLULAS DE TÚBULOS PROXIMAIS DE RATOS (IRPTC)
Carraro, L. R. ; Rebouças, N. ; Malnic, G. ; Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
            **

Objetivo: Neste trabalho, procuramos estudar o envolvimento de íons cloreto nos
mecanismos de regulação de volume e pH de células IRPTC, especialmente o papel da
H+-ATPAse vacuolar.
Métodos e Resultados: O pH intracelular foi medido em monocamadas de células
cultivadas sobre suportes impermeáveis, utilizando o probe sensível a pH, BCECF, e um
microscópio de fluorescência invertido. As medidas de volume celular foram realizadas
através de microscopia confocal, com a utilização do marcador Acridina Orange. As células
IRPTC têm um pH basal de 7.10±0.013 (n=14) e após um pulso ácido com NH4Cl, é
recuperado com uma velocidade (dpHi/dt) de 0.29±0.022 (n=14) unidades de pHi/min. Nas
células IRPTC, esta recuperação independente de bicarbonato depende do permutador
Na+/H+ e da H+-ATPase vacuolar. Com a utilização de uma solução livre de Na + (condição
que inibe o permutador Na+/H+), a recuperação do pHi foi de 0.076±0.011 (n=11) unidades
de pHi/min. Esta recuperação foi significantemente diminuída quando da adição de NPPB (10
uM), um clássico inibidor de canais de cloreto, atingindo o valor de 0.046±0.0063 (n=11).
O mesmo comportamento foi observado quando da adição de uma solução livre de ambos
os ions, Na+ e Cl-, onde a recuperação encontrada foi ainda menor, ou seja, 0.024±0.0051
(n=6) unidades de pHi/min. Como a depleção de íons cloreto afetou a função da H+-ATPase,
procuramos também estudar a influência deste íon sobre o volume de células IRPTC. Após a
incubação com uma solução livre de cloreto, observamos uma redução de 45.29±7.11
(n=6)% do volume destas células. Com a utilização de uma solução também livre de
cloreto, porém hipotônica, observamos um aumento de 15.35±3.98 (n=7) % no volume
das células IRPTC.


Conclusões: Nossos resultados permitem concluir que, além de provocar alterações no
volume de células IRPTC, os canais de cloreto estão envolvidos com a H+-ATPase vacuolar
destas células, já que a inibição destes canais levou a uma forte redução da atividade da
ATPase.


Apoio Financeiro: FAPESP , CNPq , CAPES

Número Final: 20.023

EXPRESSÃ0 E CARACTERIZAÇÃ0 FUNCIONAL DO TRANSPORTADOR
DE NUCLEOSÍDEOS HUMANO (hCNT3), EM CÉLULAS RENAIS
Oliveira-Souza, M. ; Ming Tse, C. ; Department of Medicine, Johns Hopkins University ;
                  **

Fisiologia e Biofísica ICB1, USP .
Objetivo: Avaliar o transporte de nucleosídeos e seus análogos através do hCNT3, expresso
em células renais PK15NTD.


Métodos e Resultados: Em nossos estudos, clonamos o hCNT3 e expressamos o
recombinante em células renais PK15NTD. Analisamos a afinidade dessa proteína pelos
diferentes análogos de uridina (100 µM) e determinamos a constante de afinidade (Km),
bem como a capacidade máxima de transporte (Vmax) do hCNT3 pelos nucleosídeos
adenosina, guanosina, inosina, citidina, timidina ou uridina, através da análise do ganho
desses nucleosídeos radioativos [3H] (1µCi/ml). Encontramos que o hCNT3 estavelmente
expresso em células PK15NTD, é uma proteína de 67 kDa que transporta com alta afinidade
os nucleosídeos adenosina, guanosina, inosina, citidina, timidina ou uridina, com alta
afinidade [Km = 5.2 ± 0.5µM (4), 6.2 ± 0.4µM (4), 6.6 ± 0.6µM (6), 5.7 ± 0.7µM (5), 5.4
± 0.5µM (4) e 1.8 ± 0.3µM (7) respectivamente], por mecanismo Na +-dependente. Além
disso, a expressão do hCNT3 aumenta a sensibilidade das células PK15NTD aos análogos de
uridina (2’-deoxyuridine, 5-fluorouridine, 5-fluoro-2’-deoxyuridine, 5-fluoro-5’-deoxyuridine,
5-iodo-2’-deoxyuridine, 5-iodouridine, 4-thiouridine ou 6- azauridine), mas não aos
análogos de uridina (2’-3’-dideoxyuridine ou 3’-azido-2’3’-dideoxyuridine).


Conclusões: Nossos resultados indicam que o hCNT3 transporta tanto nucleosídeos
purinérgicos como pirimídicos, com alta afinidade e por mecanismo Na +-dependente. Por
outro lado, os análogos de uridina (2’-deoxyuridine, 5-fluorouridine,
5-fluoro-2’-deoxyuridine, 5-fluoro-5’-deoxyuridine, 5-iodo-2’-deoxyuridine, 5-iodouridine,
4-thiouridine ou 6- azauridine), são substratos do hCNT3.


Apoio Financeiro: CNPq

Número Final: 20.024

RHODNIUS    PROLIXUS  MALPIGHIAN   TUBULES   AQUAPORIN
EXPRESSION IS MODULATED BY 5-HYDROXYTRYPTAMINE. Martini, S. V. *
                                                   *
; Coeli dos Santos Goldenberg, R. ; Fortes, F. S. A. ; Campos de Carvalho, A. C. ; Falkenstein, D. ;
Morales, M. M. ; Biofísica CCS , UFRJ ; Biologia, UFRJ ; Cardiologia Celular Molecular - IBCCF,
UFRJ ; Fisiologia Renal - IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl - G, UFRJ ; Instituto Biofísica Carlos
Chagas Filho - BL. C, UFRJ .
Objetivo: The proposal of this present study was to detect and study an aquaporin-like
water channel, a member of the major intrinsic protein (MIP) family, in the Malpighian
tubule (MT) of the insect Rhodnius prolixus, which excrete a large bulk of fluid after a
massive blood meal, and its possible regulation by 5-hydroxytryptamine
Métodos e Resultados: Methods and Results: Reverse transcription polymerase chain
reaction (RT-PCR) and Southern blots of cDNA was obtained from adult Rhodnius prolixus
MT poly (A)+ RNA. Employing degenerate primers, corresponding to the NPA (amino acid
sequence motifs repeats Asn-Pro-Ala), we were able to identify a 370-base pair PCR
product. RNase protection assay and semi-quantitative RT-PCR showed that Rp-MIP mRNA
from MT increased (2.5±0.25 and 3.9±0.96 folds, respectively) in animals after a blood
meal over control, not fed animals (n=4, p<0,05). The Western blotting using anti-MIP26 or
anti-AQP-1 antibodies to membrane proteins derived from MT, showed in fed animals an
increased in protein expression of approximately 2.5 folds over control (n=4, p<0,05). The
control group were divided: control, treated with 5-hydroxitriptamine at 10-6 mol/l (5-HT),
treated with cyclic AMP at 10-4 mol/l (cAMP), and treated with both 5-hydroxitriptamine and
cyclic AMP at the same concentrations used in the other groups. 5-HT or cAMP increased
Rp-MIP mRNA expression 1.87 and 2.5 folds of control values, respectively (n=3, p<0,05).
Stimulation with both cAMP and 5-HT was not able to additionally increase the levels of
mRNA message.
Conclusões: Conclusion: The Rhodnius prolixus MT mRNA expression of this water
transporter is increased in the animal after blood meal and in tubules treated with
5-hydroxytryptamine or cAMP. The up-regulated expression of MT MIP mRNA after a blood
meal is probably due to the action of 5-hydroxytryptamine via a cAMP dependent pathway.
Apoio Financeiro: CNPq , FUJB , FAPERJ

