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					      Diversité et étude des
  métabolismes microbiens de
l’arsenic d’un ancien site minier,
   Sainte Marie aux Mines (68)
Laboratoire Interaction Ecotoxicologie Biodiversité Ecosystèmes
                        LIEBE UMR 7146

   GDR 2909: Métabolisme de l’arsenic chez les Procaryotes




       Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010
                       Toxicité de l’arsenic
2 formes solubles prédominantes: As (III) ou arsénite et As (V) ou arséniate

            As III                As V            As V


                                     Pst
               Aqp                          Pit



                     SH         Phosphorylation




          As (III) + soluble, + mobile, et plus toxique que l’As (V)
      Les métabolismes bactériens influencent le
              statut Redox de l’arsenic
 Métabolismes énergétiques

       - Réduction dissimilatrice: As (V)= accepteur final d’e- en anaérobie
        gènes arr

       - Oxydation de l’arsenic: As (III) donneur d’e-  gènes aox/ aro/ aso


 Métabolismes de résistance et de tolérance

       - Méthylation de l’arsenic: production d’espèces généralement
       moins toxiques dont certaines volatiles  gènes ars M

       - Oxydation de l’arsenic: As (III) est oxydé en As (V)  gènes aox

       - Réduction expulsion: As(V) réduit en As (III) (gène ars C) puis
       sortie de l’As (III) par une pompe spécifique (ars B et analogues)
          Métabolismes de détoxification

Réduction / expulsion                      Oxydation

                     As III       As III                As V
As V


    Pit




As V
            As III




                        As III
                                 Illustrations: Silver et Phung,2005
    But de l’étude: Comprendre le rôle des
microorganismes dans la spéciation de l’arsenic
       en milieu faiblement contaminé.


Etude de la diversité des microorganismes capables de
métaboliser l’arsenic sur le site de Sainte Marie aux Mines
qui présente des conditions moins extrêmes que des sites
précédemment étudiés comme Carnoulès.


Hypothèse: diversité taxonomique et fonctionnelle plus
élevée.
        Site d’étude: Sainte Marie aux Mines, 68.




 pH 6,9 / Carnoulès pH ≤ 3
 Concentration en arsenic dans l’eau 6 – 23 µg/L / Carnoulès 350 mg/L
 Concentration dans le sédiment 320 - 737 mg/kg
 Concentration moyenne fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg)
 Contamination en Aluminium (15150 mg/kg) et en Fer (23745 mg/kg)
                  Démarche expérimentale


                  Prélèvement du sédiment



Isolement souches cultivables         Extraction ADN total
Etude de la diversité taxonomique bactérienne par amplification
                  PCR de l’ADNr 16S bactérien

                                    Etude de la diversité
                                    archéale par amplification de
                                    l’ADN r 16S archée

   Etude de la diversité fonctionnelle par amplification gènes
                       aox et transporteurs
           Résultats: Diversité taxonomique




