flow cytometry by 0Ccf04c

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									            流式细胞仪



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  流式细胞仪就是进行流式细
 胞分析的仪器,它集电子技术、
 计算机技术、激光技术、流体理
 论于一体,是一种非常先进的检
 测仪器。


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流式细胞仪的特点
单个细胞分析
同时多参数分析
速度快:10000个细胞/秒
统计学意义:提供细胞群体的均值和
 分布情况
分选感兴趣的细胞
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      •流式细胞仪的原理
      •流式细胞仪的应用
      •流式细胞仪的数据处理


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        流式细胞仪的
         工作原理

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             工作原理
      流式细胞术(Flow Cytometry, 简称
       FCM,又名FACS)是一种可以快速、准
       确、客观,并且同时检测单个微粒(通
       常是细胞)的多项特性的技术,同时可
       以对特定群体加以分选
      研究对象为生物颗粒,如各种细胞、染
       色体、微生物、及人工合成微球等
      研究的微粒特性包括多种物理及生物学
       特征,并加以定量
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   流式细胞仪仪器结构
液流系统
光学系统
            激光光源
            光收集系统
电子系统
            光电转换
            数据处理系统


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                         Injector
                            Tip     Sheath
                                     fluid




Fluorescence
       signals

  Focused laser
         beam



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         细胞被戴上特殊的标记。所用的标记细
        胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性
        蛋白(抗原)结合的抗体,而这种抗体又能
        够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带
        上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波
        振荡器时,极稀的细胞悬浮液形成很小的
        液滴,一个液滴中只含有一个细胞。液滴
        一旦形成并通过激光束时,激光束激发结
        合在细胞表面抗体分子。


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荧光染料及其发射波长

• FITC       525nm
• PE         575nm
• PI         630nm

• 自发荧光与特异荧光


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抗体的选择

• 首选直接标记抗体
• 荧光分子 PE最强,适用于弱表达抗原
            FITC最便宜,适用于强表达抗原
• 间接标记:一般不提倡用




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实验对照的设计

• 空白对照:ALL
• 阴性对照:常用同型抗体对照
  单色分析:设同型抗体对照
  多色分析:同型对照,单阳性对照(用于仪器校
   正)

• 阳性对照:检测阴性时

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实验标本的处理

• 单细胞悬液的制备:胰酶消化
• 抗体或标记分子的染色:抗原抗体反应
• 非特异结合的去除:洗涤和封闭
                封闭:血清和同型抗体




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流式细胞仪的样品要求

单细胞悬液

被检细胞或颗粒大小0.2-80um

样品中至少20000个细胞,浓度105-107
个/毫升


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            流式细胞仪的光学系统
      激光 (Laser)是一种相干光源,它能提
       供单一波长、单一方向、同步的稳定光照
      激光波长: 台式机为固定波长488nm,
       635nm ,大型机波长谱线宽包括 325,
       457.9,488, 514.5,520.8,530.9,
       568.3, 633,647 nm and紫外光UV。
      光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小
       孔组成,将产生的光信号引导至检测器


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            Forward Angle Light Scatter



Laser

                                      FALS Sensor




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             90 Degree Light Scatter

Laser

                                       FALS Sensor




                       90LS Sensor


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            Dichroic Filter/Mirror




                              Filter placed at 45o
 Light Source                                    Transmitted Light




                         Reflected light
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            Fluorescence Detectors

Laser

                                                       FALS Sensor




                                            Freq
                                                   Fluorescence

                   Fluorescence detector
                     (PMT3, PMT4 etc.)
                    Purdue University Cytometry Laboratories
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      流式细胞仪的光学系统




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     流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过
    聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,
    被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生
    散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向
    光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
    光散射信号在前向小角度进行检测,这种信
    号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号
    的接受方向与激光束垂直,经过一系列双色
    性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不
    同波长的荧光信号。

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1 流式细胞仪的散射光信号

• FSC:表示细胞大小


• SSC:表示细胞内颗粒的复杂程度




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外周全血细胞散射光双参数点图
(红细胞溶解后)




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   2,荧光信号
        荧光素吸收激光能量
        荧光素将吸收能量释放,转换为
             振动能和热能
             释放较入射光波长更长的光量子
        荧光素与特异抗体结合
        荧光抗体与细胞抗原结合越多,产生的
            荧光信号越强