Número Final: 20.025

MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS CANAIS DE CLORETO CFTR E
TNR-CFTR POR HORMÔNIOS TIREÓIDEOS EM RIM DE RATOS. Andrade,
A. C. O. de ; Ornellas, D. dos S. ; Morales, M. M. ; Fisiologia Renal - IBCCF, UFRJ ; IBCCF, UFRJ
           *                    **

; Instituto Biofísica Carlos Chagas Filho - BL. C, UFRJ .
Objetivo: Os hormônios tireóideos atuam sobre a expressão de transportadores de sódio,
tais como o trocador Na+/H+ e a bomba (Na++ K+)ATPase. Tendo em vista que no tecido
renal grande parte do transporte de sódio está associada ao do cloreto, estudamos a
regulação da expressão do canal de cloreto Regulador da condutância Transmenbrana da
Fibrose Cística (CFTR) e de seu splicing variante TNR-CFTR pelos hormônios tireóideos.
Métodos e Resultados:

Foram utilizados ratos controle, hipotireóideos, hipotireóideos com reposição de T4 e
hipertireóideos e células IRPT. O RNA total deste material foi extraído e submetido à reação
de RT-PCR semiquantitativo ou sua proteína foi extraída e submetida à reação de western
blot. Resultados: Em rim total, o RT-PCR mostrou uma redução de 33,3% na expressão do
RNAm do CFTR no grupo de ratos hipotireóideos em relação ao controle (n=5;P<0,05). No
grupo hipertireóideo, houve aumento significativo da expressão do CFTR (42,6%, n=5,
P<0,001). No grupo com reposição de T4, os valores retornam ao valor de controle. O
mesmo perfil foi observado para a proteína do TNR-CFTR, e o tratamento de cultura de
células imortalizadas de túbulo proximal de ratos (IRPT) com T4 mostrou um efeito
dose-dependente do aumento da expressão do RNAm do CFTR (n=3). A análise da
estimulação da região promotora do gene CFTR pelo hormônio T4 demonstrou, inicialmente,
que este hormônio não tem ação direta sobre a modulação da expressão gênica .


Conclusões: Concluímos, então, que os hormônios tireóideos modulam a expressão dos
canais de cloreto CFTR e TNR-CFTR.
Apoio Financeiro: CAPES , CNPq , FAPERJ , FUND.JOSÉ BONIFÁCIO , PRONEX-MCT

Número Final: 20.026

EXPRESSÃO GÊNICA DO CANAL DE CLORETO CFTR EM CÉLULAS
MDCK-I MODULADA POR ARGININA VASOPRESSINA VIA RECEPTOR
V2. Barbosa, C. M. de L. * ; Novaira, H. J. ** ; Morales, M. M. ; Biofísica CCS , UFRJ ; Fisiologia
Renal - IBCCF, UFRJ ; IBCCF, UFRJ .
Objetivo: O hormônio arginina vasopressina (AVP) é liberado em condições de aumento da
osmolaridade plasmática e sua ação depende da sua ligação aos respectivos receptores V1 e
V2 podendo induzir a transcrição gênica de transportadores. O CFTR, um canal de cloreto,
está amplamente expresso em vários epitélios como o dos rins, pulmões, pâncreas e do
aparelho reprodutivo. Mutações nesse canal levam à sua síntese anormal o que é a causa
da fibrose cística caracterizada por patologias severas que afetam principalmente os
pulmões. Curiosamente, os rins, que abundantemente expressam CFTR, não são
acometidos. Nosso objetivo foi compreender a via pela qual a AVP modula a expressão
gênica do CFTR.
Métodos e Resultados: Foram utilizadas células MDCK-I, derivadas de rim canino.que
foram tratadas a 370C por 24 h com AVP e antagonistas específicos para os receptores V1 e
V2: 1)Células (controle) 2)Células tratadas com AVP [10-8M] 3)Células tratadas com
antagonista de V1 [10-5M] 4)Células tratadas com antagonista de V2 [10-5M] 5)Células
tratadas com antagonista de V1 e de V2 [10-5M] 6)Células tratadas com AVP [10-8M] e
antagonista de V1 [10-5M] 7)Células tratadas com AVP [10-8M] e antagonista de V2
[10-5M] 8)Células tratadas com AVP [10--8M], antagonista de V1 e de V2, [10-5M]. Após
tratamento, a expressão do RNAm foi estudada por RT-PCR semi-quantitativo.
RESULTADOS: Foi observado um aumento de 114%, em relação ao controle, na expressão
gênica do CFTR em células tratadas com AVP [10-8M] (n=4, p<0.05). Um aumento de
111% também foi observado em células tratadas com AVP[10-8M] e antagonista de V1
[10-5M] (n=4, p<0.05). Nos demais grupos não foram observadas variações significativas
da expressão gênica do CFTR em relação ao controle.
Conclusões: Os resultados obtidos sugerem a participação do receptor V2 na cascata de
sinalização gerada pelo AVP que induz a expressão gênica do CFTR em células MDCK-I.
Apoio Financeiro: CNPq , CAPES , FAPERJ , FUJB , PRONEX-MCT

Número Final: 20.027

MODULAÇÃO DA REGIÃO PROMOTORA DO GENE DO CANAL DE
CLORETO CLC-2 PELA ANGIOTENSINA II EM LINHAGEM DE CÉLULAS
PROVENIENTES DE TÚBULO PROXIMAL DE RATO (IRPTC). Rangel, G. ;
Martini, S. V. ; Morales, M. M. ; Fisiologia Renal - IBCCF, UFRJ ; IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl - G,
            *