 Diversité bactérienne des isolats cultivable


 Diversité bactérienne totale


 Diversité archéale
                                                  Proportion des phyla obtenus par clonage / séquençage (246 clones)
                                             isolats cultivables
                   Diversité bactérienne des 1%
                           11%             1%
                                                                           1%
                                                                                             1%
                                                             27%         2%                                                       Firmicutes
                                                                                       3%
                    27%                                             6%                                8%
                                                                                                       Firmicutes33%              Actinobacteria
                                                                                                                                   Firmicutes
                                                              1%         39%                           Actinobacteria              Actinobacteria
                                                                                                                                  Bacteroidetes
                                                                                  Firmicutes
                                                                                           Alphaproteobacteria                    Bacteroidetes
                                                        5%                                 Betaproteobacteria
                                                                                                                                  Alphaproteobact
                                                                                                                                   Alphaproteobac
                                                                                  Actinobacteria
                                                                                                       Gammaproteobacteria        Betaproteobacte
                                                                                                                                   Betaproteobacte
                                                   < 1%        4%                 Alphaproteobacteria  12%                        Gammaproteob
                                                                                           Bacteroidetes
                                                                                                                                  Gammaproteoba
                                                             4%                   Betaproteobacteria
Proportion des phyla obtenus par clonage / séquençage (246 clones)        15%        Deltaproteobacte
                 53%                                             Gammaproteobacteria
                                                                 6%
                                                                                            6%
                         1% 4%                                                                                                    Epsilonproteoba
                                                                                  Bacteroidetes
                     1%          212 isolats                                                                                      TM7
                      4%
                                      1%         17%                                             2%                          Acidobacteria
                   2%                                                                                   9%   Proportion des phyla obtenus pa
                                                                     Firmicutes                                                       1%
                                3%                                                                                                Deinococcus-Th
              6%                            8%                       Actinobacteria                                     9%          1%
                                                                      Firmicutes
                                                       33%                                                                        Nitrospira
         1%        39%                                                Actinobacteria
                                                                     Bacteroidetes                                                2%
                                                                                                                                           3%
                                                                     Bacteroidetes                                           6%   Cyanobacteria
    5%                                                               Alphaproteobacteria
                                                                      Alphaproteobacteria                               1%
                                                 <1%                                                                              Planctomycetes
                                                                     Betaproteobacteria
                                                                      Betaproteobacteria                           5%
< 1%                                                    12%          Gammaproteobacteria                                          Verrucomicrobia
                                                  1%                 Gammaproteobacteria                     < 1%
                                                                                                                                  Gemmatimonad
                                                 15%                 Deltaproteobacteria
                           6%                                                                                15%                  Bactéries non dé
                                     6%                      12%                   89%
                                                                     Epsilonproteobacteria
                         157 isolats aérobies                                  55 isolats anaérobies
        Diversité bactérienne totale (248 clones séquencés)
                        1%
         Proportion des phyla obtenus par clonage / séquençage (246 clones)
                           2%        1%                                   Firmicutes
                                          3%
                                 1%
                      6%                            8%                    Actinobacteria
                                2%                                         Firmicutes
               1%                              3%                         Bacteroidetes
                           6%                        8%                     Actinobacteria
          5%                                                              Alphaproteobacteria
                     1%                                                     Bacteroidetes
                                                                          Betaproteobacteria
                                                                           Alphaproteobacteria
    < 1%       5%
                                                                 12%
          < 1%
                                                                          Gammaproteobacteria
                                                                           Betaproteobacteria
                                                                  12%
                                                                           Gammaproteobacteria
                                                                          Deltaproteobacteria
                                                                            Deltaproteobacteria
                                                                          Epsilonproteobacteria
                                                                            Epsilonproteobacteria
                                                                          TM7
                                                                           TM7
  17%   17%                                                               Acidobacteria
                                                                           Acidobacteria
                                                                     9%    Deinococcus-Thermus
                                                                          Deinococcus-Thermus
                                                                   9%
                                                                            Nitrospira
                                                                          Nitrospira
                                                                            Cyanobacteria
                                                                          Cyanobacteria
                                                                           Planctomycetes
        <1%
  <1%                                                                     Planctomycetes
                                                                            Verrucomicrobia
         1%
                                                                           Gemmatimonadetes
                                                                          Verrucomicrobia
    1%               12%
                                                           15%              Bactéries non déterminées
                                                                          Gemmatimonadetes
                                          7%              15%             Bactéries non déterminées
               12%

Carnoulès dominance des Betaproteobactéries (38%) et
                      7%
Gammaproteobactéries ( 23%) et Acidobactéries seulement 3%
(Thèse Giloteaux, 2009)
                         Diversité archéale (83 clones séquencés)
                                          obtenus par clonage séquençage (83 clones)
             Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage // séquençage (83 clones)


          23%



                                                      Thermoprotei
                                                      Diversité significative d’Archées
                                                      Non déterminé
    1%                                                Methanobacteria
                                                     Methanomicrobia
                                             55%      A Carnoulès uniquement
                                                     Thermococci
nus par clonage // séquençage (83 clones)
 us par clonage séquençage (83 clones)
    12%
                                                     Euryarchaeota amplifiés à partir
                                                     d’échantillons d’eau (Bruneel et al.,
                                                     Non déterminé

          4%                                         2008)
                5%

         Thermoprotei           Crenarchaeota
         Non déterminé          60%
         Methanobacteria
         Methanomicrobia        Euryarchaeota
%
         Thermococci            40%
         Non déterminé
               Résultats: Diversité fonctionnelle


 Répartition des gènes fonctionnels chez les isolats


       Gènes de transporteurs + gènes aox




 Diversité totale des gènes aox


       Alignement des séquences des souches cultivables + clones
      Répartition des gènes fonctionnels dans les isolats
                           Transporteurs d’arsénite                                                            Oxydation

