GU rich da Cleavage stimulation factor FC stF Produzione del 3 terminale di mRNA eucariotici La sequenza AUAAA � riconosciuta da CPSF by 027Jt0

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									                      Lez 7
• Processamento dell’RNA negli eucaroti:
  RNA splicing




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_transcription.html
    Fattori per la maturazione e
     processamento del RNA
• La CTD fosforilata recluta gli enzimi per il
  capping e per lo splicing
• Il capping viene effettuato subito dopo la
  sua sintesi
               RNA factory

• Gli enzimi per il
  processamento del
  DNA sono portati
  dalla coda CTD
  della RNA Pol II.
RNA capping
                         Fosfatasi



                          Guanil transferasi




                       Metil transferasi

Tre enzimi:
• Fosfatasi
• Guanil transferasi
• Metil transferasi
3’ terminale di mRNA eucariotici




Sequenze consenso
• AAUAAA è riconosciuta da cleavage and
   polyadenylation specific factor (CPSF)
• La regione GU-rich da Cleavage stimulation
   factor F (CstF)
Produzione del 3’ terminale
   di mRNA eucariotici



• La sequenza AUAAA
  è riconosciuta da
  CPSF, la GU-rich da
  CstF, poi reclutano
  altri fattori che
  tagliano il DNA e
  viene reclutata poli-A-
  polimerasi (PAP)
Lo splicing
           RNA Processing




Esoni introni: esempi di due geni umani
Esempi di splicing alternativo
Sequenze consenso per gli introni
          Consensus sequence




• Un’alte conservazione si trova solo
  immediatamente all’interno degli introni alle
  giunzioni presunte. Questo identifica la sequenze
  di un introne generico come la regola :
  GU##AG: o GT-AG.
• I due siti hanno sequenze diverse e definiscono le
  terminazione degli introni direzionalmente .
   Che meccanismo fa in modo che i due siti sono tagliati insieme?

Tutti i site 5e 3sites
  sono funzionalmente
  equivalenti, ma lo
  splicing segue delle
  regole che
  assicurano che il
  sito 5è sempre
  collegato al sito 3
  che viene dopo nel
  RNA.
      Il meccanismo dello splicing


Attacco del 2’OH al 5’
  splicing site con
  formazione del
  cappio
Attacco del 3’OH
  libero al 3’ splicing
  site
Liberazione del cappio
      Meccanismo dello splicing
La giunzione a tre vie
  del cappio
• Il branch site nei lieviti è
   conservato ed la sequenza
   consenso è UACUAAC..
• Il branch site si trova 18-40
   nucleotidi a monte del 3 splice
   site.
• gli eucarioti superiori hanno
   sequenze correlate (cryptic sites)
• Il ruolo del the branch site è di
   identificare il 3’ più vicino come
   bersaglio per collegarlo al 5 
   splice site
transesterificazione
• Il primo passaggio è un attacco
   nucleofilo dal 2 –OH della A
   invariante del UACUAAC
• Nel secondo passaggio, il 3–OH
   libero dell’esone attacca il legame
   al 3splice site.
        caratteristiche
• Gli Splice sites sono generici: non
  hanno specificità per gli RNA
  individuali,
• L’apparato dello splicing non è
  tessuto specifico;
• Lo splicing avviene solo tra siti 5’ e
  3’ dello stesso introne.
• Lo splicing segue un cammino
  preferito.
• la reazione non procede
  sequenzialmente lungo il precursore.
       spliceosoma
Il complesso si assembla
    sequenzialmente sul pre-mRNA,
    e lo splicing avviene solo dopo che
    tutti i componenti si sono
    assemblati
Il nucleo e il citoplasma contengono
    molti piccoli RNA (200-300 bp)
Quelli nel nucleo sono chiamati small
    nuclear RNAs (snRNA); e quelli
    nel citoplasma small cytoplasmic
    RNAs (scRNA).                         Le snRNPs coinvolte nello splicing
                                          sono U1, U2, U5, U4 e U6. Ogni
 lo spliceosome include un 50-60S         snRNP contiene un solo snRNA e
    ribonucleoprotein particle (più       alcune (<20) proteine. Un nucleo
    grande di quella del ribosoma),       strutturale comune per ogni snRNP
    con 150 proteine                      consiste in un gruppo di 8
                                          proteine, tutte riconosciute da un
                                          antisiero autoimmune chiamato
                                          anti-Sm
 Gli snRNAs sono necessari per lo splicing