UFRJ .
Objetivo: A angiotensina II (ANGIO II) age na regulação do volume do fluido extracelular
(VEC), por modular a reabsorção renal de NaCl, principalmente no túbulo proximal. Nesse
trabalho estudamos o envolvimento do canal de cloreto CLC-2 no transporte transepitelial
de Cl modulado pela ANGIO - II.
Métodos e Resultados: Foram realizados experimentos para demonstrar a possível
estimulação da região promotora do gene CLC-2 pela ANGIO II através do método da
luciferase. Plasmídios contendo o promotor do CLC-2, juntamente com o gene da luciferase,
foram transfectados em grupos de células provenientes de túbulo proximal de ratos (IRPTC)
e a influência da ANGIO II sobre o promotor CLC-2 foi estudada através da medida da
atividade da luciferase. Como controle interno da transfecção foram utilizados plasmídeos
contendo genes da b-galactosidase. Células IRPTC foram cultivadas em meio D-MEM (5%
soro fetal bovino) e divididas em 5 diferentes grupos: não transfectadas (NT), transfectadas
e não tratadas com ANGIO II, transfectadas e tratadas com ANGIO II nas concentrações de
10-7M, 10-8M e 10-9M. Células transfectadas e tratadas com concentrações de 10 -7M e 10-8M
com ANGIO II apresentaram um aumento da atividade da luciferase de 32,6% e 13,3%
respectivamente, como conseqüência do estímulo da região promotora do CLC-2 (n=3,
p<0.05).
Conclusões: Nosso experimento sugere que a região promotora do gene CLC-2 é modulada
pela ANGIO II.
Apoio Financeiro: CAPES , CNPq , FAPERJ
Número Final: 20.028

MODULATION OF CHLORIDE CHANNEL CFTR EXPRESSION BY ATRIAL
NATRIURETIC PEPTIDE PATHWAY cGMP IN HUMAN INTESTINAL
CACO-2 EPITHELIAL CELLS. Novaira, H. J. ** ; Morales, M. M. ; Fisiologia Renal - IBCCF,
UFRJ ; IBCCF, UFRJ .
Objetivo: The maintenance of the extracellular volume (ECV) depends, mainly, on the
regulation of NaCl transport that occurs in the intestinal duct and along the nephron. Among
some existing chloride transporters in the intestine, we highlight the Cystic Fibrosis
Transmembrane Regulator (CFTR) channel, whose dysfunction can lead to diarrhea
processes and genesis of the pathology known as Cystic Fibrosis. The objective of the
present work is to study the gene expression modulation of CFTR chloride channel by
hormones known to be involved in the regulation of the ECV.


Métodos e Resultados: Human intestines cells CaCo-2 had been treated with atrial
natriuretic peptide (ANP) in the concentrations of 10-11, 10-10, 10-9,10-8, 10-7 and 10-6 M for
12 hours. Total RNA was extracted and CFTR mRNA was analyzed by reverse transcription
reaction - polimerase chain reaction technique (RT-PCR). The -actina gene was used as
internal control. In the experiments, ANP increased the expression of CFTR mRNA in 64%
(n=6, p<0.05) in a dose dependent way, reaching maximum effect in the concentration of
10-9 M, when comparing to control. The study with cGMP inhibitor demonstrated the
participation of this secondary messenger in the signaling pathway of ANP (n=4, p<0.05).
Luciferase activity analysis in CaCo-2 cells treated with ANP showed increase of 24% in the
activation of the promoter region of CFTR gene, demonstrating increase on its transcription
(n=4, P<0,01). Immunoblotting for CFTR in cells culture treated with ANP showed increase
on protein expression of 47% (n=3, p<0.05).


Conclusões: CFTR gene modulation in CaCo-2 cells by ANP, hormone involved in the
regulation of the ECV, suggests its major role modulating chloride transport in the intestine
and its possible participation in the regulation of the ECV.


Apoio Financeiro: CNPq , CAPES , FAPERJ , FUJB , PRONEX-MCT

Número Final: 20.029


CORRENTES DE CLORETO EM CÉLULAS DE LEYDIG DE
CAMUNDONGOS.
Chaves, L. A. P. ; Varanda, W. A. ; Fisiologia, FMRP-USP ; Fisiologia - FMRP, USP .
               **

Objetivo: Caracterizar eletrofisiologicamente as correntes de cloreto em células de Leydig
de camundongos.
Métodos e Resultados: Células de Leydig foram isoladas de camundongos Swiss, com
idade ao redor de 60 dias e usadas a fresco. Registros eletrofisiológicos foram realizados na
configuração “whole-cell” da técnica de “patch-clamp” em condição isosmótica (315 mOsm
kg H2O; solução de pipeta: NMDG 120 mM; HEPES 10 mM; MgCl 2 1.2 mM; manitol 60 mM;
e solução de banho: NMDG 120 mM; HEPES 10 mM; CaCl 2 1.2 mM; MgCl2 0.5 mM; manitol
60 mM). As correntes ativadas por hiperpolarização são dependentes de tempo, apresentam
cinética lenta de ativação (decurso temporal descrito por equação com duas exponenciais;
-160 mV: 1 240 ± 27 ms e 2 33 ± 2 ms) e relação I-V retificante de entrada (Er próximo
de -20 mV). A relação g-V foi bem descrita pela equação de Boltzmann (V0 de -91 mV e
slope de 20 mV). O antagonista não específico para correntes de cloreto, DIDS, foi ineficaz
em bloquear estas correntes na concentração de 500 M.
Conclusões: A cinética lenta de ativação, a relação I-V retificante de entrada e
dependência de voltagem observadas nestas células são muito semelhantes aquelas
descritas, em sistemas de expressão, para o canal do subtipo ClC-2.
Apoio Financeiro: FAPESP

Número Final: 20.030

PARTICIPAÇÃO DE CA2+ NA REGULAÇÃO DE VOLUME EM CÉLULAS
S-91 Perci-Lima, R. D. ** ; Cassola, A. C. ; Salomao, L. C. ; Faculdade Ciências Biol. - Exatas e
Exp., UNIVERSIDADE PRESBETERIANA MACKENZIE ; Fisiologia - IB, USP ; Fisiologia e
Biofísica ICB1, USP .
Objetivo:

A capacidade de regulação de volume celular frente a mudanças osmóticas do ambiente
extracelular constitui-se num dos mais importantes mecanismos homeostáticos. Em células
capazes de redução regulatória de volume (RVD) admite-se que esta resposta osmótica
envolve 3 componentes: um sensor de volume, um mecanismo efetor e um sinalizador ou
segundo mensageiro que une o sensor ao efetor, dentre os quais, o Ca 2+ parece ser o mais
freqüente. Assim, mudanças na [Ca 2+]i têm sido descritas em várias células submetidas a
condições anisosmóticas. O objetivo deste trabalho foi determinar a participação do Ca2+
nos fenômenos de RVD em células S-91 expostas a choques anisosmóticos agudos.