                                                                                           acr3(1)
                                        0%            arsb
                                                                                                                                acr3(2)
           0%                                                                0%                                       5%
      3%        12%               17%                                              9%                          14%         9%

                      5%                                                                  9%
                                                         32%
                                             Fimicutes            37%              Fimicutes
                           7%                                                                                                     14%
                                                                                                                           Fimicutes
                                             Actinobacteria                        Actinobacteria
                                             Alphaproteobacteria                   Alphaproteobacteria
                                                                                                                           Actinobacteria
                                             Betaproteobacteria                    Betaproteobacteria                      Alphaproteobacteria
                                                                                              18%
                                             Gammaproteobacteria                   Gammaproteobacteria                     Betaproteobacteria
                                                                                                                                  9%
                                             Bacteroidetes                         Bacteroidetes                           Gammaproteobacte
                                                         7%                                                                Bacteroidetes
                                40%                                                                      49%
73%
                                                   4%
                                                                             27%

 arsB- 59 isolats               acr3(1)- 75 isolats                     acr3(2)- 11 isolats                    aox- 22 isolats

Firmicutes
                                                                    Analyse croisée
Actinobacteria
Alphaproteobacteria                              Aucun gène de résistance: 38
Betaproteobacteria                               1 gène de résistance: 100
Gammaproteobacteria
                                                 2 gènes de résistance: 26
Bacteroidetes
                                                 3 gènes de résistance: 7
                                                 A déterminer: 41
                                                                        Diversité des gènes aox




                                                 Betaproteobactéries
                                                 Betaproteobactéries
                                                  Betaproteobactéries
                                                  Betaproteobactéries
                                                                         Pas de gène aox affilié aux
                                                                        archées
                                                                         Pas d’aox affiliés aux
                                                                        Gammaproteobactéries
                                                                        amplifiés à partir du sédiment




                  Gammaproteobactéries
                  Gammaproteobactéries
                  Gammaproteobactéries
                                                                         Présence de clones sans
                                                                        représentants cultivables
                                                                        associés

   Chloroflexis
Chloroflexi

                     Archaea
                                                                         Présence chez Gram + et
                                                                        Flavobactéries
                                         Alphaproteobactéries




                                                                        Possibilité de transferts
                                                                        horizontaux (souches
                                                                        soulignées)
                    Conclusion et perspectives

 Mise en évidence dans le milieu d’organismes capables de réduire/
oxyder l’arsenic.


 Recherche des gènes arr (respiration) et ars M (méthylation)


 Réalisation de microcosmes abiotiques ou avec un inoculum
bactérien contrôlé ou naturel sous différentes conditions :
-Différentes phase minérale
- pH
- Statuts redox
- As (III)/As (V)
- Donneur/ Accepteur d’e-
     Suivi de l’expression des gènes fonctionnels et de la
    spéciation de l’arsenic
Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010
           Physicochimie du site: (eau et sédiments)

                    Water     Sediments
pH                   6.9          -
Density (Kg/l)         -         2.07       pH (6,9) proche de la
Moisture 20° (%)       -         18        neutralité (diffère par rapport aux
Moisture 105° (%)      -         19.3      autres sites d’études)
Fraction <2mn (%)      -         57.8
                                            Concentration en arsenic
Fraction >2mn (%)      -         42.2
                                           faible dans l’eau (6 µg/L) et
OM on <2mn (%)         -          2
                                           modérée dans sédiment (320
P total                -         0.08
                                           mg/kg) mais plus élevée que la
Al                  98 µg/l   15150 µg/g
                                           concentration moyenne
As                  6 µg/l     320 µg/g
                                           provenant du fond géochimique
Cd                   ND        0.3 µg/g
                                           dans les Vosges (48 mg/kg).
Cr                   ND        40 µg/g
Cu                  1 µg/l     103 µg/g     Contamination en Aluminium
Fe                   ND       23745 µg/g   et en Fer non négligeable dans
Mn                   ND        510 µg/g    sédiments.
Ni                   ND        23 µg/g
Pb                   ND        49 µg/g
Zn                  2 µg/l     88 µg/g
      Résultat de diversité des gènes de transport d’arsénite
 Pas de gènes d’Archées amplifiés alors que séquences utilisées pour dessin des
amorces.