I cinque snRNPs coinvolti nello splicing sono
   U1, U2, U5, U4, e U6.
Insieme ad altre proteine addizionali, gli
   snRNPs formano lo spliceosome. Tra esse:
   U2AF (U2 Auxillary Factors) e BBP
   (branch point Binding Proteins).
Le proteine agiscono in modo coordinato con
   la formazione di tre complessi intermedi
               Splicing steps
U1 snRNP inizia lo splicing legandosi allo 5
  splice mediante una reazione di
  appaiamento RNA-RNA.
Si forma il complesso E (early) che contiene
  U1 snRNP legato allo 5splice site, la
  proteina U2AF legata al tratto di pirimidine
  tra il branch site e allo 3splice site, e le SR
  proteine che collegano U1 snRNP a U2AF.
(Le SR si legano ai siti di splicing degli esoni:
  ESE =exonic splicing enhancer)
   complesso E: early presplicing
contiene U1 snRNP legato al 5’splice-site
U2AF legata a Py tract ed al 3’ splice-site
Questa recluta BBPche si lega al branch site.
Quindi tutti i siti sono riconosciuti
       Complesso A
U2 sostituisce BBP al
  branch site
L’appaiamento tra i due
  RNA spinge in fuori la
  A del Branch site, che
  diventa disponibile
  all’attacco
     Complesso B
• Il complesso A si
  riarrangia e si avvicinano i
  3 siti di splicing
• Questo avviene con
  l’ingresso della tripla
  U4/U5/U6
• Poi U6 sostituisce U1 al
  5’splice -site
      Complesso C
U4 viene rilasciato, così U2 e U6
    possono interagire con appaiamento
    degli RNA
Questa conformazione produce il sito
    attivo, che sembra essere composto
    principalmente da RNA.
 il 5’Splice site è avvicinato al branch
    site (U2-U6). U5 avvicina i siti 3’ e
    5’.
Il cappio e le SnRNP vengono
    rilasciati
E            RNA splicing
A   Passaggi dello spliceosoma
     Complesso E (early)
B    A: (Branch site)
     B1: (spliceosoma
      completo)
     B2: U1 è rilasciato e si ha
      un riarrangiamento
     C1: U4 è rilasciato ed
      inizia la catalisi
C
     C2: sito 3’ tagliato e gli
      esoni ligati
    • animazione
      Accoppiamento RNA-RNA
• Il sito al 5’ è riconosciuto prima da U1 e poi
  da U6.
• U6 e U2 indirizzano la catalisi.
introni Self-splicing di
gruppo II.
Rari introni di organelli.
Dimensione di 400-1000 nt
Lo splicing non necessita
della presenza di proteine
Il meccanismo è simile a
quello dello spliceosoma
introni Self-splicing di
gruppo I.
Rari introni di eucarioti,
rRNA o organelli.
Dimensione di 400-1000 nt
Una G si lega ad una tasca
ed attacca il 5’splicing site
Hanno una sequenza di
guida interna che si appaia
alla sequenza del sito al 5’.
Lo splicing non necessita
della presenza di proteine
 Splicing alternativo




Nel gene DSCAM di drosofila gli ipotetici mRNA
alternativi sono circa 38,000
           Errori di splicing
• Uno esone può
  essere saltato