Métodos e Resultados:

As células foram mantidas em cultura de monocamada em meio F-12 de Ham com 10% de
soro fetal bovino, em estufa de CO2 a 5% e a 37°C. Antes dos experimentos, as células
foram removidas com solução de Tyrode/EDTA e uma alíquota de 5 L foi tranferida para
discos de cultura. As células foram cobertas com 4 mL de meio de cultura e incubadas por
10 min a 37ºC até apresentarem-se parcialmente aderidas e em formato esférico. O
sistema de perfusão foi montado sobre a pátina de um microscópio invertido, de modo a
permitir a troca de soluções do disco de cultura através de uma bomba peristáltica. As
células foram, então, perfundidas em 3 etapas: solução isosmótica (290mOsm/kgH2O),
solução hiposmótica (190mOsm/kgH2O) e, novamente, solução isosmótica, acrescidas ou
não dos bloqueadores: nifedipina (1uM), CoCl 2 (1mM), LaCl3 (10mM), GdCl3 (0,1 mM), NiCl2
(4 mM). As células também foram perfundidas com soluções sem Ca2+ acrescidas de EDTA
(5 mM). Imagens das células em diferentes intervalos de tempo de perfusão foram
adquiridas para posterior estimativa do volume celular. Para tanto, utilizou-se uma câmera
de vídeo acoplada ao microscópio e a um microcomputador. A análise das imagens celulares
e as estimativas do volume celular foram realizadas empregando-se o programa Image
Pro-lite (Media Cybernetics). Nos experimentos para determinação das variações na [Ca 2+]i,
as células foram perfundidas com solução de carregamento de Fluo 4AM + Fura red +
Pluronic, onde permaneceram por 10-15 minutos e a seguir lavadas com solução
isosmótica. Após este período, as células foram perfundidas em 2 etapas: solução
hiposmótica e solução isosmótica. A câmara de perfusão foi acoplada a um microscópio
confocal com varredura a laser e as imagens da excitação da emissão fluorescente por laser
de argônio foram gravadas e analisadas no tocante às variações da intensidade de
fluorescência e área celular, através do software LSM 510 – Zeiss. Os resultados indicam
que a RVD é dependente de Ca2+ embora os métodos empregados não tenham permitido a
visualização direta da ocorrência de transientes na [Ca2+]i.


Conclusões: O íon Ca2+ atua na RVD das células S-91.
Apoio Financeiro: FAPESP

Número Final: 20.031

AÇÃO INTEGRADA DE PEPTÍDEOS DERIVADOS DE ANGIOTENSINA
NA REGULAÇÃO DO TRANSPORTE RENAL DE CÁLCIO. Miranda, I. A. ** ; Costa
Sarmento, G. ; Assunção Miranda, T. ; Malta Cerqueira, D. ; Vieyra, A. R. ; Biofísica, UFRJ ;
                                    *                      *

Biofísica CCS , UFRJ ; IBCCF - Bl - G, UFRJ .
Objetivo: Muitas ações tubulares de angiotensina II (AII), incluindo a modulação do
transporte ativo de Na+, recrutam o Ca2+ como sinalizador intracelular. A AII pode ser
formada, metabolizada e concentrada no interstício renal e a (Ca2++Mg2+)ATPase de
membrana plasmática (PMCA) é responsável pelo ajuste fino da concentração citosólica de
Ca2+ em túbulos renais. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos de AII na
atividade da PMCA de túbulos proximais em concentrações plasmáticas (picomolares) e nas
encontradas no interstício renal (nanomolares), buscando evidenciar também o
envolvimento dos metabólitos de AII na modulação do Ca 2+ intracelular.
Métodos e Resultados: A fração de membrana basolateral de túbulos proximais (MBL) de
rins de ovelha foi obtida em gradiente de Percoll. A atividade ATPásica foi medida através da
liberação Pi proveniente da hidrólise de ATP. A AII inibe 50% da atividade
(Ca2++Mg2+)ATPásica controle (12,8 +- 0,6 nmol Pi x mg-1 x min-1) em concentrações
picomolares (circulantes). Aumentos da concentração de AII (nanomolares) levam à
recuperação completa da atividade (Ca2++Mg2+)ATPásica. A metabolização de AII (5 x 10-7
M) na presença da MBL foi demonstrada por HPLC em diferentes tempos de pré-incubação.
O processo de metabolização de AII (retenção de 14,3 min) evidência a passagem por
ang(1-7) (12,9 min), resultando em dois peptídeos finais (9,5 e 11,7 min). A adição de
inibidores de peptidases (bestatina e EDTA) aumenta a vida média da AII. O estudo do
curso temporal da atividade (Ca2++Mg2+)ATPásica revela uma relação de dependência
tempo/efeito a uma concentração inicial de AII 5 x 10 -7 M. Até 5 min revela-se o efeito
inibitório de aproximadamente 50%. Após 5 min a atividade é gradativamente recuperada
até alcançar os níveis controle aos 20 min. Este efeito pode ser correlacionado com a
metabolização de AII. A inibição promovida por AII 10-11 M é linear ao longo do tempo.
Conclusões: O efeito bifásico promovido por AII na atividade ATPásica pode ser resultado
da ação integrada entre AII e os peptídeos derivados da metabolização da mesma. Isto
revela uma cascata regulatória da PMCA dentro do próprio sistema renina angiotensina, que
seria relevante na modulação do transporte transepitelial em túbulos proximais, em quadros
que cursam com altos níveis de AII.
Apoio Financeiro: CNPq , PRONEX , FUJB , CAPES , FAPERJ

Número Final: 20.032

ANIMAIS TRANGÊNICOS QUE APRESENTAM MUTAÇÃO NO RECEPTOR
BETA DE HORMÔNIOS TIREÓIDEOS TÊM A EXPRESSÃO GÊNICA
RENAL DO CANAL DE CLORETO CLC-2 DIMINUÍDA Ornellas, D. dos S. ** ;
ORTIGA-CARVALHO, T. ; Coeli dos Santos Goldenberg, R. ; Morales, M. M. ; Fisiologia Renal -
IBCCF, UFRJ ; IBCCF, UFRJ ; Instituto Biofísica Carlos Chagas Filho - BL. C, UFRJ .
Objetivo: O canal de cloreto ClC-2 pertence à família CLC de transportadores de cloreto e
está abundantemente expresso no rim.
Já demonstramos que a expressão do CLC-2 é regulada por hormônios tireóideos (HT) (J
Endocrinol. 178(3): 503-11 2003). Entretanto, os mecanismos pelos quais os HT alteram a
expressão desse canal ainda não foram elucidados.

Nosso objetivo foi estudar a possível participação do receptor  de HT (TR-) na modulação
da expressão gênica do canal

de cloreto ClC-2, e também a possível ação dos HT sobre a região promotora do gene que
codifica o canal de cloreto ClC-2.


Métodos e Resultados: Rins de camundongos C57/B6 normais (+/+) e contendo mutação
no TR- (Δ337T) em homozigoze (-/-) ou heterozigoze

(+/-) foram utilizados. A expressão do RNAm do ClC-2 foi analisada através de RT-PCR
semi-quantitativo e expressão da

proteína por immunoblotting com anti-ClC-2 monoclonal, sendo controle interno desta
reação a -actina. Células imortalizadas

de túbulo proximal de rim de ratos (IRPTC) transfectadas com plasmídeos contendo a região
promotora do ClC-2 associado

ao gene da luciferase foram tratadas com T3 a 10-7, 10-6 e 10-5 M por 24h.