        ars B                          acr3(1)                        acr3(2)
 Séquences ars B           Divisé en deux clusters:            2 clusters: le premier
clonées et isolats           Premier cluster: Actinobactéries associé aux
phylogénétiquement          (clones et isolats) et             Proteobactéries et le
proche des arsB des         Gemmatimonadetes (clones).         second associé aux
Gammaproteobactéries                                           Verrucomicrobia (clones).
                             Second cluster: Bacteroidetes
                            (isolats), Verrucomicrobia          Transporteur
 Mise en évidence par
                            (clones), Chloroflexi-             généralement trouvés
clonage de nouveaux
groupes sans                Deltaproteobacteries (clones) , et chez Alpha- et
                            Gammaproteobactéries.              Betaproteobactéries mais
représentants cultivables
                             Nombreux clones proches des possibilité de transferts
 Phylogénie non            Chloroflexi- Deltaproteobacteries horizontaux chez
respectée nombreux          mais sans représentants            Gammaproteobactéries,
transferts horizontaux      cultivables connus associés.       Actinobactéries et
suspectés.                                                     Firmicutes.
                             Même si phylogénie
                            respectée par rapport au 16S
                            cas de transferts horizontaux
                       Diversité des gènes arsB
                         Séquences ars B clonées
                        proviennent des mêmes
                        groupes que les isolats
                        porteurs de arsB
                        phylogénétiquement proche
                        des arsB des
                        Gammaproteobactéries
                         Mise en évidence de
                        nouveaux groupes sans
                        représentants cultivables par
                        clonage
                         Phylogénie non
                        respectée nombreux
                        transferts horizontaux
                        suspectés.
Firmicutes
Actinobactéries
                        Pas de gènes d’Archées
Alphaproteobactéries    amplifiées alors que
Betaproteobactéries
Gammaproteobactéries    séquences utilisées pour
Bacteroidetes           dessin des amorces.
                   Diversité des gènes acr3(1) (1/2)




Actinobactéries
                                                            Firmicutes
                                                            Actinobactéries
                                                            Alphaproteobactéries
                                                            Betaproteobactéries
                                                            Gammaproteobactéries
                                                            Bacteroidetes


  Divisé en deux clusters: ici est représenté le premier qui comprend les
 Actinobactéries et les Gemmatimonadetes (clones).
  Transferts horizontaux à des Gammaproteobactéries,
 Betaproteobactéries et Flavobactéries.
                       Diversité des gènes acr3(1) (2/2)
                  Bacteroidetes                                                              Second cluster,
                                                                                            comprenant les
Verrucomicrobia
                                                                                            Bacteroidetes,
                                                                                            Verrucomicrobia (clones),
                                                                                            Chloroflexi-
                                                                                            Deltaproteobacteries




                                  Cloroflexi- Deltaproteobactéries
                                                                                            (clones) , et
                                                                                            Gammaproteobactéries.
                                                                                             Nombreux clones
                                                                                            proches des Chloroflexi-
                                                                                            Deltaproteobacteries mais
                                                                                            sans représentants
                                                                                            cultivables connus
                                                                                            associés.
                                                                                             Cas de transferts
                                                                                            horizontaux



                                                                     Gammaproteobactéries
                                                                                            Phylogénie conservée
                                                                                            par rapport au 16S.
       Firmicutes
       Actinobactéries
       Alphaproteobactéries
                                                                                            Pas de gènes d’Archées
       Betaproteobactéries                                                                  amplifiées alors que
       Gammaproteobactéries
       Bacteroidetes
                                                                                            séquences utilisées pour
                                                                                            dessin des amorces.
                  Diversité des gènes acr3(2)

                   2 clusters: le premier composé
                  des acr3(2) associés aux
                  Proteobactéries et le second
                  associé aux Verrucomicrobia
                  (clones).
                   Transporteur généralement
                  trouvés chez Alpha- et
Proteobactéries   Betaproteobactéries mais
                  possibilité de transferts
                  horizontaux chez
                  Gammaproteobactéries,
                  Actinobactéries et Firmicutes.
                  Pas de gènes d’Archées
                  amplifiées alors que séquences
                  utilisées pour dessin des amorces.


                               Firmicutes
Verrucomicrobia                Actinobactéries
                               Alphaproteobactéries
                               Betaproteobactéries
                               Gammaproteobactéries
                               Bacteroidetes

				
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