• Si possono usare
  siti criptici
     Accuratezza dello splicing
• Il sitema di splicing è sulla CTD della RNA
  polimerasi ed interagisce sequenzialemente
  con l’RNA neosintetizzato
• Le proteine SR (ricche in Ser e Arg) si
  legano a sequenze esoniche dette Exonic
  splicing enhancer, ESE. Queste reclutano
  U2AF al 3’ ed U1 al 5’
Exon definition hypothesis
           Splicing alternativo
• La troponina dà luogo a due forme con due esoni
  diversi: o il 3 o il 4
• In genere le alternative possono essere costitutive
  o regolate
          Splicing alternativo
• Ci sono almeno 5 modi diversi di fare
  splicing alternativo
 Esempio di Splicing alternativo costitutivo




L’antigene T del virus della scimmia SV40 ha 2 5’ splicing site alternativi (5’SST e 5’sst).
5’sst da luogo a un trascritto più lungo con uno stop codon (t-antigen)
5’SST and un trascritto più corto e peptide più lungo (T-ag)
Il rapporto tra i due è regolato dai livelli delle proteina di splicing SF2/ASF
Esempio di Splicing alternativo regolato
                                           Repressori: intronic-
                                           exonic splicing silencers
                                           (ESS o ISS).
                                           Si legano a hnRNP
                                           (heterogenous nuclear
                                           ribonucleoproteins) e non
                                           hanno il dominio SR per il
                                           legame a U1 o U2AF.
                                           Bloccano i siti di enhancer
                                           Gli attivatori (ESE o ISE)
                                           riconoscono una sequenza
                                           specifica e col dominio RS
                                           reclutano i fattori di
                                           splicing
     hnRNPI è un inibitore dello splicing




Nasconde gli esoni con due meccanismi
• unendo le regioni fiancheggianti l’esone,
• coprendo cooperativamente l’esone.
Spliceosoma minore

Negli eucarioti superiori esiste
una forma più rara di
spliceosoma che ha siti di
riconoscimento diversi:
Spliceosoma AT-AC
(normale GT-AG)
Il meccanismo di base è
analogo, ma le proteine sono in
parte distinte
Spesso gli esoni
codificano domini
strutturali con
funzioni distinte.
(Es: DNA-binding
e dimerizzazione)
        Gli esoni: ruolo evolutivo
• Molti geni si sono evoluti
  duplicando egli esoni
• Esoni simili si possono trovare
  in proteine molto diverse
Esempio: enzimi che modificano la cromatina




Y= lievito, W= verme,
F= mosca, H= uomo
           RNA editing
Rappresenta un altro modo
 per modificare la sequenza
 di un mRNA
  – deamminazione sito-
    specifica (CU o A
    Inosina)
  – Inserzione o delezione di U
    diretta da RNA guida
           Esempio di deamminazione sito-specifica




Gene dell’apolipoproteina-B umana.
La deamminazione, introduce uno stop
codon, e quindi una proteina troncata
  Editing con inserzione di U, mediato da RNA guida


Forma trovata nel mitocondrio
di tripanosoma
Vengono aggiunte delle U,
modificando il frame di
lettura.
I RNA guida (gRNA) hanno
un’ancora di attacco al 5’, la
regione di editing ed un tratto
poli-U al 3’.
Meccanismo


Il gRNA si attacca con l’ancora
Induce la formazione di anse sul
mRNA da modificare
Taglio endonucleasico
Inserimenti di U da parte di uridil-
transferasi 3’ terminale (TUTasi)
Poi la Ligasi.
Il tratto PoliU potrebbe aumentare la
complementarietà dell’attacco.
Lo stesso gRNA può modificare siti
diversi
                        Il trasporto del mRNA

mRNA maturo (con capping, splicing, PoliA e proteine aggiunte)
viene rilasciato dal nucleo con un meccanismo regolato
Attrevarso il poro nucleare, che usa la GTPasi Ran.

								
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