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 流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析
当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
 受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物
 质的荧光信号
荧光信号由光电接收器接收,转变为电信号,
 可分析电压脉冲的高度、面积和宽度
电脉冲信号经A/D转换成数字信号
数字信号传送到计算机,进行储存、 作图、 统
 计分析

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               细胞分选的原理
               当含细胞的液滴逐个通过激光束时,
            受到两种检测器的检测:如果液滴中含有
            细胞就会激活干涉检测器(interference
            detector),只有带有荧光标记细胞的液滴
            才会激活荧光检测器(fluorescence
            detector)。当带有荧光标记的液滴通过激
            光束时,将两种检测器同时激活,引起液
            滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴
            带有负电荷,移动时就会向正极移动,进
            入到荧光标记细胞收集器中。。
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流式细胞仪
分选系统
                       488 nm laser             FALS Sensor


                                        Fluorescence detector



            Charged Plates    -             +


     Single cells sorted
     into test tubes

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            流式细胞
            仪的应用

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流式细胞仪的科研应用

• 细胞表型分析
• 胞内细胞因子的检测
• 染色体分类研究
• 细胞周期和DNA倍体分析
• 流式标准小球定量
• 分选
• 细胞内钙离子测量
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How to analyze soluble proteins in FCM?

            Capture antibody           Capture beads
    Beads



            +

                                       +


                 Antigen (cytokines)       Fluorescence Detector
                                           antibody
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                     Multiplexed Beads
                            Various analytes




                                               Antibody coupled PE label,
Antibody coupled                               emitting at FL2 intensity
beads, emitting at                             proportional to analyte
distinct FL3                                   conc.
intensities




                     Shades of a color



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   Beads Provide a Flexible Platform
            Beads provide an expandable assay platform for
                      use with a flow cytometer




    Multiple                Different       Different colors with
     sizes                 intensities      different intensities
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               Example 6-bead assay
IL-8


IL-1b


IL-6               Detector Antibodies
                                             Wash

IL-10                                      Analyze on
                                         flow cytometer
TNF


IL-12
                 Lysate or Supernatant
                        Sample
 Capture Beads
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            CBA Standard curves




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流式细胞术的临床应用

• 白血病免疫分型
• HLA-B27: 强直性脊柱炎
• 淋巴细胞亚群
• 造血干细胞计数:造血干细胞移植
• 网织红细胞
• PNH诊断(CD55、CD59)
• 血小板活化试验
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            流式细胞仪
            的数据处理

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            数据处理
    检测数据的显示视测量参数的不同
   由多种形式可供选择。单参数数据以
   直方图的形式表达,其X轴为测量强
   度,Y轴为细胞数目。对于双参数或
   多参数数据,既可以单独显示每个参
   数的直方图,也可以选择二维的三点
   图、等高线图、灰度图或三维立体视
   图。

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流式细胞仪数据分析(1)
   直方图分析




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流式细胞仪数据分析(2)
  点图分析




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流式细胞仪数据分析(3)
  等高图和密度图分析




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Gating




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            Compensation




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            compensation




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                          A typical DNA Histogram
                          of cell proliferation
                           G0-G1       G2-M
                                   S
            # of Events




                          Fluorescence Intensity
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细胞凋亡检测技术

1 几个概念



2 技术和方法




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            1 荧光信号的面积:对荧光光通量
            进行积分

            2 DNA指数(DI):相对DNA含量

            3异倍体:非二倍体,包括近二倍
            体,四倍体,多倍体,非整倍体

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凋亡细胞的特点
• 在形态上,早期细胞核固缩,染色体边集
  在核膜内侧显新月体形、核碎裂;细胞浆
  和细胞器密度增高、细胞体积变小;细胞
  膜皱折卷曲,但早期细胞膜的完整性未受
  到破坏
• 凋亡细胞的FSC降低,SSC增加。
• 细胞坏死时,细胞肿胀,
• FSC增大,SSC也增大
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      Annexin V/PI双染
      活细胞为(Annexin V-/PI-)
       坏死细胞为(Annexin V+/PI+)
       凋亡细胞(Annexin V+/PI-)




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      细胞周期
      不能区分凋亡与死亡细胞
      Sub-G0/G1 peaks --- PI staining




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      Annexin V Assay
      建议用于悬浮细胞




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            Annexin V Assay
            能够区分死亡与凋亡




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•谢谢大家!



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