A expressão renal do RNAm do ClC-2 apresentou uma diminuição de 27% no grupo (+/-) e
de 43% (p<0,05, n=5) no grupo

(-/-), quando comparados com controle (+/+). A expressão da proteína do ClC-2
apresentou uma diminuição no grupo (+/-)

de 43% e (-/-) de 55%, em relação ao controle (p<0,05, n=5). Não foram observadas
alterações significativas no ensaio de

estímulo da região promotora do ClC-2 por T3 nas concentrações de hormônio utilizadas.


Conclusões: Estes resultados sugerem a participação do TR- na modulação da expressão
renal do ClC-2 por HT e que a ação do HT sobre

a expressão deste canal não está associada ao estímulo direto da região promotora do gene
ClC-2.


Apoio Financeiro: CAPES , CNPq , FAPERJ , FUJB , PRONEX-MCT

Número Final: 20.033

THE ANION EXCHANGER AE2 (CL-/HCO-3) AND CLC-2 mRNA
EXPRESSION MODULATION ALONG THE NEPHRON OF RATS
SUBJECTED TO METABOLIC ACIDOSIS AND ALKALOSIS Tostes, V. ** ;
Ornellas, D. dos S. ; Martini, S. V. ; Zin, W. A. ; Morales, M. M. ; Fisiologia Renal - IBCCF, UFRJ ;
                   **              *

IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl - G, UFRJ ; Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ ;
Multidisciplinar de Pesquisa, UFRJ .
Objetivo: In this study we analyzed the AE2 (Cl -/HCO-3 exchanger) and the chloride
channel-2 (ClC-2) mRNAs expressions along the different segments of rat nephron
subjected to metabolic acidosis and alkalosis.


Métodos e Resultados: Male Wistar rats weighting 250 – 300g were subjected to
metabolic acidosis and alkalosis induced by ammonium chloride 75mmol/l and sodium
bicarbonate 150 mmol/l added to drinking water for two and twelve days, respectively.
Animals were divided in three groups: control, acidosis and alkalosis and they were kept in
metabolic cages for daily for urinary pH measurement. At the end of the experiments
animals were killed. Blood and the urine gasometry, biochemical and electrolyte parameters
were analyzed. The kidneys were evaluated to the AE2 and ClC-2 mRNA and protein
expression.

It was shown the reduction of 30% of AE2 mRNA expression in whole kidney in acidosis
group comparing with control group. In dissected nephrons it was observed, for in inner
medullary collecting duct (IMCD), a reduction of AE2 mRNA expression in the acidosis group
(60%) and an increase in the alkalosis group (of 28%) both compared with control group.
In outer medullary collecting duct (OMCD), it was observed a reduction of 48% in AE2
mRNA expression in the acidosis group and an increase of 41% in the alkalosis group. The
ClC-2 mRNA expression in inner medullary collecting duct decreased 30% in animals
subjected to acidosis and increased 31% in alkalosis group, comparing to control. In outer
medullary collecting it was detected the ClC-2 mRNA expression only in alkalosis group. It
was not observed changes in AE2 or ClC-2 mRNA expression in glomerulus, convoluted and
straight proximal tubule, thin and thick ascending limb, and cortical collecting duct of
treated animals.


Conclusões: The AE2 mRNA expression was just modulated in the IMCD and OMCD. ClC-2
expression was modulated in IMCD in both acidosis and alkalosis groups. In OMCD ClC-2
showed expression only in the alkalosis group.


Apoio Financeiro: CNPq , CAPES , FAPERJ , FUJB , FAPERJ , CNPq

Número Final: 20.034

EFEITO DA TEMPERATURA NA REDUÇÃO REGULATÓRIA DE VOLUME E
CONDUTIVIDADE HIDRÁULICA DA MEMBRANA DE CÉLULAS DE
MELANOMA MURINO LINHAGEM S91. Malta-Silva, J. F. ** ; Salomão, L. C. ; Valotta, L.
A. ; Fisiologia, Instituto de Biociências da USP ; Faculdade Ciências Biol. - Exatas e Exp.,
  **

UNIVERSIDADE PRESBETERIANA MACKENZIE .
Objetivo: A maioria das células submetidas a choques hiposmóticos agudos sofre um
rápido inchamento seguido de uma lenta redução regulatória de volume (regulatory volume
decrease, RVD), resultado do efluxo de solutos intracelulares e do efluxo acoplado de água.
Neste estudo descrevemos o efeito da temperatura na RVD e na condutividade hidráulica da
membrana durante o inchamento inicial.


Métodos e Resultados: Células de melanoma murino, linhagem S91, foram mantidas em
meio de cultura F12 HAM (290mOsm.kgH2O-1). As medidas morfométricas das mudanças
relativas de volume foram realizadas usando um sistema de aquisição e análise de imagens
(Image Pro-Lite, Media Cybernetics). As células foram expostas a um choque hiposmótico
agudo (190mOsm.kgH2O-1) em diferentes temperaturas: (i) a 37oC, resultou em um
aumento imediato no volume celular (27%), seguido de RVD até a linha de base em 30min
(ANOVA, p < 0,05, n > 90); (ii) a 27oC, resultou em um aumento imediato no volume
celular (31%), seguido de RVD até a linha de base em 60min (ANOVA, p < 0,05, n > 90);
(iii) a 17oC, resultou em um aumento imediato no volume celular (24%), seguido de uma
RVD insipiente em 60min (ANOVA, p < 0,05, n > 90). A condutividade hidráulica da
membrana na fase de inchamento inicial foi de: (i) 0,1902μm3.μm-2.min-1.atm-1 (n > 90), a
37oC; (ii) 0,1623μm3.μm-2.min-1.atm-1 (n > 90), a 27oC; e (iii) 0,1324μm3.μm-2.min-1.atm-1
(n > 90), a 17oC. O cálculo das condutividades hidráulicas em diferentes temperaturas
possibilitou o cálculo da Energia de Ativação (Ea) do transporte osmótico de água na fase de
inchamento inicial em 136,5 kcal.mol-1.


Conclusões: Esses resultados sugerem que tanto o tempo de RVD como a condutividade
hidráulica da membrana são dependentes da temperatura.


Apoio Financeiro: CAPES , FAPESP

Número Final: 20.035

EFEITO DE BLOQUEADORES DE TRANSPORTE NA CONDUTIVIDADE
HIDRÁULICA DA MEMBRANA DE HEMÓCITOS DO MEXILHÃO
MARINHO Perna perna EM CONDIÇÕES DE CHOQUE HIPOSMÓTICO
AGUDO. Valotta, L. A. ** ; Malta-Silva, J. F. ** ; Salomão, L. C. ; Fisiologia, Instituto de Biociências
da USP ; Faculdade Ciências Biol. - Exatas e Exp., UNIVERSIDADE PRESBETERIANA
MACKENZIE .
Objetivo: Mudanças no volume celular são causadas pelo fluxo de água através da
membrana celular. Essas mudanças resultam dos gradientes de pressão hidrostática e
osmótica e dependem da condutividade hidráulica da membrana (Lp). Essa Lp é aparente,
pois resultaria do fluxo combinado de água e de íons. Neste estudo descrevemos o efeito de
alguns bloqueadores de transporte na Lp durante o inchamento que segue ao choque
hiposmótico.


