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									 "VALUTAZIONE QUANTITATIVA DI CHIMERISMO POST-ALLOTRAPIANTO DI
    CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE: ANALISI ESPLORATIVA SULLA
   SENSIBILITA’ DI NUOVI APPROCCI METODOLOGICI E CONFRONTO CON
                     QUELLI ATTUALMENTE IN USO"

Relatore Prof. Berardino Porfirio                                              Candidata: Gerini Chiara

Correlatore: Dott. Andrea Tedde

La valutazione quantitativa del chimerismo post-allotrapianto di midollo osseo (TMO), è utilizzata per il
monitoraggio della fase di attecchimento del trapianto, ma anche per individuare precocemente una eventuale
ripresa di malattia permettendo di rimodulare la terapia (immunosoppressione, infusione linfocitaria, ecc.).
La disponibilità di nuovi polimorfismi genetici come marcatori individuali e di nuove metodiche per il loro
studio, promette di arrivare a stimare in maniera sempre più accurata la percentuale di cellule di origine
genetica del ricevente eventualmente presenti nel torrente circolatorio del paziente dopo TMO (chimerismo
misto), quando ci si aspetta di trovare solo marcatori genetici caratteristici del donatore (chimerismo
completo).
A questo scopo ci siamo innanzitutto proposti di valutare la sensibilità delle due tecniche principali già
introdotte in diagnostica per la determinazione quantitativa di chimerismo, cioè la tecnica dell’elettroforesi
capillare per l’analisi degli STR e quella della Real-Time-PCR con metodo TaqMan per l’analisi dei
polimorfismi INS/DEL. I campioni di DNA appartenenti a una coppia ricevente/donatore utilizzati in un
recente Workshop (Alizadeh et al. 2009) sono stati analizzati con queste due tecniche e i risultati sono stati
confrontati con quelli ottenuti dai 29 diversi laboratori europei che hanno partecipato.
I risultati ottenuti mostrano che la tecnica dell’elettroforesi capillare per l’analisi degli STR è in grado di
rilevare una popolazione cellulare minoritaria presente intorno all’1%. Anche se sistematicamente sovrastimati
rispetto ai valori reali, è stato evidenziato che essi sono in linea con quelli riscontrati dagli altri 21 laboratori
partecipanti al Workshop con questa metodica, anzi i nostri valori mostrano tendenzialmente una maggiore
accuratezza. I risultati ottenuti con la tecnica della Real-Time-PCR con metodo TaqMan ne confermano
l’elevata sensibilità attesa che arriva a rivelare 0,05% di DNA del ricevente (la diluizione più spinta presa in
esame). Inoltre c’è da notare una buona linearità della curva, associata però ad una leggera e sistematica
sottostima della percentuale di DNA del ricevente rispetto ai valori reali. I valori forniti dagli 8 laboratori
partecipanti al Workshop con Real-Time-PCR “in-house” mostrano invece una sovrastima e comunque
risultano essere meno accurati rispetto a quelli da noi ottenuti con un “kit”.
Per la prima volta, sono state infine saggiate le potenzialità della tecnica High Resolution Melting Analysis
(HRMA) nella determinazione dell’entità di chimerismo misto. E’ stato messo a punto un metodo originale
articolato nelle seguenti fasi: 1) è stato creato un pannello di 9 polimorfismi INS/DEL, tutti generanti curve
di melting genotipo-specifiche; 2) usando campioni contenenti miscugli in diversa percentuale di specie
molecolari opposte (omozigoti INS/INS e DEL/DEL), con l’applicazione “Difference Graph” del software
Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) sono state generati gli standard di ciascun polimorfismo del pannello.
Già dall’analisi delle curve standard si osserva una sensibilità che non si spinge al di sotto del 3%. Dall’analisi
dei campioni del Workshop con HRMA abbiamo ottenuto dei valori che sono stati confrontati mediante
interpolazione lineare con quelli delle curve standard. Anche in questo caso si riescono a stimare percentuali
di ricevente fino al 2-3%.
Questi risultati suggeriscono che ancora oggi la tecnica dell’elettroforesi capillare che usa gli STR come
marcatori genetici, risulta essere il goldstandard per questa determinazione: infatti, pur avendo una sensibilità
inferiore alla Real-Time-PCR, è una tecnica molto meno costosa, laboriosa e richiede tempi minori per
l’analisi di più campioni contemporaneamente.
La Real-Time-PCR pur mostrando una sensibilità e un’accuratezza superiore, rispetto alle altre tecniche,
rimane meno adatta alla diagnostica di routine in quanto più costosa e dispendiosa anche dal punto di vista
del tempo necessario e della praticità nell’esecuzione.
L’HRMA è una tecnica relativamente recente che mostra velocità di esecuzione e di analisi associata a costi
ridotti, ma non sembrerebbe possedere i requisiti di sensibilità e accuratezza presenti nelle altre due tecniche.

								
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