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									        ELETTROFORESI CAPILLARE


L’elettroforesi capillare (CE) consiste in una
famiglia di tecniche di separazione che
utilizzano dei capillari in silice fusa per
separare sistemi complessi di molecole grandi
e piccole.
In CE vengono utilizzati alti voltaggi e la
separazione è funzione della carica e delle
dimensioni molecolari.
In dipendenza del tipo di capillare e del
mezzo solvente, l’elettroforesi capillare
può articolarsi in più tipi di tecniche.
Effettuare l’elettroforesi in un capillare di
piccolo diametro permette di utilizzare
campi elettrici molto elevati poiché i
capillari dissipano efficacemente il calore
prodotto. Aumentare il campo elettrico
significa avere separazioni molto
efficienti e ridurre i tempi di separazione.
I capillari hanno generalmente un diametro interno di 50 µm
ed una lunghezza di 0.5 ÷ 1 m. Il potenziale applicato va da
20 a 30 kV.
A causa del flusso elettroosmotico, tutti i componenti del
campione migrano verso l’elettrodo negativo. La quantità di
campione iniettata nel capillare è molto piccola: 10 nL.


I capillari possono anche essere riempiti di un gel che elimina
il flusso elettroosmotico. In questo caso la separazione
avviene come una elettroforesi convenzionale, ma la
risoluzione è più alta, la sensibilità è maggiore e si può
utilizzare un rivelatore posto in serie al capillare.
           Il flusso elettroosmotico
La superficie del capillare di silice contiene gruppi
funzionali carichi negativamente che attraggono
ioni positivi. Gli ioni positivi migrano verso
l’elettrodo negativo e trascinano con sé anche
molecole di solvente. Questo flusso di solvente
viene chiamato effetto elettroosmotico. Durante la
separazione, molecole non cariche si muovono alla
stessa velocità del flusso elettroosmotico (con
scarsa separazione). Gli ioni positivi si muovono
più velocemente e quelli negativi più lentamente.
ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL (CGE)
La separazione si ottiene usando un capillare
riempito con una matrice gel, p.es.
poliacrilammide reticolata o agarosio; questo
permette di separare soluti che hanno un
rapporto carica/massa simile, ma diverse
dimensioni. Per questo motivo questa
tecnica è molto utilizzata per separare
macromolecole biologiche.
                LA SPETTROMETRIA DI MASSA
La spettrometria di massa consiste nello studio in fase gassosa di
molecole elettricamente cariche a fini analitici come p.es,:
• Determinazione del peso molecolare
•Caratterizzazione strutturale
•Reattività in fase gassosa
•Analisi qualitativa e quantitativa di componenti di miscele
La spettrometria di massa consiste nel separare gli ioni in fase
gassosa e la separazione avviene per effetto di campi magnetici o
elettrici ed è funzione del rapporto massa/carica (m/z). Le masse
sono relative a quelle dell’isotopo 12C, il cui peso atomico è
definito = 12. La massa reale del 12C è 12 daltons, dove un dalton
è uguale a 1.661 10-24 g.
Per produrre la carica in molecole neutre si possono
utilizzare diverse tecniche. Uno dei criteri per
scegliere quale utilizzare è quello della termolabilità.
Campioni termostabili, e relativamente volatili,
possono essere ionizzati mediante impatto
elettronico  che     pero’    produce      spesso
frammentazione del campione con perdita del picco
molecolare.
Campioni termolabili (in genere biopolimeri)
necessitano di tecniche di ionizzazione “morbida”
fra le quali vi sono l’Electrospray (ESI) ed il
desorbimento laser assistito da matrice (Matrix
Assisted Laser Desorption Ionisation, MALDI).
                                Electrospray
Questa tecnica utilizza un campione liquido che viene nebulizzato e
sottoposto ad un shock elettrico attraverso una forte potenziale elettrico.
Il processo produce delle goccioline con forte carica elettrica; queste
perdono delle molecole cariche durante il percorso attraverso i campi
elettrici e/o magnetici e queste molecole vengono poi rivelate misurando
il rapporto massa/carica (m/z). La tecnica produce spesso molecole con
più di una carica. Si può lavorare sia con ioni positivi (spesso molecole
associate a protoni o cationi monovalenti) o con ioni negativi (spesso
molecole deprotonate). Generalmente non si ha frammentazione.
Vantaggi dell’ESI:
- la ionizzazione “morbida” produce molecole intatte.
- La produzione di specie con carica multipla permette di analizzare
pesi molecolari elevati.
- ESI lavora a pressione ambiente e quindi può essere interfacciata con
elettroforesi capillare o cromatografia ad alta pressione.
Principio della ionizzazione ESI
Geometria di uno strumento ESI
                  Esempio
la mioglobina a diversi gradi di protonazione
               Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI):

Introdotta nel 1988, i campioni sono co-cristallizzati con una sostanza che
assorbe fotoni nella zona dell’UV (la matrice, p.es. per le proteine si
utilizza acido sinapinico ed un laser a 337 nm). Il laser porta il sistema ad
uno stato ad energia alta dal quale si desorbono le molecole da
analizzare. Non si produce frammentazione e si producono specie con
una sola carica.
Considerazioni pratiche:
-Il rapporto campione/ matrice è 1/5000.
-la concentrazione finale di campione è 10 pmol/l




                         acido 3,5-dimetossi-4-idrossi cinnamico
Esempio di spettro di massa MALDI per
una miscela di proteine

								
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