Métodos e Resultados: Hemócitos, obtidos da hemolinfa de P. perna, foram mantidos em
salina (1000mOsm.kgH2O-1). Medidas morfométricas das mudanças relativas de volume
foram realizadas usando um sistema de aquisição e análise de imagens (Image Pro-Lite,
Media Cybernetics). O choque hiposmótico agudo (600mOsm.kgH2O-1) resultou em um
aumento imediato no volume celular (23%), seguido de uma redução regulatória de volume
(RVD) até a linha de base em 5min (ANOVA, p < 0,05, n > 60). A Lp na fase de inchamento
inicial foi de 0,0559μm3.μm-2.min-1.atm-1 (n > 60). Hemócitos expostos a um choque
hiposmótico agudo (600mOsm.kgH2O-1), na presença de bloqueadores de canais iônicos
[cloreto de tetraetilamônio (TEA), 4-aminopiridina (4AP), cloreto de césio (CsCl), cloreto de
lantânio (LaCl3), cloreto de cobalto (CoCl2) e cloreto de cádmio (CdCl2)] exibiram um maior
aumento no volume celular (TEA, 10mM, 94%; 4AP, 1mM, 38%; CsCl, 10mM, 42%; LaCl 3,
10mM, 57%; CoCl2, 10mM, 51%; e CdCl2, 10mM, 45%, ANOVA, p<0,05, n > 60) como
resultado de um aumento no Lp [TEA, 4,04 vezes(x); 4AP, 1,55x; CsCl, 1,79x; LaCl 3, 2,53x;
CoCl2, 2,16x; e CdCl2, 1,48x, ANOVA, p < 0,05, n > 60] e um retardo na RVD.
Conclusões: O aumento de Lp e o retardo no tempo de RVD na presença dos bloqueadores
testados sugerem que canais iônicos se encontram ativos tanto na fase de inchamento
inicial como durante a RVD.


Apoio Financeiro: CAPES , FAPESP

Número Final: 20.036

INTERCELLULAR COMMUNICATION IN MACROPHAGE CELL LINES:
POSSIBLE INTERACTIONS BETWEEN GAP JUNCTIONS AND P2
RECEPTORS. Fortes, F. da S. de A. ** ; Fortes, F. da S. de A. ** ; Campos de Carvalho, A. C. ; Coeli
dos Santos Goldenberg, R. ; Biofísica do Centro de Ciência da Saúde, UFRJ ; IBCCF, UFRJ ;
Instituto Biofísica Carlos Chagas Filho - BL. C, UFRJ .
Objetivo: Previous studies of our laboratory demonstrated the expression of connexin 43
(Cx43) and P2X7 receptors in J774 cells, a macrophage derived cell line. Different clones of
these cells exhibit distinct functional coupling. We therefore used functionally coupled and
uncoupled J774 cells to investigate the relationship between Cx43 and P2X7 receptors
expression.
Métodos e Resultados: To study junctional communication we assessed cell-to-cell
communication by microinjecting Lucifer Yellow. Confluent cultures of batch 1 J774 cells
(B1.J774cells) were coupled, while batch 2 J774 cells (B2.J774cells), were essentially
uncoupled. By confocal microscopy (LSM 510 Meta Zeiss confocal microscope/Carl Zeiss,
Oberkochen, Germany), Cx43 and P2X7 receptors were co-localized at the membrane of
B1.J774cells. However, in B2.J774 cells Cx43 immunoreactivity was found only in the
cytosolic compartment, and it was not co-localized with the P2X7 receptor, present in
surface membrane. Additionally, immunoprecipitation demonstrated interaction between
Cx43 and P2X7 proteins in B1.J774cells, but not in B2.J774 cells.
Conclusões: These results suggest that there may exist a linker protein between P2X7
receptors and Cx43 that is not present in B2.J774 cells.
Apoio Financeiro: Inst. Milênio Bioeng. Tecidual , CAPES , CNPq , FAPERJ , PRONEX , FUJB

Número Final: 20.037

EUGENOL BLOQUEIA CORRENTES DE NA+ DEPENDENTES DE
VOLTAGEM EM NEURÔNIOS DO GÂNGLIO DA RAIZ DORSAL.
Carvalho-de-Souza, J. L. ; Bezerra-de-Menezes, A. P. ; Leal-Cardoso, J. H. ; Cassola, A. C. ; -, UEC
                        **                           **

; Ciências Fisiológicas, UEC ; Fisiologia - ICB, USP .
Objetivo: Eugenol (EUG), um fenol derivado do terpeno, está presente no óleo essencial de
diversas plantas aromáticas do nordeste brasileiro e há muito é usado como analgésico, em
aplicação tópica, na odontologia. Demonstrou-se recentemente que o EUG bloqueia a
transmissão do potencial de ação em axônios de vertebrados. O propósito foi testar a
hipótese de bloqueio pelo EUG de correntes de Na+ dependentes de voltagem
Métodos e Resultados: Corpos celulares de neurônios de gânglios da raiz dorsal de ratos
foram dispersos por tratamento enzimático e mantidos em cultura. Correntes macroscópicas
de Na+, dependentes de voltagem, foram observadas pela técnica de “patch clamp”,
configuração “whole cell”. Utilizaram-se o amplificador Axopatch 200B e os programas da
suite pClamp, da Axon Instrument. As membranas eram despolarizadas em pulsos
retangulares, a partir de um potencial de “manutenção”, freqüentemente de -110mV. Uma
sucessão de pulsos de amplitudes crescentes era aplicada para se determinar a relação I-V.
O efeito do EUG era avaliado em uma série temporal de pulsos, de mesma amplitude, em
que se sucediam a condição controle, a aplicação do EUG e, de novo, a condição controle.
Soluções com a droga e controle eram aplicadas diretamente sobre a célula por
micropipetas. Para a investigação de dependência de uso a freqüência dos pulsos era
modificada, de 1 a 10Hz. O EUG bloqueou as correntes de Na+ rápida e reversívelmente. O
bloqueio foi dependente de concentração, com IC50=2,44+0,15 mM. Não se verificaram
efeitos diferenciados nas correntes lentas e rápidas de Na+, nem efeitos sobre a cinética, de
ativação ou inativação. Não se observou dependência de freqüência no bloqueio.
Conclusões: O EUG bloqueia as correntes de Na+ dependentes de voltagem. A afinidade é
baixa e não ocorre dependência de uso, como se dá com alguns anestésicos locais.
Apoio Financeiro: FAPESP , PIBIC , CNPq , FUNCAP

Número Final: 20.038

CARACTERIZAÇÃO   DE   ATIVIDADE              APIRÁSICA              EM         GALHA
ENTOMÓGENA CAULINAR DE CALLIANDRA BREVIPES BENTH
(FABACEAE: MIMOSOIDAE) Rust, N. M. * ; Detoni, M. de L. ; Soares, G. L. G. ; Isaias, R. M.
dos S. ; Vasconcelos, E. G. ; Bioquímica, UFJF ; Bioquímica - ICB, UFJF ; Biologia - IB, UFMG ;
Biologia - IB, UFRGS .
Objetivo:

A galha caulinar é uma alteração morfo-anatômica e fisiológica do caule saudável que pode
ser induzida por insetos. Neste trabalho, uma apirase foi identificada pela primeira vez em
C. brevipes, presente em caule saudável e tecido galhado adjacente.


Métodos e Resultados:

Para a quantificação de fosfato inorgânico usou-se o método colorimétrico de Taussky &
Shorr, tendo como meio de reação padrão tampão succinato de potássio 0,1 M, pH 6,5,
CaCl2 5 mM, acrescido de 0,01 mg de proteína/ml. Os substratos ATP (662 ± 100 nmol
Pi/mg/min; n= 4), ADP (682 ± 143 nmol Pi/mg/min; n=8), UDP (50 nmol Pi/mg/min; n=2)
e GDP (22 nmol Pi/mg/min; n=2) foram degradados pelo homogeneizado de caule
saudável, revelando uma ampla capacidade fosfohidrolítica, que é característica de apirases.
Quando os resultados de atividades específicas do caule saudável e tecido galhado foram
comparados, observou-se que o tecido galhado apresenta uma atividade apirásica muito
elevada, sendo a hidrólise de ATP, ADP, UDP e GDP, aproximadamente 2, 3, 41 e 62 vezes
maior, respectivamente, do que aquela encontrada no caule saudável. A atividade ATPásica
destas amostras (caule saudável e tecido galhado) não foi afetada significativamente (< 20
%) pela adição de vanadato, azida sódica, ouabaína, DCCD ou bafilomicina A, assim
excluindo a interferência de ATPases dos tipos P-, F- e V-ATPases. Adicionalmente, a
atividade ADPásica da preparação de caule saudável e do tecido galhado foi 47 e 33%,
respectivamente, estimulada por cálcio, outra característica comum às apirases de
diferentes origens. Por Western blots desenvolvidos com anticorpos policlonais anti-apirase
de Solanum tuberosum, a apirase de C. brevipes foi identificada nas duas amostras como
uma banda de 74 kDa.


Conclusões:

A exacerbação dos mecanismos capazes de hidrolisar nucleosídeos di- e trifosfatados em
galhas caulinares de C. brevipes, através do aumento da atividade apirásica, pode ser um
indicativo de alterações no metabolismo primário do tecido galhado relacionadas com a
produção de substâncias nutritivas utilizadas pelo inseto indutor.
Apoio Financeiro: UFJF , CNPq , FAPEMIG

Número Final: 20.039

A PRODUÇÃO BASAL DE ÓXIDO NÍTRICO PELA ÓXIDO NÍTRICO
SINTASE DA MEMBRANA BASOLATERAL DE TÚBULOS PROXIMAIS
RENAIS, SUSTENTA A ATIVIDADE DA CA2+MG2+-ATPase. Lemos, T. * ;
                           **                              *                       **               **
Genestra, M. ; Monteiro, F. ; Leon, L. L. ; Tortelote, G. G. ; Valverde, R. R. H. F. ; Miranda, I. A. ;
Vieyra, A. R. ; Einicker-Lamas, M. ; Imunologia, FIOCRUZ ; Biofísica, UFRJ ; Biofísica CCS , UFRJ
; IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl - G, UFRJ .
Objetivo: A (Ca2+Mg2+)ATPase (PMCA) da membrana basolateral de túbulos proximais
renais (MBL) tem um papel fundamental no ajuste fino das concentrações intracelulares de
Ca2+. Diferentes vias de sinalização celular presentes na MBL apresentam potencial
modulatório sobre a atividade da PMCA, sendo portanto interessante identificar e
caracterizar os efeitos destas diferentes vias de sinalização sobre a bomba. O objetivo deste
trabalho foi o de investigar a presença de uma óxido nítrico sintase (NOS) na MBL e sua
participação em eventos regulatórios na atividade da PMCA.


Métodos e Resultados: Foram utilizadas frações purificadas de MBL obtidas a partir do
córtex de rins de porco. Após separação das proteínas por SDS-PAGE, e transferência para
membranas de nitrocelulose, foram detectadas com a utilização de anticorpos monoclonais
(anti-cNOS e anti-iNOS) a NOS constitutiva e em menor intensidade NOS induzida. Foi feita
a dosagem da atividade da PMCA em situação controle, e na presença de 5 µM de inibidor
de NOS (L-NAME) e com isso verificamos que a atividade basal da PMCA era inibida em 20%
quando a NOS era inibida. Utilizado-se dois doadores de óxido nítrico (NO), o SNAP (400
µM) e o GSNO (500 µM), obtivemos um efeito bifásico da atividade da PMCA sendo as
máximas inibições obtidas 30% e 20%, respectivamente. Também foi verificado que 2 µM
de cGMP inibe em aproximadamente 40% a atividade ATPásica.


Conclusões: Estes resultados mostram que em condições basais, uma NOS presente na
MBL produz quantidades de NO necessárias para a manutenção da atividade da PMCA. Os
dados com cGMP indicam a ação de uma proteína cinase G no sistema, que estaria sendo
ativada pela produção de NO. Experimentos complementares estão sendo feitos na tentativa
de identificar toda a sequência de eventos desta cascata de sinalização.


Apoio Financeiro: FAPERJ , FUJB , PROFIX , PRONEX

Número Final: 20.040

CAVÉOLAS E (CA2++MG2+)ATPASE DE MEMBRANAS BASOLATERAIS
DE CÉLULAS RENAIS TRABALHANDO JUNTAS NA HOMEOSTASIA DO
CA2+ INTRACELULAR. Tortelote, G. G. * ; Valverde, R. R. H. F. ** ; Lemos, T. * ; Guilherme, A.
; Einicker-Lamas, M. ; Vieyra, A. R. ; Biofísica CCS , UFRJ ; IBCCF, UFRJ ; IBCCF - Bl - G, UFRJ .
Objetivo: Cavéolas são microdomínios ricos em proteínas e lipídios envolvidos no processo
de sinalização celular e regulação da concentração de Ca2+ citoplasmático. A
(Ca2++Mg2+)ATPase de membrana plasmática (PMCA) é uma proteína transportadora
responsável pela regulação fina das concentrações de Ca2+ intracelular. Os objetivos desse
trabalho foram investigar a possível co-localização da PMCA e da caveolina-1 (cav-1) em
membrana basolateral (MBL) de túbulos proximais de rins de porco, e avaliar o
comportamento funcional da ATPase a partir da perda da co-localização.
Métodos e Resultados: Frações de MBL foram obtidas a partir de centrifugação diferencial
em gradiente de Percoll. Após solubilização com C12E9 (1% v/v), as membranas foram
submetidas a um gradiente descontínuo de sacarose (5-45%) para extração de cavéolas.
Das 12 frações, a cav-1 foi imunodetectada apenas naquelas de baixa densidade (frações
3-6), empregando-se um anticorpo policlonal (clone N-20). A atividade da PMCA presente
no homogenato inicial (10 nmol Pi mg-1 min-1), localizou-se também exclusivamente
nestas frações do gradiente, a primeira evidência -até onde chega nosso conhecimento- de
compartimentalização em cavéolas da PMCA totalmente ativa. A imunodetecção com o
anticorpo 5f10 contra PMCA confirmou a especificidade e a localização restrita da PMCA
nestas frações. A dissolução das cavéolas com metil- -ciclodextrina 50 mM (quelante de
colesterol), resulta na perda da atividade da PMCA, e no espalhamento desta proteína para
as frações mais densas do gradiente.
Conclusões: A exclusiva localização da PMCA nas cavéolas possibilitaria sua interação
específica com moléculas sinalizadoras que se concentram e compartilham o mesmo
microdomínio e, conseqüentemente, um controle mais preciso da extrusão do Ca2+
intracelular.
Apoio Financeiro: CNPq , PRONEX , PROFIX , CAPES , FAPERJ

Número Final: 20.041

ESFINGOSINA-1 FOSFATO E RECEPTORES EDG3 NA MODULAÇÃO DA
(CA2++MG2+)ATPASE DE MEMBRANA BASOLATERAL DE TÚBULOS
PROXIMAIS RENAIS. Tortelote, G. G. * ; Cabral, L. M. P. * ; Bonilha, T. A. * ; Moreno, P. de A.
M. ; da Silva Pacheco, R. ; Vieyra, A. R. ; Einicker-Lamas, M. ; Biofísica CCS , UFRJ ; IBCCF - Bl -
  *                       *

G, UFRJ ; Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ .
Objetivo: Resultados recentes de nosso laboratório demonstraram a presença de uma
esfingosina cinase (SPK) presente na membrana basolateral de túbulos proximais renais
(MBL), enzima esta responsável pela geração de um importante lipídeo sinalizador, a
esfingosina-1 fosfato (S1P). Dentre as diferentes ações de S1P, é sabido que este lipídeo
sinalizador dispara vias de sinalização celular ativando receptores acoplados a proteínas G
chamados EDG3. Neste trabalho, decidimos investigar a presença dos receptores EDG3 na
MBL, bem como o efeito de S1P sobre a atividade (Ca2++Mg2+)ATPásica.
Métodos e Resultados: O trabalho foi realizado utilizando-se frações purificadas de MBL
de túbulos proximais de rim de porco. Foi demonstrado por Western blotting utilizando-se
anticorpos policlonais que receptores EDG3 encontram-se presentes na MBL. Foram
utilizadas concentrações crescentes de S1P (10 nM; 50 nM; 500 nM e 1 µM). A atividade
controle da (Ca2++Mg2+)ATPase nos experimentos foi de 20,7 1,9 nmol Pi x mg-1 x
min-1 (n=4). Foi demonstrado que a atividade da (Ca2++Mg2+)ATPase era modulada de
maneira bifásica, com ativação progressiva (até 60 %) nas concentrações até 100 nM.
Concentrações maiores (500 nM – 1 µM) levaram a uma forte inibição da atividade ATPásica
(    50%). Vale ressaltar que o substrato da SPK, a esfingosina, quando exógenamente
acrescentada à MBL não provoca nenhum efeito sobre a (Ca2++Mg2+)ATPase, apesar de
ser fosforilada formando S1P.
Conclusões: Estes resultados mostram que a SPK da MBL pode ter um papel importante na
regulação da concentração intracelular de Ca2+ nas células renais uma vez que seu
produto, a S1P, apresenta efeito modulatório sobre a (Ca2++Mg2+)ATPase. A ausência de
efeito de esfingosina exógena e a presença de receptores para S1P (EDG3) sugerem a
existência de um complexo funcional que drenaria esfingosina compartimentalizada na
membrana para SPK funcionalmente acoplada a receptores EDG3 e unidades da
(Ca2++Mg2+)ATPase.
Apoio Financeiro: CNPq , PRONEX , PROFIX , FAPERJ , FUND.JOSÉ BONIFÁCIO , CAPES

Número Final: 20.042

EFEITO DE BLOQUEADORES DE TRANSPORTE NA CONDUTIVIDADE
HIDRÁULICA DA MEMBRANA DE HEMÓCITOS DO MEXILHÃO
MARINHO    PERNA  PERNA          EM     CONDIÇÕES               DE       CHOQUE
HIPEROSMÓTICO AGUDO. Valotta, L. A. ; Malta-Silva, J. F. ; Salomão, L. C. ; Fisiologia,
                                   **                   **

Instituto de Biociências da USP ; Faculdade Ciências Biol. - Exatas e Exp., UNIVERSIDADE
PRESBETERIANA MACKENZIE .
Objetivo: A maioria das células submetidas a choques hiperosmóticos agudos sofre um
rápido murchamento seguido de um lento aumento regulatório de volume (regulatory
volume increase, RVI), resultado do influxo de solutos extracelulares e do influxo acoplado
de água. Neste estudo descrevemos o efeito de alguns bloqueadores de canais iônicos na
condutividade hidráulica da membrana durante o murchamento inicial.
Métodos e Resultados: Hemócitos, obtidos da hemolinfa de P. perna, foram mantidos em
salina (1000mOsm.kgH2O-1). As medidas morfométricas das mudanças relativas de volume
foram realizadas usando um sistema de aquisição e análise de imagens (Image Pro-Lite,
Media Cybernetics). O choque hiperosmótico agudo (1300mOsm.kgH2O-1) resultou em uma
imediata redução no volume celular (19%), seguido de RVI até a linha de base em, no
máximo, 5min (ANOVA, p < 0,05, n > 60). A condutividade hidráulica da membrana na fase
de murchamento inicial foi de 0,0634μm3.μm-2.min-1.atm-1 (n > 60) Hemócitos expostos a
um choque hiperosmótico agudo (1300mOsm.kgH2O-1), na presença de bloqueadores de
canais iônicos [cloreto de tetraetilamônio (TEA), 4-aminopiridina (4AP), cloreto de césio
(CsCl), cloreto de lantânio (LaCl 3), cloreto de cobalto (CoCl2) e cloreto de cádmio (CdCl 2)]
exibiram uma maior redução no volume celular (TEA, 10mM, 33%; 4AP, 1mM, 62%; CsCl,
10mM, 47%; LaCl3, 10mM, 59%; CoCl2, 10mM, 62%; e CdCl 2, 10mM, 59%, ANOVA,
p<0,05, n > 60) como resultado de um aumento na condutividade hidráulica da membrana
(TEA, 1,73 vezes; 4AP, 3,21 vezes; CsCl, 2,38 vezes; LaCl 3, 3,07 vezes; CoCl2, 3,18 vezes;
e CdCl2, 2,97 vezes, ANOVA, p < 0,05, n > 60) e um retardo na RVI.
Conclusões: Esses resultados sugerem a participação de canais iônicos durante a fase de
murchamento que antecede a RVI em hemócitos.
Apoio Financeiro: CAPES , FAPESP

				
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